Summary
Bu makalede, telomer uzunluğunun hızlı ve etkin bir şekilde doğrudan ölçülmesini sağlayan, modifiye edilmiş bir terminal kısıtlama fragmanı analizi kullanarak telomer uzunluğunun nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol tartışılmıştır. Bu teknik telomer uzunluğunu ölçmek için çeşitli DNA hücreleri kaynaklarına uygulanabilir.
Abstract
Telomer uzunluğunu ölçmek için her biri kendi avantajları ve dezavantajları olan çeşitli teknikler vardır. Geleneksel yaklaşım olan Telomere Restriction Fragment (TRF) analizi, genomik DNA örneklerinin restriksiyon enzimleri ile sindirilerek telomer DNA tekrarlarının ve bazı alt telomerik DNA'nın bırakıldığı bir DNA hibridizasyon tekniğini kullanmaktadır. Bunlar, agaroz jel elektroforezi ile ayrılır, bir filtre zarına aktarılır ve telomer kısıtlama fragmanlarını görselleştirmek için kimyasal parlaklık veya radyoaktivite ile etiketlenen oligonükleotit problarına melezleştirilir. Bu yaklaşım, PCR gibi diğer tekniklerden daha büyük miktarda DNA gerektirirken, bir hücre popülasyonunun telomer uzunluğu dağılımını ölçebilir ve mutlak kilobazda ifade edilen ölçüm sağlar. Bu el yazması, telomer uzunluğunu belirlemek için değiştirilmiş bir DNA hibridizasyon prosedürünü gösterir. Genomik DNA ilk önce sınır enzimleri ile sindirilir (kesilmezTelomerleri) ve agaroz jel elektroforezi ile ayrıldı. Jel daha sonra kurutulur ve DNA denatüre edilir ve yerinde bir radyo-etiketlenmiş oligonükleotid proba hibridize edilir . Bu yerinde hibridizasyon, telomer DNA'sının kaybolmasını önler ve sinyal yoğunluğunu geliştirir. Hibritlemeyi takiben jeller fosforlu elekler kullanılarak görüntülendi ve telomer uzunluğu bir grafik programı kullanılarak nicelleştirildi. Bu prosedür Drs laboratuarları tarafından geliştirildi. Texas Üniversitesi'nden Woodring Wright ve Jerry Shay, Güneybatı 1 , 2 . Burada, bazı değişiklikler yapılarak bu prosedürün ayrıntılı bir tarifi sunulmaktadır.
Introduction
Kromozomların uçlarında yer alan telomerler, hücresel genetik bilginin korunmasında kritik bir rol oynayan TTAGGG sekansının (insan kromozomları üzerinde) nükleotid tekrarlarıdır 3 , 4 , 5 . Telomerlerin uzunluğu birkaç bin baz çifttir ve DNA replikasyonu sırasında kromozomun geri kalanının bütünlüğünü korumaya yarar. Kromozomların replikasyonu kromozomun uçlarının tamamen kopyalanmamasına neden olarak mükemmel değildir. Çoğaltmada bu yetersizlik "son çoğaltma problemi" olarak adlandırılır ve her bir kopyalama yinelemesi sırasında telomer tekrarlarının bir kısmının kaybedilmesi ile sonuçlanır 6 , 7 . Telomerere uzunluğu, telomeraz 8 , 9'un yerini alan bir enzim olan hücre bölünmesinden sonra restore edilebilir. Telomeraz ise, ancakInsan somatik hücrelerinin çoğunda aktive olur ve sonuç olarak, zamanla telomer kısalır ve sonunda hücresel yaşlanmaya neden olur 10 . Telomer kısaltılmasına bağlı olarak, telomeres yaşlanmanın ve yaşla ilişkili hastalık riski taşıyan bir biyolojik belirteç olarak değerlendirilir 11,12. Ayrıca, telomer uzunluğu genetik, çevresel ve yaşam tarzı faktörleri ve oksidatif stres gibi diğer uyaranlardan etkilenebilir ve bu da telomer uzunluğunun toksikolojik, epidemiyolojik ve davranışsal araştırmalarda biyolojik belirteç olarak rol oynayabileceğini gösterir 13,14,15.
Bu makale, Mender ve Shay 2 ve Kimura ve diğerleri tarafından uyarlanmış bir modifiye terminal kısıtlama fragmanı (TRF) analizi kullanılarak telomer uzunluğunu ölçmek için bir teknik göstermektedir . 16 ve Herbert, Shay ve Wrig'e benzerHt 1 ve Haussmann ve Mauck 17 . Geleneksel olarak, TRF analizi bir Southern blot prosedürünü içerir. Güney lekeleri, telomer uzunluğunun incelenmesi için "altın standart" olarak kabul edilir ve epidemiyoloji çalışmalarında lökosit telomer uzunluğunu incelemek için aktif olarak kullanılırlar 18 . Bu TRF analizi telomer tekrarlarının arkasında bırakılmış sindirilmiş genomik DNA kullanır. DNA parçaları daha sonra jel elektroforezi ile ayrılır, denatüre edilir ve bir nitroselüloz zara aktarılır. Telomer dizileri bir telomer oligonükleotid probu ile hibridize edilmiştir. Ayrı telomerleri bir membrana aktarmak yerine, diğer TRF teknikleri, DNA'nın denatürasyonuna tabi tutulan ve içermeyen jel hibridizasyon teknikleri kullanmaktadır. Bazı türlerde bildirilen interstisyel telomerlerin saptanması için denatürasyonun dahil edilmesi önemlidir 19 . Denatüre edici aşamalardan yoksun prosedürler sadeceTek telli DNA terminal telomerlerde çıkıntı yapar ve interstisyel telomer dizilerine bağlanmaz 18 .
