Summary
במאמר זה, פרוטוקול מפורט לכימות אורך הטלומרים באמצעות ניתוח מסוף שונה מגבלה ניתוח נדון המספק מדידה ישירה ויעילה ישירה של אורך הטלומרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מקורות התא של DNA עבור כימות אורך הטלומרים.
Abstract
ישנן מספר טכניקות שונות למדידת אורך הטלומרים, כל אחד עם היתרונות והחסרונות שלהם. הגישה המסורתית, ניתוח הגבלת Telomere (TRF), משתמשת בטכניקת הכלאה של דנ"א לפיה דגימות DNA גנומיות מתעכלות עם אנזימי הגבלה, ומשאירות מאחור את ה- DNA של הטלומרים וחוזרת ל- DNA תת-טלומרי. אלה מופרדים על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל, הועברו קרום סינון הכלאה בדיקות oligonucleotide שתייגת עם או chemiluminescence או רדיואקטיביות לדמיין שברי הגבלת הטלומרים. גישה זו, תוך צורך כמות גדולה יותר של DNA מאשר טכניקות אחרות כגון PCR, יכול למדוד את התפלגות אורך הטלומרים של אוכלוסייה של תאים ומאפשר מדידה לידי ביטוי קילובזות מוחלטות. כתב יד זה מדגים תהליך הכלאה DNA שונה לקביעת אורך הטלומרים. הדנ"א הגנומי מעוכל לראשונה עם אנזימי הגבלה (שאינם חותכיםטלומרים) ומופרדים על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל. הג'ל מיובש ואז DNA הוא denatured ו הכלאה באתרם כדי בדיקה oligonucleotide radiolabeled. זה הכלאה באתרה נמנע אובדן של הטלומרים DNA ומשפר את עוצמת האות. בעקבות הכלאה, ג 'לים הם צילמו ניצול מסכי זרחן אורך הטלומרים הוא לכמת באמצעות תוכנית גרפים. הליך זה פותח על ידי מעבדות של ד"ר. וודרינג רייט וג 'רי שי באוניברסיטת טקסס דרום מערב 1 , 2 . כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של הליך זה, עם כמה שינויים.
Introduction
Telomeres, הממוקם בקצה של כרומוזומים, הם חוזרים על נוקליאוטידים של רצף TTAGGG (על כרומוזומים אנושיים) אשר ממלאים תפקיד קריטי בהגנה על מידע גנטי סלולרי 3 , 4 , 5 . Telomeres כמה אלפי זוגות בסיס באורך לשמש להגנה על שלמות שאר הכרומוזום במהלך שכפול ה- DNA. שכפול של כרומוזומים אינו מושלם וכתוצאה מכך הקצוות של הכרומוזום לא מועתקים לחלוטין. חוסר יעילות זה בשכפול נקרא "בעיית שכפול הסיום" ומביא לאובדן של חלק חוזר הטלומרים במהלך כל סיבוב של שכפול 6 , 7 . אורך הטלומרים ניתן לשחזר לאחר חלוקת התא על ידי telomerase, אנזים המחליף את רצף הטלומרים לאיבוד 8 , 9 . Telomerase, לעומת זאת, לאהמופעלים ברוב התאים הסומטיים האנושיים וכתוצאה מכך, לאורך זמן, הטלומרים יתקצרו, ובסופו של דבר יוביל לזרימה התאית 10 . בשל קיצור הטלומרים, טלומרים נחשבים ביומרקר של הזדקנות הסיכון למחלות הקשורות לגיל 11 , 12 . בנוסף, אורך הטלומרים יכול להיות מושפע מגורמים גנטיים, סביבתיים וסגנון חיים וגירויים אחרים כגון מתח חמצוני, דבר המעיד על כך שאורך הטלומרים יכול למלא תפקיד כסימן ביולוגי במחקרים טוקסיקולוגיים, אפידמיולוגיים והתנהגותיים 13 , 14 , 15 .
מאמר זה מדגים טכניקה למדידת אורך הטלומרים באמצעות שינוי מגבלה מסוף שונה (TRF) ניתוח מותאם מ Mender ו שי 2 ו Kimura et al. 16 , ודומה להרברט, שי וריגHt 1 ו האוסמן ו Mauck 17 . באופן מסורתי, ניתוח TRF כרוך הליך דרום כתם. כתמי הדרום נחשבים ל"סטנדרט הזהב "ללימוד אורך הטלומרים ומשמשים באופן פעיל לבדיקת אורך הטלומרים של הלייקוציטים במחקרים באפידמיולוגיה 18 . זה ניתוח TRF משתמש בדנ"א גנומי מתעכל משאיר מאחור את החזרות הטלומרים. שברי ה- DNA מופרדים אז על ידי ג'ל אלקטרופורזה, מפוגל ומועבר קרום nitrocellulose. רצפים הטלומרים הם הכלאה כדי בדיקה oligonucleotide הטלומרים. במקום להעביר את הטלומרים מופרדים קרום, טכניקות אחרות TRF להשתמש בטכניקות הכלאה ג'ל עם וללא denaturation של ה- DNA. הכללת denaturation חשוב כאשר שוקלים זיהוי של טלומרים interstitial, אשר דווחו במינים מסוימים 19 . נהלים ללא צעדים denaturing רק לזהות thE חד גדילי דנ"א נטוש ב Telomeres סופני ולא יחברו interstitial הטלומרים sequences 18 .
