Summary
In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragmentanalyse diskutiert, die eine schnelle und effiziente direkte Messung der Telomerlänge ermöglicht. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Zellquellen von DNA zur Quantifizierung der Telomerlänge angewendet werden.
Abstract
Es gibt mehrere verschiedene Techniken zur Messung der Telomerlänge, jeweils mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Der traditionelle Ansatz, Telomere Restriction Fragment (TRF) -Analyse, nutzt eine DNA-Hybridisierungsmethode, bei der genomische DNA-Proben mit Restriktionsenzymen verdaut werden, wobei Telomere-DNA-Repeats und einige sub-telomere DNA zurückbleiben. Diese werden durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt, auf eine Filtermembran übertragen und an Oligonukleotidsonden hybridisiert, die entweder mit Chemilumineszenz oder Radioaktivität markiert sind, um Telomer-Restriktionsfragmente zu visualisieren. Dieser Ansatz, während er eine größere Menge an DNA benötigt als andere Techniken wie PCR, kann die Telomerlängenverteilung einer Population von Zellen messen und ermöglicht die Messung in absoluten Kilobasen. Dieses Manuskript zeigt ein modifiziertes DNA-Hybridisierungsverfahren zur Bestimmung der Telomerlänge. Genomische DNA wird zuerst mit Restriktionsenzymen verdaut (die nicht schneidenTelomere) und durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Das Gel wird dann getrocknet und die DNA wird denaturiert und in situ zu einer radioaktiv markierten Oligonukleotidsonde hybridisiert. Diese in situ Hybridisierung vermeidet den Verlust von Telomere DNA und verbessert die Signalintensität. Nach der Hybridisierung werden die Gele unter Verwendung von Leuchtstoffschirmen abgebildet und die Telomerlänge unter Verwendung eines graphischen Programms quantifiziert. Dieses Verfahren wurde von den Labors von Drs entwickelt. Woodring Wright und Jerry Shay an der University of Texas Southwestern 1 , 2 . Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens vor, mit einigen Modifikationen.
Introduction
Telomere, die sich an den Enden der Chromosomen befinden, sind Nukleotidwiederholungen der Sequenz TTAGGG (auf menschlichen Chromosomen), die eine entscheidende Rolle beim Schutz der zellulären genetischen Information spielen 3 , 4 , 5 . Telomere sind mehrere tausend Basenpaare lang und dienen dazu, die Integrität des Restes des Chromosoms während der DNA-Replikation zu schützen. Die Replikation von Chromosomen ist nicht perfekt, da die Enden des Chromosoms nicht vollständig kopiert wurden. Diese Ineffizienz in der Replikation wird als das "End-Replikationsproblem" bezeichnet und führt zu einem Verlust von einigen der Telomer-Wiederholungen während jeder Replikationsrunde 6 , 7 . Die Telomere-Länge kann nach der Zellteilung durch Telomerase wiederhergestellt werden, ein Enzym, das die verlorenen Telomersequenzen 8 , 9 ersetzt . Telomerase ist aber nichtAktiviert in den meisten menschlichen somatischen Zellen und als Ergebnis, im Laufe der Zeit, werden die Telomere verkürzen, was schließlich zu zellulären Seneszenz 10 führt . Aufgrund der Telomerverkürzung werden Telomere als Biomarker des Alterns und das Risiko altersbedingter Krankheiten angesehen 11 , 12 . Darüber hinaus kann die Telomerlänge durch genetische, ökologische und lebensstilfaktoren und andere stimuli wie oxidativen Stress beeinflusst werden, was darauf hinweist, dass die Telomerlänge als Biomarker in toxikologischen, epidemiologischen und Verhaltensstudien eine Rolle spielen kann 13 , 14 , 15 .
Dieser Artikel zeigt eine Technik zur Messung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragment (TRF) -Analyse, die von Mender und Shay 2 und Kimura et al. 16 , und ähnlich wie Herbert, Shay und WrigHt 1 und Haussmann und Mauck 17 . Traditionell beinhaltet die TRF-Analyse ein Southern-Blot-Verfahren. Southern-Blots gelten als "Gold-Standard" für das Studium der Telomer-Länge und werden aktiv zur Untersuchung der Leukozyten-Telomer-Länge in Epidemiologie-Studien verwendet 18 . Diese TRF-Analyse verwendet verdaute genomische DNA, die die Telomer-Wiederholungen hinterlässt. Die DNA-Fragmente werden dann durch Gelelektrophorese getrennt, denaturiert und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Telomer-Sequenzen werden an eine Telomere-Oligonukleotidsonde hybridisiert. Anstatt die getrennten Telomere auf eine Membran zu übertragen, verwenden andere TRF-Techniken In-Gel-Hybridisierungstechniken mit und ohne Denaturierung der DNA. Die Einbeziehung der Denaturierung ist bei der Betrachtung des Nachweises von interstitiellen Telomeren, die bei einigen Arten berichtet wurden, wichtig. Prozeduren, die denaturierende Schritte fehlen, erkennen nur thE einzelsträngige DNA-Überhänge an terminalen Telomeren und werden nicht an interstitielle Telomersequenzen 18 binden.