TRF analizinin yanı sıra telomer uzunluğunu ölçmek için kendi avantajları ve dezavantajları olan başka teknikler de vardır. Flow-FISH tekniği, akış sitometrisi 16 , 20 kullanarak ayrı bir hücre türünün tek tek hücrelerinin ortalama telomer uzunluğunu ölçebilir. Telomerleri son derece spesifik sondalarla doğru şekilde etiketleyebilir ve insan hatalarını otomasyon yoluyla azaltabilirken, Flow-FISH pahalı, daha az verimli ve yeni numuneler ve epidemiyoloji çalışmaları için yeteneğini kısıtlayan çok yetenekli bir teknisyen gerektirir 16 . Buna ek olarak, bu yöntem hücre popülasyonundaki kromozom sayısındaki potansiyel değişiklikleri hesaba katmaz. Bir başka teknik olan qPCR, epidemiyoloji çalışmaları için telomer uzunluğunu ölçme aracı olarak yaygın olarak kabul edilmektedir 21 .
TRF prosedürünün bazı çalışmalar için kullanımını sınırlayan kendi eksiklikleri bulunmaktadır. TRF teknikleri diğer yöntemlere kıyasla (örnek başına 2 ila 3 μg arasında) büyük miktarda DNA gerektirir. Bu, tekniğin, yeterli genomik DNA'nın toplanabileceği ve bozulmuş DNA numunelerinde kullanılamadığı klinik örneklerin telomer uzunluğunu incelemesine sınırlar. Ek olarak, TRF analizi maliyetli ve emek gerektirir, sonuç alınması için 4-5 gün gereklidir. Bununla birlikte, TRF düşük bir değişken katsayısı üretmektedirTekrarlanabilirliğine izin vererek. Bu protokol, geleneksel Southern blottan ( yerinde jel hibridizasyonunu kullanan ) farklı olsa da, iki teknik temelde aynıdır.
Burada sunulan teknik Southern blot ve jel içinde hibridizasyonun bir kombinasyonudur; Southern blot'taki DNA denatürasyon adımını in-jel hibridizasyonu ile ilişkilendirmek. Bu kombinasyon, Southern lekesine kıyasla geliştirilmiş prob sinyal gücü avantajına sahiptir ve laboratuvarımızda sürekli olarak nicelenebilir sonuçlar vermiştir. Ayrıca, kemilüminesan problar yerine radyoaktif sondaların kullanılması sinyal yoğunluğunu artırır ve TRF'nin analizlerini kullanıcı dostu hale getiren bir fosfor bulucu ile görselleştirme ve niceleme sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genomik DNA Ekstraksiyonu
- Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak analiz edilecek hücrelerden (burada, hücre çizgisi BJ-hTERT) genomik bir DNA özütleme yapın.
- Bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonunu ölçün. DNA konsantrasyonu 100 μg / mL'den az ise, DNA'yı etanol ile çökeltin ve bir DNA konsantrasyonunu sağlamak için, bir hacimde TE tampon (10 mM Tris-Cl; 0.1 mM EDTA (Etilen diaminetetraasetik Asit); pH 8.0) içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 100-600 ug / mL).
2. DNA Dürüstlük Değerlendirmesi
NOT: Protokolün bu kısmı, 11 cm x 14 cm'lik bir jel ile bir jel elektroforezi sistemi kullanarak DNA bütünlüğünün değerlendirilmesini özetlemektedir. Diğer sistemler ve jel boyutları da kullanılabilir, ancak gerilim ve DNA göç süresi değişebilir.
- 1 g elektroforez dereceli agarozun 100 mL 1x TAE tamponu (40 mM Tr) içerisinde birleştirilerek% 1 agaroz jeli hazırlanır-Baz olduğu; 20 mM asetik asit; 2 mM EDTA; PH 8.5) ve mikrodalga, agaroz çözülene ve çözelti berrak hale gelene kadar karıştırılır. Çözeltiyi oda sıcaklığında 50 ° C'ye ulaşana kadar soğutun (yaklaşık 15-20 dakika).
- Agaroz çözeltisi soğutulurken, döküm tepsisine döküm son kapıları ekleyerek jel döküm tepsisini hazırlayın. Agaroz sızıntısını önlemek için, dökme tepsisine yapıştırmadan önce uç kapakları 4 ° C'ye soğutun.