מלבד ניתוח TRF, ישנן מספר טכניקות אחרות למדידת אורך הטלומרים שלכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. טכניקת זרימה- FISH יכול למדוד אורך הטלומרים הממוצע של תאים בודדים של סוג תא ייחודי באמצעות cytometry זרימה 16 , 20 . למרות שהוא יכול לתג את הטלומרים במדויק עם בדיקות ספציפיות מאוד ולהפחית את השגיאה האנושית באמצעות אוטומציה, Flow-Fish הוא יקר, פחות יעיל דורש דגימות טריות טכנאי מיומן מאוד, הגבלת יכולתו ללימודי אפידמיולוגיה 16 . בנוסף, שיטה זו אינה אחראית לשינויים אפשריים במספר הכרומוזומים באוכלוסיית התאים. טכניקה נוספת, qPCR, מקובלת באופן נרחב כאמצעי למדידת אורך הטלומרים למחקרים אפידמיולוגיים 21 .
הליך TRF יש ליקויים משלה כי להגביל את השימוש שלה עבור כמה מחקרים. טכניקות TRF דורשות כמות גדולה של DNA בהשוואה לשיטות אחרות (בין 2 ל -3 מיקרוגרם לכל מדגם). זה מגביל את היישומים של הטכניקה לבדיקת אורך הטלומרים של דגימות קליניות שעבורן ניתן לאסוף דנ"א גנומי מספיק, ואי אפשר להשתמש בהן על דגימות DNA נמוכות. בנוסף, ניתוח TRF הוא יקר ועבודה אינטנסיבית, הדורש 4-5 ימים כדי להניב תוצאות. עם זאת, TRF מניב מקדם נמוך של שונותמתן reproducibility שלה. בעוד פרוטוקול זה שונה מאשר הכתם הדרומי המסורתי (תוך ניצול הכלאה ג'ל באתרה ), שתי טכניקות ביסודו זהה.
הטכניקה המוצגת כאן היא שילוב של כתם דרום הכלאה ג'ל; שיוך שלב denaturing DNA מ כתמי דרום עם הכלאה ב-ג'ל. שילוב זה יש את היתרון הנוסף של שיפור כוח האות בדיקה לעומת הכתם הדרומי יש הניבה באופן עקבי תוצאות לכימות בתוך המעבדה שלנו. בנוסף, השימוש בדיקות רדיואקטיביות ולא בדיקות chemiluminescent התשואות עוצמת האות גבוהה יותר מאפשר הדמיה וכימות עם phosphorimager, מה שהופך את הניתוחים של TRF ידידותי למשתמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גנומי DNA לחלץ
- לבצע מיצוי דנ"א גנומי מן התאים (כאן, קו התא BJ-hTERT) כדי להיות מנותח באמצעות ערכת מיצוי דנ"א מסחרי, על פי הוראות היצרן.
- למדוד את ריכוז ה- DNA עם ספקטרופוטומטר. אם ריכוז ה- DNA הוא פחות מ -100 מיקרוגרם / מ"ל, להאיץ את ה- DNA עם אתנול ו resuspend בנפח של TE חיץ (10 מ"מ טריס-קל, 0.1 מ"מ EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic), pH 8.0), כדי להבטיח ריכוז DNA של 100-600 מיקרוגרם / מ"ל).
2. הערכת ה- DNA שלמות
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר הערכה שלמות DNA באמצעות מערכת ג'ל אלקטרופורזה עם ג'ל 11 ס"מ x 14 ס"מ. מערכות אחרות וגדלים ג 'ל ניתן להשתמש גם, אבל המתח והזמן הגירה DNA עשוי להשתנות.
- הכן 1% agarose ג'ל על ידי שילוב של 1 גרם של agarose בכיתה אלקטרופורזה ב 100 מ"ל של חיץ TAE 1x (40 mM Trבסיס; 20 מ"מ חומצה אצטית; 2 מ"מ EDTA; PH 8.5) ו מיקרוגל עד agarose הוא מומס ואת הפתרון ברור. מגניב הפתרון בטמפרטורת החדר עד שהוא מגיע 50 מעלות צלזיוס (כ 15 - 20 דקות).
- בעוד פתרון agarose הוא קירור, להכין מגש הליהוק ג'ל ידי הוספת הליהוק בסוף השערים למגש הליהוק. כדי למנוע דליפה agarose, לצנן את השערים בסוף עד 4 מעלות צלזיוס לפני הצמדת למגש הליהוק.