Neben der TRF-Analyse gibt es noch einige andere Techniken zur Messung der Telomerlänge, die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Die Flow-FISH-Technik kann die mittlere Telomerlänge einzelner Zellen eines bestimmten Zelltyps mit der Durchflusszytometrie 16 , 20 messen. Während es telomeres mit hochspezifischen Sonden genau markieren und menschliches Fehler durch Automatisierung reduzieren kann, ist Flow-FISH teuer, weniger effizient und erfordert frische Proben und einen hochqualifizierten Techniker, der seine Fähigkeit zur Epidemiologie-Studien einschränkt. Darüber hinaus berücksichtigt diese Methode keine potenziellen Veränderungen der Anzahl der Chromosomen in der Zellpopulation. Eine andere Technik, qPCR, wird weithin als Mittel zur Messung der Telomerlänge für Epidemiologie-Studien akzeptiert 21 .
Das TRF-Verfahren hat seine eigenen Mängel, die seine Verwendung für einige Studien einschränken. TRF-Techniken erfordern eine große Menge an DNA im Vergleich zu anderen Methoden (zwischen 2 und 3 μg pro Probe). Dies beschränkt die Anwendung der Technik auf die Untersuchung der Telomerlänge von klinischen Proben, für die genügend genomische DNA gesammelt werden kann und nicht auf abgebauten DNA-Proben verwendet werden kann. Darüber hinaus ist die TRF-Analyse kostspielig und arbeitsintensiv und erfordert 4-5 Tage, um Ergebnisse zu erzielen. Die TRF ergibt jedoch einen niedrigen VariationskoeffizientenGewährleistung der Reproduzierbarkeit Während dieses Protokoll anders ist als das traditionelle Southern-Blot (unter Verwendung von In-situ- Gel-Hybridisierung), sind die beiden Techniken grundsätzlich das gleiche.
Die hier vorgestellte Technik ist eine Kombination aus einer Southern-Blot- und In-Gel-Hybridisierung; Assoziieren des DNA-Denaturierungsschrittes von Southern-Blots mit der In-Gel-Hybridisierung. Diese Kombination hat den zusätzlichen Vorteil einer verbesserten Sonden-Signalstärke im Vergleich zum Southern-Blot und hat konsequent quantifizierbare Ergebnisse in unserem Labor ergeben. Darüber hinaus liefert die Verwendung von radioaktiven Sonden anstelle von chemilumineszierenden Sonden eine höhere Signalintensität und ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung mit einem Phosphorimager, wodurch die Analysen der TRF benutzerfreundlich sind.
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Protocol
1. Genomische DNA-Extraktion
- Führen Sie eine genomische DNA-Extraktion aus den Zellen (hier, Zelllinie BJ-hTERT) durch, die mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit nach den Anweisungen des Herstellers analysiert werden soll.
- Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer. Wenn die DNA-Konzentration weniger als 100 μg / ml beträgt, fällt die DNA mit Ethanol aus und resuspendiert in einem Volumen von TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH 8,0), um eine DNA-Konzentration von zu gewährleisten 100-600 & mgr; g / ml).
2. DNA Integrity Assessment
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls skizziert eine DNA-Integritätsbewertung unter Verwendung eines Gelelektrophoresesystems mit einem 11 cm x 14 cm Gel. Andere Systeme und Gelgrößen können ebenfalls verwendet werden, aber die Spannungs- und DNA-Migrationszeit kann variieren.
- Vorbereiten eines 1% Agarosegels durch Kombinieren von 1 g Elektrophoresequalität Agarose in 100 ml 1x TAE Puffer (40 mM TrIst-base; 20 mM Essigsäure; 2 mM EDTA; PH 8,5) und Mikrowelle, bis die Agarose gelöst ist und die Lösung klar ist. Die Lösung bei Raumtemperatur bis zur Erreichung von 50 ° C (ca. 15 - 20 min) abkühlen lassen.
- Während die Agarose-Lösung abkühlt, bereiten Sie die Gel-Gießschale vor, indem Sie Guss-End-Gates dem Gieß-Tablett hinzufügen. Um Agarose-Leckagen zu vermeiden, kühlen Sie die Endtore auf 4 ° C vor dem Anbringen an die Gießschale ab.
- Sobald die Agaroselösung auf 50 ° C abgekühlt ist, werden 10 μl Ethidiumbromid (10 mg / ml in dH 2 O) zugegeben und die Agaroselösung in die Gelgießschale gegeben. Füge den Kamm zum Gießbehälter hinzu.
- Man läßt die Agaroselösung 45 min bei Raumtemperatur aushärten.
- Vorbereiten von DNA-Proben für die Elektrophorese durch Verdünnen von 25 ng genomischer DNA unter Verwendung von 1x TE-Puffer auf ein Endvolumen von 9 & mgr; l und Zugabe von 1 & mgr; l 10 × Beladungsfarbstoff (0,25% (w / v) Bromphenolblau, 0,25% (w / v) Xylol Cyanol FF, 30% (v / v) Glycerin). Gut mischen.