- Agaroz çözeltisi 50 ° C'ye soğutulduktan sonra 10 μL ethidium bromid (dH20'da 10 mg / mL) ilave edin ve agaroz çözeltisini jel döküm tepsisine dökün. Tarağı döküm tablasına ekleyin.
- Agaroz çözeltisinin, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca sertleşmesine izin verin.
- 9 μL son bir hacme 1x TE tampon kullanarak 25 ng genomik DNA seyreltilmesi ve 10 μl 10 μl Yükleme Boya 1 mcL (0.25% (w / v) bromofenol mavi,% 0.25 (w / v) ksilen ekleyin elektroforez için DNA örnekleri hazırlayın. Siyanol FF,% 30 (v / v) gliserol). İyice karıştırın.
- DNA göçünü, yaklaşık 2 saat boyunca 100 V'de veya bromofenol mavi boya jel boyunca yaklaşık yarısına kadar çalıştırın.
- Ultraviyole ışık transilluminator veya eşdeğer kullanarak jel Görüntü.
NOT: Dürüst bütün DNA numuneleri yüksek molekül ağırlıklı bantlara sahiptirler (yani kesilmiş veya kırılmış DNA'dan kaynaklanır). DNA bantları bulaşırsa, bütünlükleri düşüktür ve Southern blot analizi için uygun değildir ve DNA taze hücrelerle tekrar izole edilmelidir.
3. Genomik DNA Sindirimi
- Genomik DNA'nın sindirimini 20-40 μL'lik nihai bir hacimde uygulayın.
NOT: Büyük hacimler40 μL'den fazla olması agaroz jelin kuyularını taşar.- 3 μg genomik DNA'yı ve uygun miktardaki 10x DNA özüt tamponunu (kısıtlama enzimleri ile birlikte verilir) birleştirerek, son konsantrasyonu bir mikro tüp içinde 1x olacak şekilde birleştirin. Her tüpe 1 uL RsaI restriksiyon enzimi (10,000 U / mL) ve 1 μL HinfI restriksiyon enzimi (10,000 U / mL) ilave edin. Steril, deiyonize H 2 O kullanarak nihai hacmi ayarlayın. İyice karıştırın. Tüm bileşenlerin tüpün tabanında olduğundan emin olmak için kısa bir süre (10 - 15 s, 16.000 xg'de) santrifüjleyin.
- Sindirimleri 37 ° C'de ≥16 saat inkübe edin. Sindirimden sonra, sindirilmiş DNA'yı 4 ° C veya -20 ° C'de, gerekirse en fazla 2 gün süreyle saklayın.
4. Genomik DNA Jel Elektroforezi
NOT: Protokolün bu kısmı, 20 cm x 25 cm'lik bir jel elektroforez sisteminin kullanılması için bir prosedürü özetlemektedir. Farklı jel elektroPhoresis sistemleri kullanılabilir, ancak optimal sonuçlar elde etmek için voltaj, migrasyon süresi ve sisteme eklenen elektroforez tamponu miktarı da dahil olmak üzere çeşitli değişkenlerin değiştirilmesi gerekebilir.
- 2.25 g jel elektroforez dereceli agarozu ya 1x TAE veya 0.5x TBE (110 mM Tris bazı; 90 mM borik asit; 2.5 mM EDTA; pH 8.3) içeren 375 mL elektroforez tamponu ile birleştirerek% 0.6 agaroz çözeltisi hazırlayın.
NOT: 8,000 kB'den daha az telomer için 0,5x TBE önerilirken, 820 kB ile 20,000 kB 1 arasında telomer için 1x TAE önerilir. - Mikrodalgada çözelti, agaroz çözülene ve çözelti berraklaşıncaya kadar yıkayın. Çözeltinin oda sıcaklığında veya agaroz 50 ° C'ye ulaşıncaya kadar 15-20 dakika soğumasına izin verin.
- Agaroz çözeltisi soğutulurken, adım 2.2'de açıklandığı gibi jel dökümü için jel elektroforez sistemini hazırlayın. Agaroz jel çözeltisini jel döküm tepsisine dökün. Içine tarak yerleştirinJel. Jel oda sıcaklığında 45 dakika süreyle sertleştirilmesine izin verin.
- Sindirilmiş DNA örneklerini elektroforez için hazırlayın. 40 uL reaksiyon için, sindirilmiş DNA'nın her bir örneğine 0,4 μL 10 x yükleme boya ekleyin. Solüsyonun tüpün tabanında olduğundan emin olmak için kısaca santrifüjleyin (10-15 s, 16.000 xg).
- DNA migrasyonu için jel elektroforez sistemini hazırlayın. Jelden uç kapılar ve tarağı çıkarın. Jel elektroforez sistemini dolum hattına 1x TAE veya 0.5x TBE ile doldurun, böylece jelin tampon içine tamamen batırılması sağlanır.
