Análise de fragmentos de restrição de terminal modificada para quantificar o comprimento de Telomere usando a hibridação em gel

Summary

Neste artigo, discute-se um protocolo detalhado para quantificar o comprimento do telômetro usando uma análise do fragmento de restrição terminal modificada que fornece uma medição direta rápida e eficiente do comprimento do telômero. Esta técnica pode ser aplicada a uma variedade de fontes celulares de DNA para quantificar o comprimento dos telômeros.

Abstract

Existem várias técnicas diferentes para medir o comprimento dos telômeros, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens. A abordagem tradicional, análise do Fragmento de Restricção de Telomere (TRF), utiliza uma técnica de hibridação de DNA, por meio da qual as amostras de DNA genômico são digeridas com enzimas de restrição, deixando para trás as repetições de DNA de telómero e algum DNA sub-telomérico. Estes são separados por electroforese em gel de agarose, transferidos para uma membrana filtrante e hibridizados com sondas oligonucleotídicas etiquetadas com quimioluminiscência ou radioactividade para visualizar fragmentos de restrição telomere. Esta abordagem, ao mesmo tempo que exige uma maior quantidade de DNA do que outras técnicas como a PCR, pode medir a distribuição do comprimento dos telômeros de uma população de células e permite a medição expressa em kilobases absolutas. Este manuscrito demonstra um procedimento de hibridação de DNA modificado para determinar o comprimento do telômero. O DNA genômico é digerido pela primeira vez com enzimas de restrição (que não cortamTelômeros) e separados por eletroforese em gel de agarose. O gel é então seco e o ADN é desnaturado e hibridado in situ com uma sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridização in situ evita a perda de DNA dos telómeros e melhora a intensidade do sinal. Após a hibridação, os géis são criados utilizando telas de fósforo e o comprimento do telômero é quantificado usando um programa gráfico. Este procedimento foi desenvolvido pelos laboratórios dos Drs. Woodring Wright e Jerry Shay na Universidade do Texas Southwestern ^{1 , 2} . Aqui, apresentamos uma descrição detalhada deste procedimento, com algumas modificações.

Introduction

Telomeres, situados nas extremidades dos cromossomos, são repetições nucleotídicas da sequência TTAGGG (nos cromossomos humanos) que desempenham um papel crítico na proteção da informação genética celular ^{3 , 4 , 5} . Os telômeros são vários milhares de pares de bases e servem para proteger a integridade do resto do cromossomo durante a replicação do DNA. A replicação de cromossomos não é perfeita, resultando nas extremidades do cromossomo não serem completamente copiadas. Essa ineficiência na replicação é denominada "problema de replicação final" e resulta na perda de algumas das repetições de telômeros durante cada rodada de replicação ^{6 , 7} . O comprimento do Telomere pode ser restaurado após a divisão celular pela telomerase, uma enzima que substitui as sequências de telómeros perdidos ^{8 , 9} . A Telomerasa, no entanto, não éAtivado na maioria das células somáticas humanas e, como resultado, ao longo do tempo, os telômeros encurtarão, resultando em senescência celular ¹⁰ . Devido ao encurtamento de telomere, os telômeros são considerados como um biomarcador do envelhecimento e risco de doenças relacionadas com a idade ^{11 , 12} . Além disso, o comprimento do telómero pode ser afetado por fatores genéticos, ambientais e de estilo de vida e outros estímulos como o estresse oxidativo, indicando que o comprimento dos telômeros pode desempenhar um papel como biomarcador em estudos toxicológicos, epidemiológicos e comportamentais ^{13 , 14 , 15} .

Este artigo demonstra uma técnica para medir o comprimento do telômero usando uma análise de fragmento de restrição terminal modificada (TRF) adaptada de Mender e Shay ² e Kimura et al. ¹⁶ , e semelhante a Herbert, Shay e WrigHt ¹ e Haussmann e Mauck ¹⁷ . Tradicionalmente, a análise TRF envolve um procedimento Southern Blot. As transferências de Southern são consideradas como "padrão de ouro" para o estudo do comprimento dos telômeros e são ativamente usadas para examinar o comprimento dos telócitos dos leucócitos em estudos de epidemiologia ¹⁸ . Esta análise TRF usa DNA genômico digerido deixando atrás as repetições de telômeros. Os fragmentos de DNA são então separados por eletroforese em gel, desnaturados e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As sequências de telômeros são hibridizadas com uma sonda oligonucleotídica telomereira. Em vez de transferir os telômeros separados para uma membrana, outras técnicas de TRF usam técnicas de hibridação em gel com e sem desnaturação do DNA. A inclusão da desnaturação é importante quando se considera a detecção de telômeros intersticiais, que foram relatados em algumas espécies ¹⁹ . Os procedimentos que não possuem etapas desnaturantes apenas detectamE as gotas de DNA de cadeia simples em telômeros terminais e não se ligam a seqüências de telômeros intersticiais ¹⁸ .