- Führen Sie die DNA-Migration bei 100 V für ca. 2 h oder bis der Bromphenolblau-Farbstoff etwa auf halbem Weg durch das Gel ist.
- Bild das Gel mit einem Ultraviolettlicht-Transilluminator oder gleichwertig.
HINWEIS: DNA-Proben mit guter Integrität haben hochmolekulare Banden ohne Verschmieren (das ist durch gescherte oder gebrochene DNA). Wenn die DNA-Banden verschmiert sind, haben sie eine geringe Integrität und sind nicht für die Southern-Blot-Analyse geeignet, und die DNA muss mit frischen Zellen wieder isoliert werden.
3. Genomische DNA-Verdauung
- Führen Sie die Verdauung der genomischen DNA in einem Endvolumen von 20-40 μl durch.
HINWEIS: Volumina größerAls 40 μl überlaufen die Vertiefungen des Agarosegels.- Kombinieren Sie 3 μg genomische DNA und die entsprechende Menge an 10x DNA Digest Puffer (geliefert mit den Restriktionsenzymen), so dass die Endkonzentration 1x ist, in einem Mikroröhrchen. Füge 1 μl RsaI-Restriktionsenzym (10.000 U / ml) und 1 μl HinfI-Restriktionsenzym (10.000 U / ml) zu jedem Röhrchen hinzu. Das Endvolumen mit sterilem, deionisiertem H 2 O einstellen. Zentrifugieren Sie kurz (10 - 15 s bei 16.000 xg), um sicherzustellen, dass alle Komponenten im Boden des Rohres sind.
- Inkubieren Sie die Verdauung bei 37 ° C für ≥ 16 h. Nach der Verdauung die verdaute DNA bei 4 ° C oder -20 ° C für nicht mehr als 2 Tage bei Bedarf 17 aufbewahren .
4. Genomische DNA-Gel-Elektrophorese
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls skizziert ein Verfahren zur Verwendung eines 20 cm x 25 cm Gelelektrophorese-Systems. Verschiedene Gel-ElektroPhoresis-Systeme verwendet werden können, aber es müssen möglicherweise mehrere Variablen modifiziert werden, einschließlich der Spannung, der Zeit der Migration und der Menge des Elektrophoresepuffers, der dem System hinzugefügt wurde, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
- 0,6% Agarose-Lösung durch Kombination von 2,25 g Gel-Elektrophorese-Agarose mit 375 ml Elektrophoresepuffer, entweder 1x TAE oder 0,5x TBE (110 mM Tris-Base, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA, pH 8,3), herstellen.
ANMERKUNG: Für Telomere von weniger als 8.000 kB wird 0,5x TBE empfohlen, während 1x TAE für Telomere zwischen 8.000 kB und 20.000 kB 1 empfohlen wird. - Mikrowelle die Lösung, bis sich die Agarose aufgelöst hat und die Lösung klar ist. Man läßt die Lösung 15 bis 20 min bei Raumtemperatur abkühlen oder bis die Agarose 50 ° C erreicht.
- Während die Agarose-Lösung abkühlt, bereiten Sie das Gelelektrophoresesystem für das Gelgießen vor, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Gießen Sie die Agarose-Gel-Lösung in eine Gel-Gießschale. Setzen Sie einen Kamm inDas Gel Man läßt das Gel 45 min lang bei Raumtemperatur aushärten.
- Bereiten Sie die verdauten DNA-Proben für die Elektrophorese vor. Für eine 40 uL-Reaktion werden 0,4 μl 10x Beladungsfarbstoff in jede Probe von verdauter DNA gegeben. Kurz zentrifugieren (10-15 s, 16.000 xg), um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung am Boden des Röhrchens liegt.
- Bereiten Sie das Gelelektrophoresesystem für die DNA-Migration vor. Entfernen Sie die Endtore und kämmen Sie aus dem Gel. Füllen Sie das Gelelektrophorese-System mit 1x TAE oder 0,5x TBE in die Fülllinie, um sicherzustellen, dass das Gel vollständig in den Puffer eingetaucht ist.
- Laden Sie die Vertiefungen des Gels mit den DNA-Proben, so dass zwischen den Proben ein Rohling vorhanden ist. Vermeiden Sie es, Blasen zu verursachen oder das Gel zu punktieren. Füge 10 μl einer DNA-Leiter in Wells an den gegenüberliegenden Enden des Gels hinzu.
HINWEIS: Die Art der DNA-Leiter hängt von der Länge der Telomere ab, die von Person zu Person und zwischen Zellquellen variieren wird. - Führen Sie die Gelelektrophorese bei 1 durch50 V für 30 min, um schnell die DNA in das Gel zu bewegen; Dann die Spannung auf 57 V einstellen und 18-24 h laufen lassen.
5. Gel Fluoreszenz Imaging und Hybridisierung
- Nach 18-24 h schalten Sie die Gelelektrophorese-Stromquelle aus. Entfernen Sie die Gelgießschale mit dem Gel aus dem Elektrophoresepuffer. Schieben Sie die obere rechte Ecke des Gels ab, um als Referenz für die Orientierung des Gels zu dienen.