- DNA numuneleri ile jel kuyuları, örnekler arasında boş bir kuyu olacak şekilde yükleyin. Kabarcıklara neden olmaktan veya jel delik açmaktan kaçının. Jelin zıt uçlarındaki oyuklara 10 uL'lik bir DNA merdiveni ekleyin.
NOT: DNA merdiveni tipi, kişiden kişiye ve hücre kaynakları arasında değişen telomerlerin uzunluğuna bağlı olacaktır. - Jel elektroforezini 1'de çalıştırınDNA'yı hızlıca jöre hareket ettirmek için 30 dakika boyunca 50 V; Sonra gerilimi 57 V'a ayarlayın ve 18-24 saat boyunca çalıştırın.
5. Jel Floresan Görüntüleme ve Hibridizasyon
- 18-24 saat sonra jel elektroforez güç kaynağını kapatın. Jel ile birlikte dökme tepsisini elektroforez tamponundan çıkarın. Jelin yönünü belirlemek için referans olarak işlev görmek için jelatin sağ üst köşesini ayırın.
- Jeti biraz daha büyük olacak şekilde kağıdı keserek bir parça filtre kağıdı hazırlayın. Filtre kağıdını jelin üzerine dökme tepsisine yerleştirin ve kağıdın jel üzerinde fazla çözeltiyi emdirmesine izin verin. Köpükleri yanlardan sıkacak şekilde bir pipet kullanarak bir filtre kağıdı ile jel arasındaki hava kabarcıklarını dikkatle kaldırın.
- Jel filtre kağıdını jelin altına gelecek şekilde ters çevirerek dökme tepsisinden jeli çıkarın. Jeli filtre kağıdıyla bir jel kurutucuya aktarın vePlastik ambalajlı jel. Plastik sargı ile jel arasındaki tüm hava kabarcıklarını bir pipet yardımıyla silin.
- Jeli 50 ° C'de 2 saat boyunca kurutun.
- Kurutulduktan sonra plastik sargıyı çıkarın ve jel ve filtre kağıdını 250 mL deiyonize su içeren (jel kaplayacak kadar) bir cam kaba aktarın. Filtre kağıdını dikkatlice çıkarın ve jel oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Jel ince, sağlam ve yırtılmadan işlenebilecek kadar kolay olacaktır.
- Deiyonize su 5x SSC çözüm (750 mM NaCl; 75 mM sodyum sitrat) hazırlayın.
- Jel bir naylon örgü üstüne koyun (12 inç x 12 inç). Naylon örgü ve jel birlikte rulo birlikte jel kendisiyle temas olmadığından emin olun. Örgüyü ve jelini bir hibridizasyon tüpüne yerleştirin ( örn. , 1.5 tüp çapında 12 tüp).
NOT: Düzgün sarıldığında, jel her iki taraftaki naylon örgü ile temas edecektir. - 100 mL 5x SSC ve 12 uL yeşil flüoresan nükleik asidi birleştirin.Cid leke ve hibridizasyon tüpüne yerleştirin. Çözümü ışığa karşı koruyun ve rotasyonlu bir hibridizasyon fırınında 42 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hibridizasyon tüpünden naylon mesh / jeli çıkarın, rulo açın ve düz 250 ml deiyonize su içeren bir cam kaba yerleştirin ve hafifçe naylon mesh kaldırın. Bir phosphorimager kullanarak jelin görüntüsünü alın. Floresan ayarlarını kullanın: 520 BP, 40 Blue ve 488 nm. Fotomultiplier tüpünü (PMT) 375'e, odak düzlemini +3 mm'ye ve hassasiyeti normal yapın. Görüntüyü bir dosyaya kaydedin.
6. Hibridizasyon
- Radyoaktif telomere probunu hazırlayın.
- Telomere sondanın 2 uL'sini (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2.5 uL 10x polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu, 3 uL γ 32 P-dATP (6,000 Ci / mmol), 4 uL T4 Polinükleotit kinaz ve DNaz içermeyen steril deiyonize suyun bir mikrattaki 20 uL'lik nihai hacmeSantrifüj tüpü.
Dikkat: Radyoaktivite kullanırken tesislerin radyoaktif güvenlik ve yönetmeliklerine uyun.
- Telomere sondanın 2 uL'sini (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2.5 uL 10x polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu, 3 uL γ 32 P-dATP (6,000 Ci / mmol), 4 uL T4 Polinükleotit kinaz ve DNaz içermeyen steril deiyonize suyun bir mikrattaki 20 uL'lik nihai hacmeSantrifüj tüpü.
- Kısaca santrifüjleyin (16,000 xg'de 10-30 s) ve 1 saat boyunca 37 ° C'de su banyosunda inkübe edin. 16,000 xg'de 10-30 s boyunca santrifüjleyin ve reaksiyonu durdurmak için 65 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Bir G-25 kromatografi mikroskop sütunu kullanarak, vorteksleme ile kolon içeriğini karıştırın, daha sonra oda sıcaklığında 700 xg'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Filtreden atın.