- לאחר פתרון agarose התקרר ל 50 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 μL של ethidium bromide (10 מ"ג / מ"ל ב DH 2 O) ויוצקים את הפתרון agarose לתוך מגש הליהוק ג'ל. הוסף את המסרק למגש הליהוק.
- אפשר פתרון agarose להקשות במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכנת דגימות DNA עבור אלקטרופורזה על ידי דילול 25 ng של דנ"א גנומי באמצעות חיץ 1x TE לנפח סופי של 9 μL ולהוסיף 1 μL של 10x Loading Dye (0.25% (w / v) כחול bromophenol, 0.25% (w / v) xylene Cyanol FF, 30% (v / v) גליצרול). לערבב היטב.
- הפעל את הגירה דנ"א ב 100 V בערך 2 שעות או עד צבע bromophenol כחול הוא כחצי הדרך דרך הג'ל.
- תמונה ג'ל באמצעות transilluminator אור אולטרה סגול או שווה ערך.
הערה: דגימות DNA עם יושר טוב יש להקות משקל מולקולרי גבוה ללא מריחה (כי בשל דנ"א שבור או שבור). אם להקות ה- DNA מרוחות, יש להן שלמות נמוכה ואינן מתאימות לניתוח כתמי דרום, ויש לבודד מחדש את הדנ"א בתאים טריים.
3. גנומי DNA העיכול
- בצע את העיכול של ה- DNA הגנומי בנפח סופי של μL 20-40.
הערה: כרכים גדולים יותרמ 40 μL יהיה על גדות הבארות של ג'ל agarose.- שלב 3 מיקרוגרם של DNA גנומי ואת הכמות המתאימה של חיץ digest 10x DNA (מסופק עם אנזימים הגבלה) כך הריכוז הסופי הוא 1x, microtube. הוסף 1 μL של אנזים RSAI הגבלה (10,000 U / mL) ו 1 μL של אנזים הגבלת HinfI (10,000 U / mL) לכל צינור. התאם את עוצמת הקול הסופי באמצעות סטרילי, deionized H 2 O. מערבבים היטב. צנטריפוגה בקצרה (10 - 15 s ב 16,000 xg) כדי להבטיח כי כל הרכיבים נמצאים בתחתית הצינור.
- דגירה העיכול על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר העיכול, לאחסן את ה- DNA מתעכל ב 4 מעלות צלזיוס או -20 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 ימים אם יש צורך 17 .
4. גנומי דנ"א ג'ל אלקטרופורזה
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר הליך לשימוש 20 ס"מ x 25 ס"מ ג'ל אלקטרופורזה המערכת. ג'ל שונהניתן להשתמש במערכות phoresis, אך ייתכן שיהיה צורך לשנות מספר משתנים, כולל מתח, זמן הגירה וכמות החיץ האלקטרופורזה שנוספה למערכת על מנת להניב תוצאות אופטימליות.
- הכן פתרון agarose 0.6% על ידי שילוב של 2.25 גרם של agelose כיתה אלקטרופורזה ג'ל עם 375 מ"ל של חיץ אלקטרופורזה, או 1x TAE או 0.5x TBE (110 מ"מ בסיס טריס, 90 מ"מ חומצת בור, 2.5 מ"מ EDTA, pH 8.3).
הערה: עבור טלומרים פחות מ 8,000 kB, מומלץ 0.5x TBE ואילו 1X TAE מומלץ טלומרים בין 8,000 kB ו 20,000 KB 1 . - מיקרוגל הפתרון עד agarose יש מומס הפתרון הוא ברור. אפשר פתרון לצנן במשך 15 - 20 דקות בטמפרטורת החדר או עד agarose מגיע 50 מעלות צלזיוס.
- בעוד הפתרון agarose הוא קירור, להכין את מערכת ג 'ל אלקטרופורזה עבור הליהוק ג' ל כמתואר בשלב 2.2. יוצקים את הפתרון ג'ל agarose לתוך מגש הליהוק ג'ל. הכנס מסרק לתוךהג'ל. אפשר ג 'ל להקשות במשך 45 דקות חשף בטמפרטורת החדר.
- הכן את דגימות DNA מתעכל עבור אלקטרופורזה. במשך 40 תגובה UL, להוסיף 0.4 μL של צבע 10x טוען לתוך כל דגימה של DNA מתעכל. צנטריפוגה בקצרה (10-15 s, 16,000 xg) כדי להבטיח כי כל הפתרון הוא בתחתית הצינור.
- הכן את מערכת ג 'ל אלקטרופורזה עבור הגירה דנ"א. הסר את השערים סוף מסרק מן הג'ל. ממלאים את מערכת אלקטרופורזה ג'ל עם 1x TAE או 0.5x TBE לקו המילוי, כדי להבטיח כי ג'ל הוא שקוע לחלוטין במאגר.
- טען את הבארות של הג'ל עם דגימות DNA כגון שיש גם ריק בין דגימות. הימנע גורם בועות או לנקב את הג'ל. הוסף 10 μL של סולם ה- DNA לתוך בארות על הקצוות הנגדיים של הג'ל.