- Bereiten Sie ein Stück Filterpapier vor, indem Sie das Papier etwas größer als das Gel schneiden. Legen Sie das Filterpapier auf das Gel in die Gießschale und lassen Sie das Papier auf überschüssige Lösung auf dem Gel aufnehmen. Entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen zwischen dem Filterpapier und dem Gel mit einer Pipette als Walze, um die Blasen durch die Seiten zu quetschen.
- Entfernen Sie das Gel aus dem Gießbehälter, indem Sie das Gel umdrehen und das Papier papieren, damit das Papier unter dem Gel liegt. Übertragen Sie das Gel mit dem Filterpapier auf einen Geltrockner und decken Sie dasGel mit Plastikfolie. Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen der Plastikfolie und dem Gel mit einer Pipette als Rolle.
- Das Gel 2 h bei 50 ° C trocknen.
- Nach dem Trocknen die Plastikfolie entfernen und das Gel auftragen und auf eine Glasschale geben, die 250 ml entionisiertes Wasser enthält (ausreichend, um das Gel zu bedecken). Entfernen Sie vorsichtig das Filterpapier und inkubieren Sie das Gel bei Raumtemperatur für 15 min. Das Gel wird dünn, fest und leicht zu manipulieren, ohne zu reißen.
- 5x SSC-Lösung (750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat) in deionisiertem Wasser vorbereiten.
- Lege das Gel auf ein Nylongewebe (12 in x 12 in). Rollen Sie das Nylon-Mesh und Gel zusammen, um sicherzustellen, dass das Gel nicht in Kontakt mit sich selbst ist. Legen Sie das Netz und Gel in ein Hybridisierungsrohr ( z. B. 12 in Rohr mit 1,5 im Durchmesser).
HINWEIS: Wenn es richtig aufgerollt ist, wird das Gel auf beiden Seiten mit dem Nylongewebe in Berührung kommen. - Kombinieren Sie 100 ml 5x SSC und 12 μl grün fluoreszierende Nukleinsäure aCid Fleck, und legen Sie in die Hybridisierungsröhre. Schützen Sie die Lösung vor Licht und inkubieren Sie für 30 min bei 42 ° C in einem Hybridisierungsofen mit Rotation.
- Entfernen Sie das Nylongewebe / Gel aus dem Hybridisierungsrohr, rollen Sie es auf und legen Sie es flach in eine Glasschale mit 250 ml entionisiertem Wasser und entfernen Sie vorsichtig Nylongewebe. Bild das Gel mit einem Phosphorimager. Verwenden Sie die Fluoreszenz-Einstellungen: 520 BP, 40 Blau und 488 nm. Stellen Sie die Photovervielfacherröhre (PMT) auf 375, die Brennebene auf +3 mm und die Empfindlichkeit auf Normal. Speichern Sie das Bild in eine Datei.
6. Hybridisierung
- Die radioaktive Telomer-Sonde vorbereiten.
- Kombinieren Sie 2 μl (2 ng) Telomer-Sonde (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μl 10x Polynukleotid-Kinase-Reaktionspuffer, 3 μl γ 32 P-dATP (6000 Ci / mmol), 4 μl T4 Polynukleotid-Kinase und DNase-freiem, sterilem deionisiertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 & mgr; l in einem MikrometerZentrifugenröhrchen.
Achtung: Bei der Verwendung von Radioaktivität die radioaktiven Schutzmaßnahmen der Anlage befolgen.
- Kombinieren Sie 2 μl (2 ng) Telomer-Sonde (5- (CCC TAA) 4 3 '), 2,5 μl 10x Polynukleotid-Kinase-Reaktionspuffer, 3 μl γ 32 P-dATP (6000 Ci / mmol), 4 μl T4 Polynukleotid-Kinase und DNase-freiem, sterilem deionisiertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 & mgr; l in einem MikrometerZentrifugenröhrchen.
- Kurz zentrifugieren (10-30 s bei 16.000 xg) und in Wasserbad bei 37 ° C für 1 h inkubieren. Centrifuge für 10-30 s bei 16.000 xg und inkubieren bei 65 ° C für 20 min, um die Reaktion zu stoppen.
- Unter Verwendung einer G-25-Chromatographie-Mikrospinsäule wird der Inhalt der Säule durch Vortexen vermischt und dann für 1 min bei 700 xg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Filtrat verwerfen.
- Die radioaktive Sondenlösung in die G-25-Chromatographiesäule geben und 2 min bei 700 x g zentrifugieren. Sparen Sie das Filtrat.
HINWEIS: Das Filtrat aufbewahren, da dies die radioaktive Telomer-Sonde enthält. Die radioaktive Sonde kann bei Bedarf bei 4 ° C gelagert werden. - Vorbereiten von 250 ml Denaturierungslösung aus 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH in sterilem deionisiertem Wasser.
- Legen Sie das Gel in eine Glasschale mit 250 ml Denaturierungslösung und InkubFür 15 min bei Raumtemperatur gegessen. Entfernen Sie die Denaturierungslösung und ersetzen Sie sie mit 250 ml sterilem deionisiertem Wasser. 10 min auf einem Orbitalschüttler (40 - 50 U / min) bei Raumtemperatur inkubieren.