- Radyoaktif prob çözümünü G-25 kromatografi kolonuna yükleyin ve 700 x g'de 2 dakika santrifüjleyin. Süzüntüsünü ayırın.
NOT: Süzüntü, radyoaktif telomer probunu içerdiğinden dolayı muhafaza edin. Radyoaktif prob, gerekirse 4 ° C'de saklanabilir. - Steril deiyonize suda 1.5 M NaCl ve 0.5 M NaOH'den oluşan 250 ml denatüre edici çözelti hazırlayın.
- Jel 250 mL denatüre edici çözelti içeren bir cam kaba yerleştirin ve inkübe edin.Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yedi. Denatüre edici çözeltiyi çıkarın ve 250 mL steril deiyonize suyla değiştirin. Oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıda (40 - 50 rpm) 10 dakika inkübe edin.
- Steril deiyonize suda 1.5 NaCl ve 0.5 M Tris-hidroklorik asit, pH 8.0'dan oluşan 250 mL nötrleştirme çözeltisi hazırlayın.
- Deiyonize suyunu çıkarın ve 250 mL nötrleştirme çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Nötrleştirme solüsyonunda inkübasyon sırasında, 5x SSC, 5x Denhardt çözeltisi (% 0.1 iyonik olmayan sentetik polimer,% 0.1 polivinil pirolidin,% 0.1 sığır serumu albumin), 10 mM disodyum fosfat (Na2HPO 4 ) ve 1 mM sodyum pirofosfat tetrabazik dekahidrat (Na4P207.10H2O) steril deiyonize su içinde.
- Jeli naylon örgüye döndürün ve hibridizasyon tüpüne yerleştirin (basamak5.7). 20 mL hibridizasyon çözeltisi ilave edin ve döndürerek 10 dakika boyunca 42 ° C'de bir hibridizasyon fırınında inkübe edin.
- Hibridizasyon çözeltisini çıkarın ve 20 mL taze hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin. Telomer probun tamamını ekleyin ve döndürme ile gece boyunca 42 ° C'de bir hibridizasyon fırınında inkübe edin.
7. Jel Yıkama, Fosfor Ekran Üzerine Pozlama ve Radyo Görüntüleme
- Steril deiyonize suda 500 mL 2x SSC çözeltisi (300 mM NaCl; 30 mM sodyum sitrat) hazırlayın.
- Deiyonize suda 250 mL 0.1x SSC (15 mM NaCl; 1.5 mM sodyum sitrat) ve% 0.1 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) hazırlayın.
- Hibridizasyon tüpünden jel ve mesh çıkarın ve 250 mL 2x SSC içeren bir cam kaba yerleştirin. Açın ve naylon örgüyü çanaktan çıkarın. Cam yuvayı bir yuvarlak çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- 2x SSC'yi çıkarın ve 250 mL 0.1x SSC ve 0 ile değiştirin% 1 SDS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıda 15 dakika inkübe edin.
- Kuluçka sırasında, Fosfor ekranını 15 dakika boyunca görüntü silgisine maruz bırakın.
- 0.1x SSC ve% 0.1 SDS çözeltisini çıkarın ve 250 mL 2x SSC ile değiştirin. Yörünge bır çalkalayıcıda 15 dakika inkübe edin.
- 2x SSC solüsyondan jeli çıkarın ve ya jel plastik sargıyla sarın ya da ısıyla kapatılabilir bir kese yerleştirin. Jel ile plastik sargı veya plastik kese arasındaki tüm kabarcıkları ve hava ceplerini çıkarın. Jel Phopshor ekranlı bir maruz bırakma kasetine yerleştirin. Fosfor ekranını gece boyunca jelle maruz bırakın.
- Bir phosphorimager kullanarak maruz kalan Fosfor ekranını görüntüleyin.
8. Telomere Uzunluk Nicelemesi
- Yeşil flüoresan nükleik asit lekeli jelin flüoresan görüntüsünü içeren fosfosimager dosyasını açın ( Şekil 1 ).
- 'Araçlar' ve ardından 'Piksel Mesafesi'ni seçin9 ;. Fareyi kullanarak, jelin altından birinci işaret bandının ortasına kadar bir çizgi çizin ve mesafeyi kaydedin. Her işaretçi bandı için bu prosedürü tekrarlayın ( Şekil 2 ). Bu mesafeler, aşağıda açıklandığı gibi grafik programında kullanılacaktır.
- Radyoaktif olarak işaretlenmiş jelin fosfor görüntüsünü açın ( Şekil 3 ). 'Nesne Yöneticisi' ve ardından 'Izgara' seçin. Izgarayı 1 sütun ve 150 satır olarak ayarlayın. Izgarayı, jelatin tepesinden jelin altına kadar uzanacak şekilde ayarlayın. Izgaranın genişliğini, şeridin kenarına eşit olacak şekilde ayarlayın, ızgaranın kenarına tıklayın ve şeridin genişliğine eşit şekilde ızgaranın genişliğini sürükleyin.