Além da análise TRF, existem várias outras técnicas para medir o comprimento do telômero, que cada uma tem suas próprias vantagens e desvantagens. A técnica Flow-FISH pode medir o comprimento médio do telômero de células individuais de um tipo de célula distinto usando citometria ^de fluxo ^{16 , 20} . Embora possa marcar com precisão os telômeros com sondas altamente específicas e reduzir o erro humano através da automação, o Flow-FISH é caro, menos eficiente e requer amostras frescas e um técnico altamente qualificado, limitando sua capacidade de estudos epidemiológicos ¹⁶ . Além disso, esse método não explica mudanças potenciais no número de cromossomos na população celular. Outra técnica, qPCR, é amplamente aceita como meio de medir o comprimento dos telômeros para estudos de epidemiologia ²¹ .

O procedimento TRF tem suas próprias deficiências que limitam seu uso para alguns estudos. As técnicas TRF requerem uma grande quantidade de DNA em comparação com outros métodos (entre 2 e 3 μg por amostra). Isto limita as aplicações da técnica ao exame do comprimento do telômero de amostras clínicas para as quais pode ser coletado DNA genômico suficiente e não pode ser usado em amostras de DNA degradadas. Além disso, a análise TRF é dispendiosa e intensiva em mão-de-obra, exigindo 4-5 dias para produzir resultados. No entanto, o TRF produz um baixo coeficiente de variaçãoConcedendo sua reprodutibilidade. Embora este protocolo seja diferente do tradicional Southern Blot (utilizando hibridação em gel in situ ), as duas técnicas são fundamentalmente as mesmas.

A técnica apresentada aqui é uma combinação de uma transferência de Southern e hibridação em gel; Associando o passo de desnaturação do DNA de Southern Blots com a hibridação em gel. Esta combinação tem o benefício adicional da intensidade do sinal da sonda melhorada em comparação com o Southern Blot e produziu consistentemente resultados quantificáveis ​​dentro do nosso laboratório. Além disso, o uso de sondas radioativas ao invés de sondas quimioluminescentes produz maior intensidade de sinal e permite a visualização e quantificação com um agente de fosforilação, tornando as análises do TRF fáceis de usar.

Protocol

1. Extração de DNA Genômico

1. Execute uma extração de DNA genômico das células (aqui, linha celular BJ-HTERT) para ser analisado usando um kit comercial de extração de DNA, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Medir a concentração de DNA com um espectrofotômetro. Se a concentração de DNA for inferior a 100 μg / mL, precipite o ADN com etanol e ressuspenda-se num volume de tampão TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM (ácido etilenodiaminotetraacético), pH 8,0), para assegurar uma concentração de ADN de 100-600 μg / mL).

2. Avaliação da Integridade do DNA

NOTA: Esta porção do protocolo descreve uma avaliação da integridade do DNA usando um sistema de eletroforese em gel com um gel de 11 cm x 14 cm. Outros sistemas e tamanhos de gel também podem ser usados, mas a tensão e o tempo de migração do DNA podem variar.

1. Prepare um gel de agarose a 1% combinando 1 g de agarose com eletroforese em 100 mL de tampão 1x TAE (Tr. 40 mMÉ base; Ácido acético 20 mM; EDTA 2 mM; PH 8,5) e microondas até que a agarose seja dissolvida e a solução é clara. Arrefecer a solução à temperatura ambiente até atingir 50 ° C (aproximadamente 15-20 min).
2. Enquanto a solução de agarose estiver esfriando, prepare a bandeja de fundição de gel, adicionando os portões da extremidade de fundição à bandeja de fundição. Para evitar vazamento de agarose, esfriar os portões de extremidade para 4 ° C antes de se conectar à bandeja de fundição.
3. Uma vez que a solução de agarose arrefeceu para 50 ° C, adicione 10 μL de brometo de etídio (10 mg / mL em dH ₂ O) e despeje a solução de agarose na bandeja de fundição de gel. Adicione o pente à bandeja de fundição.
4. Permitir que a solução de agarose dure por 45 minutos à temperatura ambiente.
5. Prepare amostras de DNA para eletroforese, diluindo 25 ng de DNA genômico usando tampão 1x TE para um volume final de 9 μL e adicione 1 μL de 10 x Colorante de carga (0,25% (p / v) de azul de bromofenol, xileno a 0,25% (p / v) Cianol FF, 30% (v / v) de glicerol). Misture bem.
6. Execute a migração do DNA a 100 V por aproximadamente 2 h ou até que o corante azul de bromofenol seja aproximadamente a meio do gel.
7. Imagem do gel usando um transiluminador de luz ultravioleta ou equivalente.
   NOTA: amostras de DNA com boa integridade têm bandas de alto peso molecular sem manchas (que é devido ao DNA cortado ou quebrado). Se as bandas de DNA são manchadas, elas têm baixa integridade e não são adequadas para a análise Southern Blot, e o DNA deve ser re-isolado com células novas.