- Vorbereiten von 250 ml einer Neutralisationslösung aus 1,5 NaCl und 0,5 M Tris-Salzsäure, pH 8,0 in sterilem deionisiertem Wasser.
- Das entionisierte Wasser entfernen und mit 250 mL Neutralisationslösung ersetzen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Während der Inkubation in der Neutralisationslösung werden 50 ml Hybridisierungslösung aus 5x SSC, 5x Denhardt-Lösung (0,1% nichtionisches synthetisches Polymer, 0,1% Polyvinylpyrrolidin, 0,1% Rinderserumalbumin), 10 mM Dinatriumphosphat (Na 2 HPO) hergestellt 4 ) und 1 mM Natriumpyrophosphat tetrabasisches Decahydrat (Na 4 P 2 O 7 10 H 2 O) in sterilem deionisiertem Wasser.
- Rollen Sie das Gel in Nylongewebe und legen Sie es in das Hybridisierungsrohr (Schritt5.7). 20 ml der Hybridisierungslösung zugeben und in einem Hybridisierungsofen bei 42 ° C für 10 min unter Rotation inkubieren.
- Entfernen Sie die Hybridisierungslösung und ersetzen Sie sie mit 20 ml frischer Hybridisierungslösung. Fügen Sie die Gesamtheit der Telomer-Sonde hinzu und inkubieren Sie in einem Hybridisierungsofen bei 42 ° C über Nacht mit Rotation.
7. Gel Washing, Phosphor Screen Exposure und Radio Imaging
- Vorbereiten von 500 ml 2x SSC-Lösung (300 mM NaCl, 30 mM Natriumcitrat) in sterilem deionisiertem Wasser.
- Vorbereiten von 250 ml 0,1 x SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat) und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in deionisiertem Wasser.
- Entfernen Sie das Gel und Mesh aus dem Hybridisierungsrohr und legen Sie es in eine Glasschale mit 250 ml 2x SSC. Entrollen und entfernen Sie das Nylongewebe aus der Schale. Legen Sie die Glasschale auf einen Orbitalschüttler und inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die 2x SSC und ersetzen Sie sie mit 250 ml 0.1x SSC und 0.1% SDS-Lösung und inkubieren für 15 min auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur.
- Während der Inkubation den Phosphor-Bildschirm für 15 min dem Bild-Radiergummi aussetzen.
- Entfernen Sie die 0,1x SSC und 0,1% SDS Lösung und ersetzen Sie sie mit 250 mL 2x SSC. Inkubieren für 15 min auf einem Orbitalschüttler.
- Entfernen Sie das Gel aus 2x SSC-Lösung und wickeln Sie das Gel in Plastikfolie ein oder legen Sie es in einen heißsiegelbaren Beutel. Entfernen Sie alle Blasen und Lufttaschen zwischen dem Gel und der Plastikfolie oder Plastikbeutel. Legen Sie das Gel in eine Belichtungskassette mit dem Phopshor-Bildschirm. Den Phosphor-Bildschirm über Nacht dem Gel zugänglich machen.
- Bild den belichteten Phosphorsieb unter Verwendung eines Phosphorimagers
8. Telomere Länge Quantifizierung
- Öffnen Sie die Phosphorimager-Datei, die das Fluoreszenzbild des grün fluoreszierenden Nukleinsäure-gefärbten Gels enthält ( Abbildung 1 ).
- Wählen Sie 'Tools' und dann 'Pixel Distance'9 ;. Mit der Maus zeichne eine Linie von der Unterseite des Gels bis zur Mitte des ersten Markerbandes und notiere die Distanz. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Markierungsband ( Abbildung 2 ). Diese Abstände werden im Grafikprogramm wie unten beschrieben verwendet.
- Öffnen Sie den Phosphorbild des radioaktiv markierten Gels ( Abbildung 3 ). Wählen Sie 'Objektmanager' und dann 'Raster'. Setzen Sie das Raster auf 1 Spalte und 150 Zeilen. Stellen Sie das Raster so ein, dass es sich von der Oberseite des Gels bis zum Boden des Gels erstreckt. Passen Sie die Breite des Gitters an die Breite der Fahrspur an, klicken Sie auf den Rand des Gitters und ziehen Sie die Breite des Gitters auf die Breite der Fahrspur.
- Kopiere dieses Raster (damit die Breite und Höhe der Boxen gleich bleiben) und das zweite Raster auf eine leere Spur (für Hintergrundzwecke) verschieben. Weiter zu kopieren und verschieben Sie zusätzliche Gitter für zusätzliche Probenspuren.
HINWEIS: Wenn es fertig ist, sollte es seinGitter für jede Probenspur und ein Gitter einer leeren Spur für Hintergrund ( Abbildung 4 ). - Wählen Sie "Analysis" und dann "Volume Report" aus. Wählen Sie alle Gitter für den Report aus, sobald der Volume-Report angezeigt wird, doppelklicken Sie auf den Report, um das Tabellenkalkulationsprogramm zu aktivieren, und speichern Sie die Tabellenkalkulation Unter der 'Volume' Spur.