- Bu ızgarayı kopyalayın (böylece, kutuların genişliği ve yüksekliği aynı kalır) ve ikinci ızgarayı boş bir şeritte (arka plan amaçlarıyla) hareket ettirin. İlave örnek şeritleri için ek ızgaraları kopyalamaya ve taşımaya devam edin.
NOT: İşiniz bittiğinde,Her örnek şerit için ızgaralar ve arka plan için boş bir şerit ızgarası ( Şekil 4 ). - 'Analiz' ve ardından 'Hacim Raporu' nu seçin Rapor için tüm kılavuzları seçin Birim raporu görüntülendikten sonra, tablo çizelgesini etkinleştirmek için raporda çift tıklayın E-tablo dosyasını kaydedin.Bu dosyanın verileri 'Hacim' şeridi altında.
- Uygun bir grafik programını açın ve yeni bir veri ve tablo oluşturun. 'Y: Her bir nokta için tek bir Y değeri girin ve yazın' ardından 'Oluştur'u seçin.
- İlk sütunu (Sütun X) 'Ölçülen Mesafe' olarak etiketleyin ve ikinci sütunu (Sütun Y) 'Moleküler Ağırlık' olarak etiketleyin. Her işaretleyici bandın işaretleyici moleküler ağırlıklarını Y sütununa girin. Adım 8.2'de elde edilen ve her moleküler ağırlık işaretine karşılık gelen taşıma mesafelerini girin.
- 'Analiz'e gidin ve' Analiz et 've ardından' doğrusal olmayan regresyonu seçinOn (eğri sığdır) 've' Tamam 'ı seçin. Bir sonraki ekranda 'Üstel' ve ardından 'Bir faz bozunumu' seçin. 'Aralık' sekmesini seçin ve 'eğriyi tanımlayan noktaların sayısına' 150 yazın ve eğrisi başka bir programa dışa aktarmak veya kopyalamak için 'XY koordinatları tablosu oluştur'u işaretleyin.
NOT: 'Verilerin 1 doğrusal olmayan uyumu' sonucu, Y satırındaki her mesafe için molekül ağırlığını içerir. - Örnek şeritleri analiz etmek için, gerçek telomer bandlarının üstünde ve altında bir analiz alanı seçin. Şeridin tüm uzunluğunu kullanmayın ( Şekil 5 ). Her şeridin analiz alanı için ızgara konumlarını belirleyin.
- 'Dosya', 'Yeni' 'Yeni Tablo ve Grafik Oluştur'u seçin. 'Y: Her bir nokta için tek bir Y değeri girin ve yazın' ardından 'Oluştur'u seçin. Arka plan şerit hacmi değerlerini (yoğunluk değerleri) elektronik tablo dosyasından kopyalayıp yapıştırabilirsiniz(X) ve hacim değerlerini (yoğunluk değerleri) içine yerleştirin. Birden fazla örnek hattı varsa, her bir birim değer kümesini elektronik tablo dosyasından grafik programında ek Y sütunlarına kopyalayın. dosya.
- 8.8. Adımda belirlenen analiz alanlarının dışındaki arka plan sütunundan (X) ve her örnek şeritten (Y) değerleri silin.
NOT: Veri tablosu yalnızca analiz alanlarına karşılık gelen ızgara konumlarındaki değerleri içermelidir. - Analiz'i seçin, daha sonra 'Analiz et' ve 'dönüşümü' seçin. 'Tamam'ı tıklayın. 'Y değerleri Y = YX kullanarak dönüştür' seçeneğini seçin. Bu, Veri 2'deki verileri dönüştürür (dönüştürülmüş yoğunluk değeri (Y) = örnek yoğunluğu (Y) - arka plan yoğunluğu (X)).
- Analiz'i seçin, daha sonra 'Çözümle', 'Sütun Analizi' ve 'Sütun istatistikleri' seçin. Tamam'ı seçin. Sonuçlar sekmesi 'Col. Verilerin Dönüşümü İstatistikleri 2 'gösterileri'Toplam' satırının altına, Σ (Int i ).
- 'Dosya', 'Yeni', 'Yeni Tablo ve Grafik Oluştur'u seçin. 'Y: Her bir nokta için tek bir Y değeri girin ve yazın' ardından 'Oluştur'u seçin. Y sütun verilerini, 'Verilerin Nonlin fit'ine 1, Eğri' sonuç sayfasından yeni X sütununa kopyalayıp yapıştırın. Y sütunu verilerini 'Transform of Data 2' sonuç sayfasından yeni Y sütununa kopyalayıp yapıştırın. Önce Analiz'i ve ardından 'Analiz Et' ve 'Dönüştür' seçeneğini seçin. 'Tamam'ı tıklayın. 'Y değerlerini Y = Y / X kullanarak dönüştür' seçeneğini seçin.