הערה: סוג של סולם DNA יהיה תלוי באורך של הטלומרים, אשר ישתנה מאדם לאדם ובין מקורות התא. - הפעל את ג'ל אלקטרופורזה ב 150 V למשך 30 דקות כדי להעביר במהירות את ה- DNA לתוך הג'ל; ואז להתאים את המתח ל 57 V ולהפעיל במשך 18-24 שעות.
5. ג'ל פלואורסצנטי הדמיה והכלאה
- לאחר 18-24 שעות, לכבות את מקור הכוח ג'ל אלקטרופורזה. הסר את מגש הליהוק ג'ל עם חיץ מן המאגר אלקטרופורזה. פורסים את הפינה הימנית העליונה של הג'ל לשמש התייחסות לכיוון של הג'ל.
- הכינו פיסת נייר סינון על ידי חיתוך הנייר להיות בגודל מעט גדול יותר מאשר ג 'ל. מניחים את נייר הסינון על גבי הג'ל במגש הליהוק ומאפשרים לנייר לספוג פתרון עודף על הג'ל. בזהירות להסיר את בועות אוויר בין נייר הסינון ואת ג'ל באמצעות פיפטה כמו רולר לסחוט את הבועות החוצה דרך הצדדים.
- הסר את הג'ל ממגש הליהוק על ידי מרפרף את הג'ל ומסנן נייר מעל כך הנייר מתחת לג'ל. מעבירים את הג'ל עם נייר הסינון למייבש ג'ל ומכסים אתג'ל עם עטיפת פלסטיק. הסר את כל בועות אוויר בין העטיפה פלסטיק ג'ל באמצעות פיפטה כמו רולר.
- יבש את הג'ל עבור 2 שעות ב 50 מעלות צלזיוס.
- לאחר יבשים, להסיר את העטיפה פלסטיק ולהעביר את הג'ל ומסנן נייר על צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של מים deionized (מספיק כדי לכסות את הג'ל). בזהירות להסיר את נייר הסינון דגירה ג 'ל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הג'ל יהיה דק, יציב וקל לתמרן מבלי לקרוע.
- הכן פתרון 5x SSC (750 מ"מ NaCl, 75 מ"מ ציטראט ציטראט) במים deionized.
- הניחו את הג'ל על גבי רשת ניילון (12 x 12 אינץ '). רול את רשת ניילון וג 'ל יחד לוודא כי הג' ל הוא לא במגע עם עצמו. מניחים את הרשת ואת ג'ל לתוך צינור הכלאה ( למשל , 12 ב צינור עם 1.5 בקוטר).
הערה: כאשר מגולגל כראוי, הג 'ל יהיה במגע עם רשת ניילון משני הצדדים. - שלב 100 מ"ל של 5x SSC ו 12 μL של גרעיני פלואורסצנטי ירוקCid כתם, ואת המקום לתוך צינור הכלאה. הגן על הפתרון מן האור ו דגירה במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה עם סיבוב.
- הסר את רשת ניילון / ג'ל מן צינור הכלאה, לפתוח ולשים שטוח לתוך צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של מים deionized, בעדינות להסיר רשת ניילון. תמונה ג'ל באמצעות phosphorimager. השתמש בהגדרות פלורסנט: 520 BP, 40 כחול ו 488 ננומטר. הגדרת הצינור מכפיל (PMT) ל 375, את המטוס המוקד ל -3 מ"מ ואת הרגישות לנורמה. שמור את התמונה לקובץ.
6. הכלאה
- הכן את בדיקה רדיואקטיבית טלומר.
- שלב 2 μL (2 ng) של בדיקה הטלומרים (5- (CCC ת"א) 4 3 '), 2.5 μL של חיץ תגובה polynucleotide kinase 10x, 3 μL של γ 32 P-DATP (6,000 Ci / mmol), 4 μL של T4 Polinucleotide kinase ו DNase חינם, מים סטריליים deionized לנפח הסופי של 20 μL ב micrצינור ocentrifuge.
זהירות: בצע בטיחות "רדיואקטיבי של מתקני ותקנות בעת שימוש ברדיואקטיביות.
- שלב 2 μL (2 ng) של בדיקה הטלומרים (5- (CCC ת"א) 4 3 '), 2.5 μL של חיץ תגובה polynucleotide kinase 10x, 3 μL של γ 32 P-DATP (6,000 Ci / mmol), 4 μL של T4 Polinucleotide kinase ו DNase חינם, מים סטריליים deionized לנפח הסופי של 20 μL ב micrצינור ocentrifuge.
- צנטריפוגות בקצרה (10-30 זה ב XG 16,000) ו דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 ח. צנטריפוגה עבור 10-30 s ב XG 16,000 ו דגירה על 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לעצור את התגובה.
- באמצעות עמודה כרומטוגרפיה G-25 microspin, לערבב את התוכן של העמודה על ידי vortexing, ואז צנטריפוגה דקות 1 ב 700 xg בטמפרטורת החדר. מחק את תסנין.