- Öffnen Sie ein entsprechendes Grafikprogramm und erstellen Sie eine neue Daten und Tabelle. Wählen Sie 'Y: Geben Sie einen einzelnen Y-Wert für jeden Punkt ein und klicken Sie dann auf' Erstellen '.
- Markiere die erste Spalte (Spalte X) als 'Measured Distance' und kennzeichnete die zweite Spalte (Spalte Y) als 'Molecular Weight'. Geben Sie die Marker-Molekulargewichte jeder Markerbande in Spalte Y ein. Geben Sie die in Schritt 8.2 erhaltenen Migrationsabstände ein, die jedem Molekulargewichts-Marker entsprechen.
- Gehen Sie zu 'Analysis' und wählen Sie 'Analysis' und dann 'nonlinear regressi(Kurvenanpassung) 'und wählen Sie' OK '. Wählen Sie auf dem nächsten Bildschirm 'Exponential und dann' Ein Phasenverfall '. Wählen Sie 'Range' und geben Sie '150' in 'Anzahl der Punkte ein, die die Kurve definieren' und klicken Sie auf 'Erstellen einer Tabelle von XY-Koordinaten zum Exportieren oder Kopieren der Kurve in ein anderes Programm'.
HINWEIS: Das Ergebnis, 'nichtlineare Anpassung von Daten 1', enthält das Molekulargewicht für jede Distanz in der Y-Zeile. - Für die Analyse der Probenspuren wählen Sie einen Bereich der Analyse, der oberhalb und unterhalb der tatsächlichen Telomer-Bänder liegt. Verwenden Sie nicht die gesamte Länge der Fahrspur ( Abbildung 5 ). Bestimmen Sie die Rasterplätze für den Analysebereich jeder Spur.
- Wählen Sie 'Datei', 'Neu' 'Neue Tabelle und Grafik erstellen'. Wählen Sie 'Y: Geben Sie einen einzelnen Y-Wert für jeden Punkt ein und klicken Sie dann auf' Erstellen '. Kopieren und fügen Sie die Hintergrundspurvolumenwerte (Intensitätswerte) aus der Tabellenkalkulation einIn die erste Spalte (X) und die Volumenwerte (Intensitätswerte) von der Probenspur in die erste Spalte Y. Wenn mehrere Probenspuren vorhanden sind, kopiere jeder Satz von Volumenwerten aus der Tabellenkalkulation in weitere Y-Spalten im Grafikprogramm Datei.
- Löschen Sie die Werte aus der Hintergrundspalte (X) und jeder Probenspur (Y), die außerhalb der in Schritt 8.8 ermittelten Analysebereiche liegen.
HINWEIS: Die Datentabelle sollte nur Werte in diesen Rasterpositionen enthalten, die den Analysebereichen entsprechen. - Wählen Sie Analysis, dann 'Analysieren' und 'transform'. OK klicken'. Wählen Sie 'Y-Y-Y-Y-Werte'. Dies verwandelt die Daten in Data 2 (transformierter Intensitätswert (Y) = Sample Intensität (Y) - Hintergrundintensität (X)).
- Wählen Sie Analysis, dann 'Analysieren', 'Spaltenanalyse' und 'Spaltenstatistik'. Wählen Sie OK. Die Ergebnisliste 'Col. Stats of Transform of Data 2 'zeigtUnter der 'Summe' Zeile Σ (Int i ).
- Wählen Sie 'Datei', 'Neu', 'Neue Tabelle und Grafik erstellen'. Wählen Sie 'Y: Geben Sie einen einzelnen Y-Wert für jeden Punkt ein und klicken Sie dann auf' Erstellen '. Kopiere und füge die Y-Spaltendaten aus der Ergebnisseite 'Nonlin-Anpassung von Daten 1, Kurve' in die neue X-Spalte ein. Kopiere und füge die Y-Spaltendaten aus der Ergebnisseite 'Transformieren von Daten 2' in die neue Y-Spalte ein. Wählen Sie Analysis und dann 'Analysieren' und 'Transformieren'. OK klicken'. Wählen Sie 'Y-Werte mit Y = Y / X'.
- Wählen Sie Analysis, dann 'Analysieren', 'Spaltenanalyse' und 'Spaltenstatistik'. Wählen Sie OK. Die Ergebnisliste 'Col. Stats of Transform of Data 3 'zeigt unter der' Summe 'Zeile Σ (Int i / MW i ). MW = Molekulargewicht.
- Um die durchschnittliche Telomerlänge (TL) für jede Probe zu berechnen, verwenden Sie dieFormel TL = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ).