- Analiz'i seçin, daha sonra 'Çözümle', 'Sütun Analizi' ve 'Sütun istatistikleri' seçin. Tamam'ı seçin. Sonuçlar sekmesi 'Col. Verilerin Dönüşümü İstatistikleri 3 'Sum' satırının altında, Σ (Int i / MW i ) gösterir. MW = molekül ağırlığı.
- Her bir numunenin ortalama telomer uzunluğunu (TL) hesaplamak için,TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) formülü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BJ-hTERT hücre dizisinden (telomeraz ölümsüzleştirilmiş insan sünnet derisi fibroblastları) 22 ve insan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole edilen üç DNA konsantrasyonu (1, 2 ve 3 μg) telomer uzunluğu açısından analiz edildi. Tablo 1 , her DNA örneği için şerit atamalarını göstermektedir. Şekil 1 , jelin bir nükleik asit flüoresan lekesini göstermektedir. Moleküler ağırlık standartları açıkça görülebilir. Jelin tepesinden molekül ağırlığının her birine olan uzaklığı belirlendi ( Şekil 2 ). Şekil 3 , telomer probu ile hibridleşmeyi takiben jelin fosfor görüntüsünü göstermektedir. Telomer bantları her şeritte smear olarak gösterilir. Her şerit artı bir arka plan şeridine 150 kutu ızgaralar hesaplandı ( Şekil 4 ). Bölgelere karşılık gelen analiz alanlarıHer numune seti için telomer bantları içeren jel Şekil 5'de gösterilmektedir. Arka plan şiddetlerinin her örnek seti için benzer olmasını sağlamak için her numune seti için ayrı arka plan şeritleri seçildi (şeritler Şekil 5'de B olarak işaretlendi). Tablo 2 , her numunenin telomer kısıtlama fragmanı uzunluklarını göstermektedir. HTERT ölümsüzleştirilmiş hücre hattındaki (BJ-hTERT) ortalama telomer uzunluğu, insan PBMC'lerinde görülenden daha yüksektir ( Şekil 3'deki şerit 2, 4 ve 6 ile şeritler 10, 12 ve 14'ü karşılaştırınız). Bu sonuçlar ayrıca, her şeritte analiz edilen genomik DNA miktarının melezleşmeyi takiben tespit edilebilir bir sinyal elde etmek için kritik olduğunu göstermektedir. Oldukça üniform olan ( yani , BJ-hTERT hücre hattı) telomerleri olan numuneler için bu prosedürü kullanarak tespit edilebilir (sinyal çok bayat olmasına rağmen). Bununla birlikte, sahip olduğu telomerleri olan örneklerdeDaha büyük varyans ( yani , insan PBMC'leri) için, güvenilir bir sinyal sağlayan minimum DNA miktarı 2 μg'dır.
Şekil 1 : Yeşil Floresan Nükleik Asit Boyalı Jel. Kurutulan agaroz jelinin fosfor görüntüsü, DNA merdiven bantlarının yerini gösteren (yandaki 1 ve 8) yeşil flüoresan nükleik asit lekesi ile lekelenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : İşaretleyici Bant Geçiş Mesafesinin Belirlenmesi . Mavi oklar, jelin tepesinden ea'ya ölçülen mesafeyi göstermektedirCh DNA merdiven bandı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Telomere Prob ile Taranan DNA Örneklerinin Fosfor Görüntüsü. Şerit 2, 4 ve 6 BJ-hTERT DNA'yı (sırasıyla 1, 2 ve 3 ug) içerir. Şerit 10, 12 ve 14, insan PBMC DNA'sını (sırasıyla 1, 2 ve 3 ug) içerir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Izgara Yerleri. Konumunu gösteren ekran görüntüsüAnaliz edilen her şerit için 150 sayaç ızgaraları. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Analiz Alanları. Her numune seti için seçilen analiz alanlarını gösteren telomer bantlarının fosfor görüntüsü. Şerit 2, 4 ve 6 BJ-hTERT DNA'yı içerir; Şerit 10, 12 ve 14, insan PBMC DNA'sı içerir. B = arka plan şeritleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Lane | Numune |
| 1 | DNA merdiveni |
| 2 | BJ-hTERT 1 &181. g |
| 3 | Boş |
| 4 | BJ-hTERT 2 μg |
| 5 | Boş |
| 6 | BJ-hTERT 3μg |
| 7 | Boş |
| 8 | DNA merdiveni |
| 9 | Boş |
| 10 | PBMCs 1μg |
| 11 | Boş |
| 12 | PBMCs 2μg |
| 13 | Boş |
| 14 | PBMCs 3μg |
| DNA Numuneleri,% 0.6 agaroz jeli |
Tablo 1: DNA Agaroz Örneği Atamaları.