- טען את הפתרון בדיקה רדיואקטיבית לתוך G-25 טור כרומטוגרפיה צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 700 x גרם. שמור את התסנין.
הערה: שמרו את התסנין מכיוון שמכיל את בדיקת הטלומרים הרדיואקטיביים. בדיקה רדיואקטיבית ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך. - הכן 250 מ"ל של פתרון denaturing המורכב 1.5 M NaCl ו 0.5 M NaOH במים סטרילי deionized.
- מניחים את הג'ל לתוך צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של פתרון denaturing ו incubאכל במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון denaturing ולהחליף עם 250 מ"ל של מים deionized סטרילי. דגירה במשך 10 דקות על שייקר מסלולית (40 - 50 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
- הכן 250 מ"ל של תמיסת ניטרול המורכב 1.5 NaCl ו 0.5 M טריס חומצה הידרוכלורית, pH 8.0 במים סטרילי deionized.
- הסר את המים deionized ולהחליף פתרון מנטרל 250 מ"ל ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- במהלך הדגירה בפתרון ניטרול, להכין 50 מ"ל פתרון הכלאה המורכב 5x SSC, פתרון של 5x Denhardt (0.1% פולימר לא סינתטי יון, 0.1% פוליוויניל pyrrolidine, 0.1% אלבומין בסרום שור), 10 mM פוספט זרחן (Na 2 HPO 4 ) ו 1 מ"מ נתרן pyrophosphate decahydrate tetrabasic (Na 4 P 2 O 7. 10 H 2 O) במים סטרילי deionized.
- רול את הג'ל לתוך רשת ניילון ומכניסים לתוך צינור הכלאה (צעד5.7). הוסף 20 מ"ל של הפתרון הכלאה דגירה בתנור הכלאה על 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם סיבוב.
- הסר את הפתרון הכלאה ולהחליף עם 20 מ"ל של פתרון הכלאה טריים. הוסף את מלוא של בדיקה הטלומרים לדגור בתנור הכלאה על 42 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם סיבוב.
7. ג 'ל כביסה, חשיפה מסך זרחן, ורדיו הדמיה
- הכן 500 מ"ל של פתרון SSC 2x (300 מ"מ NaCl, 30 מ"ל ציטראט ציטראט) במים סטרילי deionized.
- הכן 250 מ"ל של 0.1x SSC (15 מ"ל NaCl, 1.5 מ"מ ציטראט ציטראט) ו 0.1% נתרן Dodecyl סולפט (SDS) במים deionized.
- הסר את הג'ל רשת מהצינור הכלאה ומכניסים לתוך צלחת זכוכית המכילה 250 מ"ל של 2x SSC. להתיר ולהסיר את רשת ניילון מן המנה. מניחים את צלחת זכוכית על שייקר מסלולית דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את 2x SSC ולהחליף עם 250 מ"ל של 0.1x SSC ו 01% פתרון SDS, ו דגירה במשך 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר.
- במהלך הדגירה, לחשוף את המסך זרחן למחק התמונה במשך 15 דקות.
- הסר את 0.1x SSC ו 0.1% פתרון SDS ולהחליף עם 250 מ"ל של 2x SSC. דגירה במשך 15 דקות על שייקר מסלולית.
- הסר את הג'ל מ 2x פתרון SSC או לעטוף את הג'ל בניילון נצמד או מקום לתוך שקית חותם sealable. הסר את כל הבועות וכיסי אוויר בין הג'ל לבין העטיפה פלסטיק או שקית פלסטיק. מניחים את הג'ל לתוך קלטת חשיפה עם מסך phopshor. לחשוף את המסך זרחן לג'ל לילה.
- תמונה מסך זרחן חשוף באמצעות phosphorimager.
8. Telomere אורך כימות
- פתח את הקובץ phosphorimager המכיל את התמונה ניאון של ירוק ניאון חומצה גרעין מוכתם חומצה ( איור 1 ).
- בחר 'כלים' ולאחר מכן 'מרחק פיקסל9 ;. באמצעות העכבר, לצייר קו מלמטה של ג 'ל גם באמצע הלהקה סמן הראשון להקליט את המרחק. חזור על הליך זה עבור כל הלהקה סמן ( איור 2 ). מרחקים אלה ישמשו בתכנית הגרפים כמתואר להלן.
- פתח את phosphorimage של ג'ל radiolabeled ( איור 3 ). בחר 'מנהל אובייקטים' ולאחר מכן 'רשת'. הגדר את טבלה 1 עד 150 שורות ו -150 שורות. התאם את הרשת כך שהוא מותח מהחלק העליון של הג'ל לתחתית הג'ל. התאם את רוחב הרשת כך שרוחב הנתיב יהיה זהה, לחיצה על קצה הרשת וגרירת רוחב הרשת כך שרוחב הנתיב יהיה זהה.
- העתק את הרשת (כך שהגובה והגובה של הקופסאות נותרו ללא שינוי) והזז את הרשת השניה לנתיב ריק (למטרות רקע). המשך להעתיק ולהעביר רשתות נוספות עבור נתיבים לדוגמה נוספים.