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Representative Results
Drei Konzentrationen von DNA (1, 2 und 3 μg), die aus der Zelllinie BJ-hTERT (Telomerase immortalisierte menschliche Vorhautfibroblasten) 22 und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) isoliert wurden, wurden auf Telomerlänge analysiert. Tabelle 1 zeigt die Spurzuweisungen für jede DNA-Probe. Fig. 1 zeigt einen Nukleinsäure-Fluoreszenzfleck des Gels. Die Molekulargewichtsstandards sind deutlich sichtbar. Der Abstand von der Oberseite des Gels zu jedem Molekulargewichtsstandard wurde bestimmt ( Fig. 2 ). Fig. 3 zeigt das Phosphorbild des Gels nach Hybridisierung mit der Telomer-Sonde. Die Telomer-Bänder sind in jeder Spur als Abstriche dargestellt. Gitter von 150 Kartons wurden für jede Spur plus eine Hintergrundspur berechnet ( Abbildung 4 ). Die Analysebereiche entsprechend den Bereichen derGel, das die Telomer-Banden für jeden Satz von Proben enthält, ist in Fig. 5 gezeigt . Getrennte Hintergrundbahnen wurden für jeden Satz von Proben ausgewählt, um sicherzustellen, daß die Hintergrundintensitäten für jeden Probensatz ähnlich waren (Bahnen mit B in Fig. 5 ). Tabelle 2 zeigt die telomere Restriktionsfragmentlängen für jede Probe. Die durchschnittliche Telomerlänge in der hTERT-immortalisierten Zelllinie (BJ-hTERT) ist höher als die, die in menschlichen PBMCs zu sehen ist (vergleiche die Spuren 2, 4 und 6 mit den Spuren 10, 12 und 14 in Abbildung 3 ). Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Menge an genomischer DNA, die in jeder Spur analysiert wird, entscheidend ist, um ein nachweisbares Signal nach der Hybridisierung zu erhalten. Für Proben mit Telomeren, die ziemlich gleichförmig sind ( dh die BJ-hTERT-Zelllinie), wurden so wenig wie 1 & mgr; g nach diesem Verfahren nachgewiesen (obwohl das Signal sehr schwach war). Jedoch für Proben mit Telomeren, die a habenGrößere Varianz ( dh menschliche PBMCs), die minimale Menge an DNA, die ein zuverlässiges Signal liefert, beträgt 2 μg.
Abbildung 1 : Grünes fluoreszierendes Nukleinsäure-gefärbtes Gel. Phosphorbild des getrockneten Agarosegels, gefärbt mit grüner fluoreszierender Nukleinsäurefärbung, die den Ort der DNA-Leiterbänder (Bahnen 1 und 8) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Bestimmung der Markierungsband-Migrationsdistanz . Blaue Pfeile geben den Abstand an, der von der Oberseite des Gels zu ea gemessen wirdCh DNA Leiterband. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 : Phosphorbild von DNA-Proben, die mit der Telomere-Sonde untersucht wurden. Die Spuren 2, 4 und 6 enthalten BJ-hTERT-DNA (1, 2 bzw. 3 μg). Die Spuren 10, 12 und 14 enthalten menschliche PBMC-DNA (1, 2 bzw. 3 μg). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : Rasterort. Screenshot zeigt den Standort von150 Zählgitter für jede analysierte Spur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5 : Analysebereiche Phosphorbild von Telomer-Bändern, die die ausgewählten Analysebereiche für jeden Satz von Proben zeigen. Die Spuren 2, 4 und 6 enthalten BJ-hTERT-DNA; Die Spuren 10, 12 und 14 enthalten menschliche PBMC-DNA. B = Hintergrundbahnen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Fahrbahn | Sample |
| 1 | DNA-Leiter |
| 2 | BJ-hTERT 1 &# 181; g |
| 3 | Leer |
| 4 | BJ-hTERT 2 μg |
| 5 | Leer |
| 6 | BJ-hTERT 3μg |
| 7 | Leer |
| 8 | DNA-Leiter |
| 9 | Leer |
| 10 | PBMCs 1 & mgr; g |
| 11 | Leer |
| 12 | PBMCs 2 & mgr; g |
| 13 | Leer |
| 14 | PBMCs 3 & mgr; g |
| DNA-Proben wurden auf 0,6% Agarosegel aufgetrennt |
Tabelle 1: DNA-Agarose-Probenzuweisungen.
| Probe (Spur) | & Null8721; (Int i ) | Σ (Int i / MW i ) | Durchschnittliche Telomere Länge = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i ) |
| BJTert 1ug (1) | 268691 | 20596 | 13.04578559 |
| BJTert 2ug (2) | 1357000 | 103204 | 13.14871517 |
| BJTert 3ug (3) | 1962000 | 148411 | 13.22004434 |
| PBMC 1ug (4) | -416337 | -142585 | 2.91992145 |
| PBMC 2ug (5) | 286653 | 62845 | 4.561269791 |
| PBMC 3ug (6) | 1880000 | 524123 | 3.586944286 |
Tabelle 2: Durchschnittliche Telomere-Längenberechnungen.
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Discussion
Nach der Elektrophorese ist der genomische DNA-Abstrich höher als 800 bp. Dies kann auftreten, wenn die Restriktionsenzyme fehlerhaft sind oder wenn zusätzliche Enzyme (wie oben beschrieben) benötigt werden. Eine zweite mögliche Erklärung ist, dass das Protein noch an die DNA gebunden ist. Bei der Bestimmung der DNA-Konzentration durch Spektrophotometer sollte das Verhältnis 260/280 etwa 1,8 betragen. Wenn dieses Verhältnis <1,5 ist, gibt es eine Proteinverunreinigung, die die Restriktionsenzymverdauung stören kann. Entweder musste die DNA-Probe re-isoliert werden, oder das Protein müsste mit einer Proteinase K-Verdauung und Phenol: Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol-Präzipitation entfernt werden. Die Verwendung eines kommerziellen DNA-Isolationskits führt routinemäßig zu DNA mit einem Verhältnis von 260/280 von 1,8-1,85.