| Örnek (Şerit) | & #8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | Ortalama Telomer Uzunluğu = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1gr (1) | 268691 | 20596 | 13.04578559 |
| BJTert 2gul (2) | 1357000 | 103204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416337 | -142585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286653 | 62845 | 4,561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524123 | 3,586944286 |
Tablo 2: Ortalama Telomere Uzunluk Hesaplamaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroforezden sonra genomik DNA smear 800 bp'den daha yüksektir. Bu, kısıtlama enzimleri hatalıysa veya (yukarıda tarif edildiği gibi) ilave enzimlere ihtiyaç duyulması halinde oluşabilir. İkinci olası açıklama, proteinin DNA'ya halen bağlı olmasıdır. DNA konsantrasyonunu spektrofotometre ile belirlerken, 260/280 oranı 1.8 civarında olmalıdır. Bu oran <1.5 ise, kısıtlama enzim sindirimine müdahale edebilen protein kontaminasyonu oluşur. Ya DNA örneğinin yeniden izole edilmesi gerekecektir, ya da protein bir proteinaz K sindirimi ve fenol: kloroform ekstraksiyonu, ardından etanol çökeltmesi ile çıkarılmaya ihtiyaç duyulacaktır. Ticari bir DNA izolasyon kiti kullanılması randımanlı olarak 1.8-1.85 oranında 260/280 oranında DNA'ya neden olur.
Jelin bir fosfor eleği üzerine maruz kaldıktan sonra, telomer parçaları bulunmamıştır. Bu, radyo işaretli zayıf bir telomer probundan, yanlış melezleşmeden kaynaklanabilir.Koşulları veya yetersiz miktarda başlangıç genomik DNA'sı. Telomere sondasını hazırlarken, G-25 kolonunun santrifüjünün sonunda, akış yolunda (radyo etiketli telomere sondayı temsil eden) kolayca tespit edilebilir radyoaktivite olmalıdır. Radyoaktivite saptanmazsa, probun hazırlanmasıyla ilgili bir sorun oluştu. Hibridizasyon sıcaklığının 42 ° C'yi (probun erimesini önlemek için: şablon kompleksi) geçmemesini ve hibridizasyon tamponunun jelin tamamen jelleştirici bölüme daldırılmasını sağlamanız da önemlidir. Tespit edilebilir telomer sağlayan minimum genomik DNA miktarı 2.0-3.0 μg'dır. Daha az miktarda başlangıç materyali, hibridizasyon sonrasında çok zayıf sinyalden sinyal gelmeye neden olabilir.
Bu protokol her telomer uzunluğu belirlenmesi için 2-3 μg gerektirir. Numuneler çift veya üçlü olarak çalıştırılırsa 6-12 μg DNA gereklidir. Bu, Sınırlı DNA miktarı olan numunelerde kullanılan prosedürdür. İşlemin tamamlanması 3-4 gün gerektiren oldukça zahmetlidir. Bir seferde analiz edilen numune sayısı, jel elektroforez aletleri sayısı ve agaroz jel tarağı boyutu ile sınırlıdır. Sonuç olarak, çok sayıda numuneyi kullanan çalışmalar (epidemiyolojik çalışmalar gibi) için ideal değildir.
Jel elektroforeziyle ayrılmış telomerlerin DNA hibridizasyon teknikleri, telomer uzunluğunun belirlenmesinde altın standart olarak kalır. Gerçek telomer boyutlarıyla sonuçlanan telomer uzunluğunu doğrudan ölçen başka bir prosedür yoktur.
Bu prosedürde birkaç kritik adım vardır. Birincisi, DNA örneği iyi bütünlük sağlamalıdır, yani kesilmez olmalıdır. Makaslanmış DNA yanlış telomer uzunluğu sonuçlarına neden olabilir. DNA sindirimlerinin tamamlanması da önemlidir. Genomik DNA'nın sindirimi, 800 bp veya daha düşük bir DNA smearuyla sonuçlanmalıdır"Xref"> 2. Uygun sindirim sağlamak için, bazı prosedürler toplam 6 kısıtlama enzimi (bu prosedürde açıklandığı üzere sadece RsaI ve Hinf1'den ziyade) tarif etmiştir. İlave kısıtlama enzimleri HhaI, MspI, HaeIII ve AluI2'yi içerir. İkinci bir kritik adım, agaroz jelinin, sindirilmiş DNA'nın uygun şekilde ayrılması için yeterince uzun süre çalışmasına izin vermektir. Daha iyi ayrılma varsa, analizlerde daha iyi bir hassasiyet vardır. Jel çalışma süresi, 1 Kbp'yi temsil eden DNA parçalarının jelin tabanında bulunması için yeterince uzun olmalıdır ( Şekil 1 ). Jel boyutuna ve elektroforez voltajına bağlı olarak, bu 12 ila 24 saat sürebilir. Üçüncü önemli adım, hibridizasyon. Tüp yatay olduğu zaman tüm jelin batırılması için hazne tüpünde yeterli hibridizasyon tamponu olmalıdır. Hibridizasyon tamponunun yetersiz seviyeleri, telomere probun eşit olmayan melezleşmesine neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar kısmen Pittsburgh Kanser Enstitüsü Biyobehavioral Onkoloji paylaşılan tesisin P30CA047904 ödülünün desteğiyle desteklenmesini onaylıyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M.
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W.
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M.
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