הערה: בסיום, צריך להיותרשתות עבור כל נתיב מדגם רשת אחת של נתיב ריק עבור הרקע ( איור 4 ). - בחר 'ניתוח' ולאחר מכן 'דוח עוצמת קול'. בחר את כל הרשתות עבור הדוח, לאחר הצגת הדוח על עוצמת הקול, לחץ פעמיים על הדוח כדי להפעיל את התוכנית גיליון אלקטרוני שמור את קובץ הגיליון האלקטרוני.הנתונים עבור קובץ זה יהיו תחת הנתיב 'נפח'.
- פתח תוכנית גרפים מתאימה וצור נתונים וטבלה חדשים. בחר 'Y: הזן וחתום ערך Y יחיד עבור כל נקודה' ולאחר מכן בחר 'צור'.
- תייג את העמודה הראשונה (עמודה X) כ- 'מדידת מרחק' ותווית העמודה השנייה (עמודה Y) כ'משקל מולקולרי '. הזן את משקולות הסמן המולקולרי של כל סמן סמן בעמודה Y. הזן את מרחקי ההעברה שהתקבלו בשלב 8.2 המתאים לכל סמן משקל מולקולרי.
- עבור אל 'ניתוח' ובחר 'ניתוח' ולאחר מכן 'regarsi לא לינאריתב (עקומת בכושר) 'ובחר' אישור '. במסך הבא, בחר "מעריכי ולאחר מכן" עששת פאזה אחת ". בחר 'טווח' הכרטיסייה והזן '150' ב 'מספר נקודות להגדיר את עקומת' ולבדוק 'יצירת טבלה של XY קואורדינטות לייצא או להעתיק את עקומה לתוכנית אחרת'.
הערה: התוצאה, "התאמה לא ליניארית של נתונים 1", מכילה את המשקל המולקולרי עבור כל מרחק בשורה Y. - לניתוח של נתיבי המדגם, בחר אזור ניתוח כי הוא מעל ומתחת להקות הטלומרים בפועל. אל תשתמש בכל אורך הנתיב ( איור 5 ). לקבוע את מיקומי הרשת עבור אזור ניתוח של כל נתיב.
- בחר 'קובץ', 'חדש' 'צור טבלה חדשה וגרף'. בחר 'Y: הזן וחתום ערך Y יחיד עבור כל נקודה' ולאחר מכן בחר 'צור'. העתק והדבק את ערכי עוצמת הקול של נתיב הרקע (ערכי עוצמת) מקובץ הגיליון האלקטרונילתוך העמודה הראשונה (X) ואת ערכי עוצמת הקול (ערכי עוצמת) מן הנתיב לדוגמה לתוך העמודה הראשונה Y. אם יש נתיבים מדגם מרובים, להעתיק כל קבוצה של ערכי עוצמת הקול מקובץ גיליון אלקטרוני לתוך עמודות Y נוספים בתוכנית גרפים קוֹבֶץ.
- מחק את הערכים מעמוד הרקע (X) וכל נתיב לדוגמה (Y) הנמצאים מחוץ לתחומי הניתוח שנקבעו בשלב 8.8.
הערה: טבלת הנתונים צריכה להכיל רק ערכים באותם מיקומי רשת המתאימים לתחומי הניתוח. - בחר ניתוח ולאחר מכן 'נתח' ו'שנה '. לחץ על 'אישור'. בחר 'המרה Y ערכים באמצעות Y = YX'. זה יהפוך את הנתונים נתונים 2 (ערך עוצמת המרה (Y) = עוצמת הדגימה (Y) - עוצמת הרקע (X)).
- בחר ניתוח ולאחר מכן 'ניתוח', 'ניתוח עמודות' ו'סטטיסטיקות עמודות '. בחר אישור. הכרטיסייה תוצאות 'Col. נתונים סטטיסטיים של המרה של נתונים 2 'מראהתחת השורה 'סכום', Σ (Int i ).
- בחר 'קובץ', 'חדש', 'צור טבלה חדשה וגרף'. בחר 'Y: הזן וחתום ערך Y יחיד עבור כל נקודה' ולאחר מכן בחר 'צור'. העתק והדבק את נתוני העמודה Y מתוך דף התוצאות 'nonlin fit of Data 1, Curve' בעמודה X החדשה. העתק והדבק את נתוני העמודה Y מתוך דף התוצאות 'המרה של נתונים 2' בעמודה Y החדשה. בחר ניתוח ואז 'ניתוח' ו 'המרה'. לחץ על 'אישור'. בחר 'המרה ערכים Y באמצעות Y = Y / X'.
- בחר ניתוח ולאחר מכן 'ניתוח', 'ניתוח עמודות' ו'סטטיסטיקות עמודות '. בחר אישור. הכרטיסייה תוצאות 'Col. נתונים סטטיסטיים של טרנספורמציה של נתונים 3 'מוצגים תחת השורה' סכום ', Σ (Int i / MW i ). MW = משקל מולקולרי.