Nach der Belichtung des Gels auf einen Leuchtstoffschirm werden keine Telomere-Fragmente nachgewiesen. Dies kann aus einer schlechten radioaktiv markierten Telomersonde resultieren, eine unsachgemäße HybridisierungBedingungen oder unzureichende Menge an genomischer Ausgangs-DNA. Bei der Vorbereitung der Telomer-Sonde sollte am Ende der Zentrifugation der G-25-Säule im Durchfluss (die die radio-markierte Telomer-Sonde repräsentiert) leicht nachweisbare Radioaktivität vorhanden sein. Wenn Radioaktivität nicht erkannt wird, dann gab es ein Problem mit der Vorbereitung der Sonde. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Hybridisierungstemperatur 42 ° C nicht übersteigt (um das Schmelzen der Sonde: Templatkomplex zu verhindern) und dass der Hybridisierungspuffer das Gel vollständig in die Hybridisierungskammer eintaucht. Die minimale Menge an genomischer DNA, die nachweisbare Telomere liefert, beträgt 2,0-3,0 μg. Kleinere Mengen an Ausgangsmaterial können nach der Hybridisierung sehr schwach bis kein Signal führen.
Dieses Protokoll erfordert für jede Telomerlängenbestimmung 2-3 μg. Wenn die Proben in doppelter oder dreifacher Ausführung durchgeführt werden sollen, sind 6-12 μg DNA erforderlich. Dies verhindert, dass th Ist die Prozedur, die bei Proben mit begrenzter DNA-Menge verwendet wird. Das Verfahren ist ziemlich mühsam, das 3-4 Tage benötigt, um zu vervollständigen. Die Anzahl der Proben, die gleichzeitig analysiert wurden, ist auf die Anzahl der Gelelektrophoreseanlagen und die Größe des Agarosegelkammes beschränkt. Infolgedessen ist es weniger als ideal für Studien mit einer großen Anzahl von Proben (wie epidemiologische Studien).
DNA-Hybridisierungstechniken von durch Gelelektrophorese getrennten Telomeren bleiben der Goldstandard zur Bestimmung der Telomerlänge. Kein anderes Verfahren misst direkt die Telomerlänge, was zu tatsächlichen Telomergrößen führt.
Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Verfahren. Zuerst muss die DNA-Probe eine gute Integrität haben, dh nicht geschert werden. DNA, die geschert wird, kann zu falschen Telomer-Längen-Ergebnissen führen. Es ist auch wichtig, dass die DNA-Verdauung vollständig ist. Die Verdauung der genomischen DNA sollte zu einem DNA-Abstrich von 800 bp oder weniger führen"Xref"> 2 Um eine ordnungsgemäße Verdauung zu gewährleisten, haben einige Verfahren insgesamt 6 Restriktionsenzyme beschrieben (anstatt nur RsaI und Hinf1, wie in diesem Verfahren beschrieben). Die zusätzlichen Restriktionsenzyme umfassen HhaI, MspI, HaeIII und AluI 2 . Ein zweiter kritischer Schritt ist, dass das Agarosegel lange genug läuft, um eine korrekte Trennung der verdauten DNA zu erhalten. Wenn es eine bessere Trennung gibt, dann gibt es eine bessere Präzision in den Analysen. Die Gellaufzeit sollte lang genug sein, so dass DNA-Fragmente, die 1 Kbp repräsentieren, sich am Boden des Gels befinden ( Abbildung 1 ). Abhängig von der Gelgröße und der Spannung der Elektrophorese kann dies 12 bis 24 h erfordern. Ein dritter kritischer Schritt ist die Hybridisierung. Es muss genügend Hybridisierungspuffer im Kammerrohr vorhanden sein, um das gesamte Gel zu tauchen, wenn das Rohr horizontal ist. Unzureichende Hybridisierungspuffer können zu einer ungleichmäßigen Hybridisierung der Telomer-Sonde führen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bestätigen die Unterstützung der University of Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology gemeinsame Einrichtung, die teilweise durch Auszeichnung P30CA047904 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biologics | |||
| Rsa1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Hinf1, restriction enzyme | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA digestion. Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | electrophoresis grade agarose |
| Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polynucleotide Kinase |
| SYBR Green Nucleic Acid Stain I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | Custom ordered DNA oligonucleotide | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisotope |
| Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit | Qiagen | 13323 | DNA extraction kit |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | For purification of readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | non-ionic synthetic polymer | ||
| Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel electrophoresis |
| Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel electrophoresis |
| Nylon mesh, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE Storage Phosphor Screens | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| Phosphor Screen Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp Hybridzation Incubator | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| Cylindrical hybridization tubes | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer orbital shaker | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Orbital shaker |
| Typhoon 9400 | ABI | For imaging of gels and phosphor screens | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | Version 6.05 | Graphing Program |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Spreadsheet program |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | Spectrophotometer |
References
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