- כדי לחשב את אורך הטלומרים הממוצע (TL) עבור כל מדגם, השתמשנוסחה TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלושה ריכוזים של דנ"א (1, 2 ו -3 מיקרוגרם) מבודדים מקו התא BJ-hTERT (telomerase הנצחית fibroblasts עורית) 22 ו דם אנושיים היקפיים דם monopuclear (PBMCs) נותחו עבור אורך הטלומרים. טבלה 1 מציגה את הקצאות הנתיב עבור כל דגימת DNA. איור 1 מציג חומצה גרעין ניאון פלואורסצנטי של הג'ל. תקני המשקל המולקולרי נראים בבירור. המרחק מהחלק העליון של הג'ל לכל תקן משקל מולקולרי נקבע ( איור 2 ). איור 3 מציג את phosphorimage של הכלאה הבאה ג'ל עם בדיקה הטלומרים. להקות הטלומרים מוצגות כמו כתמים בכל נתיב. רשתות של 150 תיבות חושבו עבור כל נתיב בתוספת מסלול רקע אחד ( איור 4 ). תחומי ניתוח המקבילים לתחומיג'ל המכיל את להקות הטלומרים עבור כל קבוצה של דגימות מוצג באיור 5 . נתיבי רקע נפרדים נבחרו עבור כל קבוצה של דגימות על מנת להבטיח כי עוצמות רקע היו דומים עבור כל קבוצה מדגם (נתיבים מסומנים B באיור 5 ). טבלה 2 מראה את אורך הקטע של הטלומרים על כל מדגם. אורך הטלומרים הממוצע בקו התא הנציח HTERT (BJ-hTERT) גבוה יותר מזה שנצפה ב- PBMCs אנושיים (השווה נתיבים 2, 4 ו -6 עם נתיבים 10, 12 ו -14 באיור 3 ). תוצאות אלה מראות גם כי כמות הדנ"א הגנומי המנותח בכל נתיב היא קריטית להשגת אות הניתן לזיהוי לאחר הכלאה. עבור דגימות עם telomeres כי הם אחידים למדי ( כלומר , קו התא BJ-HTERT) קטן כמו 1 מיקרוגרם היה לזיהוי באמצעות הליך זה (למרות האות היה קלוש מאוד). עם זאת, עבור דגימות עם טלומרים שיש להםשונות גדולה יותר ( כלומר , PBMCs האדם), כמות מינימלית של ה- DNA לספק אות אמין הוא 2 מיקרוגרם.
איור 1 : גרין פלואורסצנטי חומצה גרעין מוכתם ג'ל. Phosphorimage של ג'ל agarose יבשים מוכתמים עם כתם חומצה גרעין ניאון ירוק מראה את המיקום של הלהקות סולם DNA (נתיבים 1 ו - 8). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור מס '2 : קביעת טווח הגבלת סמן הסמן . החצים הכחולים מציינים את המרחק שנמדד מהחלק העליון של הג'ל ל- EAצ'ה דנ"א סולם הלהקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : phosphorimage של דגימות DNA נבדק עם בדיקה Telomere. נתיבים 2, 4 ו 6 מכילים BJ-HTERT DNA (1, 2, 3 מיקרוגרם, בהתאמה). נתיבים 10, 12 ו 14 מכילים DNA PBMC האנושי (1, 2 ו - 3 מיקרוגרם, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : מיקום הרשת. צילום מסך המציג את המיקום של150 רשתות ספירה עבור כל נתיב לנתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 : תחומי הניתוח. Phosphorimage של להקות הטלומרים מראה את האזורים שנבחרו של ניתוח עבור כל קבוצה של דגימות. נתיבים 2, 4 ו 6 מכילים BJ-HTT DNA; נתיבים 10, 12 ו 14 מכילים DNA PBMC האנושי. B = נתיבי רקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| נתיב | לִטעוֹם |
| 1 | סולם DNA |
| 2 | BJ-HTERT 1 &# 181; g |
| 3 | רֵיק |
| 4 | BJ-HTERT 2 מיקרוגרם |
| 5 | רֵיק |
| 6 | BJ-HTERT 3μg |
| 7 | רֵיק |
| 8 | סולם DNA |
| 9 | רֵיק |
| 10 | PBMCs 1μg |
| 11 | רֵיק |
| 12 | PBMCs 2μg |
| 13 | רֵיק |
| 14 | PBMCs 3μg |
| דגימות DNA מופרדים על ג'ל agarose 0.6% |
טבלה 1: דנ"א Agarose דוגמאות דוגמאות.
| דוגמה (נתיב) | & #8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | ממוצע Telomere אורך = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1ug (1) | ° North | 20596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416337 | -42585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286653 | 62845 | 4.561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524123 | 3.586944286 |
טבלה 2: ממוצע חישובים אורך Telomere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעקבות אלקטרופורזה, כתם ה- DNA הגנומי גבוה מ -800 bp. זה יכול להתרחש אם אנזימים הגבלה הם פגומים או אם אנזימים נוספים (כמתואר לעיל) נדרשים. הסבר אפשרי נוסף הוא שהחלבון עדיין מחובר לדנ"א. בעת קביעת ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר, יחס 260/280 צריך להיות סביב 1.8. אם יחס זה הוא <1.5, יש זיהום חלבון אשר יכול להפריע הגבלת אנזים אכול. או דגימת DNA היה צריך להיות מבודדים מחדש, או חלבון יצטרך להסיר עם עיכול proteinase K ופנול: מיצוי כלורופורם ואחריו משקעים אתנול. השימוש בערכת בידוד דנ"א מסחרי גורם באופן שגרתי לדנ"א עם יחס של 260/280 1.8-1.85.
בעקבות החשיפה של הג'ל למסך זרחן, לא נמצאו שברי טלומרה. זה יכול להיגרם על ידי רדיו רע שכותרתו הטלומרים בדיקה, הכלאה לא תקיןתנאים או כמות מספקת של הדנ"א הגנטי החל. כאשר מכינים את הטלומרים בדיקה, בסוף צנטריפוגה של טור ה- G-25, צריך להיות רדיואקטיביות בקלות לזיהוי הזרימה דרך (המייצג את הטלומר רדיו התווית בדיקה). אם רדיואקטיביות לא זוהה, אז היתה בעיה עם ההכנה של בדיקה. כמו כן חשוב לוודא כי הטמפרטורה הכלאה אינו עולה על 42 מעלות צלזיוס (כדי למנוע התכה של החללית: מורכבים תבנית) וכי חיץ הכלאה לחלוטין טבילה את הג'ל בחדר הכלאה. כמות מינימלית של DNA גנומי המספק טלומרים לגילוי הוא 2.0-3.0 מיקרוגרם. כמויות קטנות יותר של חומר המוצא יכול לגרום חלש מאוד לא האות לאחר הכלאה.
פרוטוקול זה דורש 2-3 מיקרוגרם עבור כל אורך הטלומרים קביעת. אם הדגימות הן להריץ כפולים או שלושה עותקים, אז 6-12 מיקרוגרם של DNA נדרש. זה מונע את ה הוא הליך בשימוש על דגימות עם כמות DNA מוגבלת. ההליך הוא מייגע למדי הדורש 3-4 ימים כדי להשלים. מספר דגימות לנתח בו זמנית מוגבל למספר של ג'ל אלקטרופורזה אסדות וגודל מסרק ג'ל agarose. כתוצאה מכך, זה פחות אידיאלי עבור מחקרים המעסיקים מספר גדול של דגימות (כגון מחקרים אפידמיולוגיים).
דנ"א הכלאה טכניקות של telomeres מופרדים על ידי ג'ל אלקטרופורזה נשאר תקן הזהב לקביעת אורך הטלומרים. אין נוהל אחר ישירות מודד אורך הטלומרים וכתוצאה מכך גודל הטלומרים בפועל.
ישנם מספר צעדים קריטיים בהליך זה. ראשית, הדגימה DNA חייב להיות שלמות טובה, כלומר , לא גזוז. DNA כי הוא shared יכול לגרום תוצאות אורך הטלומרים שווא. חשוב גם כי העיכול DNA יהיה שלם. העיכול של ה- DNA הגנומי צריך לגרום למריחת DNA של 800 או פחות"Xref"> 2. כדי להבטיח אכול תקין, כמה נהלים תיארו סך של 6 אנזימים הגבלה (ולא רק RSAI ו Hinf1 כמתואר בהליך זה). אנזימים הגבלה נוספים כוללים HHAI, MSPI, HaeIII ו AluI 2 . צעד קריטי השני הוא המאפשר את agarose ג'ל לרוץ מספיק זמן כדי לקבל הפרדה נכונה של ה- DNA מתעכל. אם יש הפרדה טובה יותר, אז יש דיוק טוב יותר בניתוחים. זמן ריצה ג'ל צריך להיות ארוך מספיק, כך שברי דנ"א המייצג 1 Kbp ממוקמים בחלק התחתון של הג'ל ( איור 1 ). בהתאם לגודל ג'ל ואת המתח של אלקטרופורזה, זה יכול לדרוש 12 עד 24 שעות. צעד קריטי שלישי הוא הכלאה. חייב להיות חיץ הכלאה מספיק בצינור קאמרית לטבול את הג 'ל כולו כאשר הצינור הוא אופקי. רמות מספיקות של חיץ הכלאה יכול לגרום הכלאה אחידה של בדיקה הטלומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מאשרים את התמיכה של אוניברסיטת פיטסבורג סרטן המכון Biobehavioral אונקולוגיה משותפת במתקן הנתמך בחלקו על ידי פרס P30CA047904.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16 (2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
- Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
- Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
- Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
- Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M.
- MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).
- Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
- Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
- Opresko, P. L., Shay, J. W.
- Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
- Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M.
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
- Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
- Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
- Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
- Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
- Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214 (2015).