3. Digestão genômica de DNA

1. Execute a digestão do DNA genômico em um volume final de 20-40 μL.
   NOTA: Volumes maioresQue 40 μL transbordarão os poços do gel de agarose.
   1. Combine 3 μg de DNA genômico e a quantidade adequada de 10x tampão de digestão de DNA (fornecido com as enzimas de restrição) para que a concentração final seja 1x, em um microtube. Adicione 1 μL de enzima de restrição RsaI (10 000 U / mL) e 1 μL de enzima de restrição HinfI (10 000 U / mL) a cada tubo. Ajuste o volume final usando H _{2 O} esterilizado e desionado. Misture bem. Centrifugar brevemente (10 - 15 s a 16,000 xg) para garantir que todos os componentes estejam na parte inferior do tubo.
2. Incubar as digestões a 37 ° C por ≥16 h. Após a digestão, armazene o DNA digerido a 4 ° C ou -20 ° C por não mais de 2 dias, se necessário ¹⁷ .

4. Eletroforese em gel genômico de DNA

NOTA: Esta parte do protocolo descreve um procedimento para o uso de um sistema de eletroforese em gel de 20 cm x 25 cm. Electro eletrodo diferenteOs sistemas de phoresis podem ser usados, mas várias variáveis ​​podem precisar ser modificadas, incluindo a tensão, o tempo de migração e a quantidade de tampão de eletroforese adicionado ao sistema para produzir resultados ótimos.

1. Preparar 0,6% de solução de agarose combinando 2,25 g de agarose em grau de eletroforese em gel com 375 mL de tampão de eletroforese, seja 1x TAE ou TBE 0,5x (base de Tris 110 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3).
   NOTA: Para telômeros inferiores a 8 000 kB, é recomendado 0,5x TBE, enquanto que é recomendado um TAE para telômeros entre 8 000 kB e 20 000 kB ¹ .
2. Microondas a solução até a dissolução da agarose e a solução é clara. Deixe a solução arrefecer durante 15 a 20 minutos à temperatura ambiente ou até a agarose atingir 50 ° C.
3. Enquanto a solução de agarose está arrefecida, prepare o sistema de eletroforese em gel para moldagem em gel como descrito no passo 2.2. Despeje a solução de gel de agarose em uma bandeja de fundição de gel. Coloque um pente naO gel. Deixe o gel endurecer durante 45 minutos descoberto à temperatura ambiente.
4. Prepare as amostras de DNA digeridas para eletroforese. Para uma reacção de 40 uL, adicione 0,4 μL de 10 x tintura de carga em cada amostra de ADN digerido. Centrifugue brevemente (10-15 s, 16,000 xg) para garantir que toda a solução esteja na parte inferior do tubo.
5. Prepare o sistema de eletroforese em gel para a migração de DNA. Remova os portões de extremidade e pente do gel. Preencha o sistema de eletroforese em gel com 1x TAE ou TBE 0,5x até a linha de enchimento, assegurando que o gel esteja completamente submerso no tampão.
6. Carregue os poços do gel com as amostras de DNA, de modo que haja um poço branco entre as amostras. Evite causar bolhas ou perfurar o gel. Adicione 10 μL de uma escada de DNA em poços nas extremidades opostas do gel.
   NOTA: O tipo de escada de DNA dependerá do comprimento dos telômeros, que variará de pessoa para pessoa e entre fontes celulares.
7. Execute a eletroforese em gel em 150 V por 30 minutos para mover rapidamente o DNA para o gel; Depois ajuste a tensão para 57 V e corra durante 18-24 h.

5. Gel de imagem fluorescente e hibridação

1. Após 18-24 h, desligue a fonte de energia de eletroforese em gel. Retire a bandeja de fundição de gel com o gel do tampão de eletroforese. Corte o canto superior direito do gel para servir como referência para a orientação do gel.
2. Prepare um pedaço de papel de filtro cortando o papel para ser um tamanho um pouco maior do que o gel. Coloque o papel de filtro em cima do gel na bandeja de vazamento e permita que o papel absorva o excesso de solução no gel. Retire cuidadosamente as bolhas de ar entre o papel de filtro e o gel usando uma pipeta como um rolo para espremer as bolhas através dos lados.
3. Retire o gel da bandeja de fundição, deslizando o gel e filtre o papel para que o papel fique por baixo do gel. Transfira o gel com o papel de filtro para um secador de gel e cubra oGel com plástico. Remova todas as bolhas de ar entre a película plástica e o gel usando uma pipeta como rolo.
4. Secar o gel durante 2 h a 50 ° C.
5. Uma vez seco, retire a embalagem de plástico e transfira o gel e filtre o papel para um prato de vidro contendo 250 mL de água desionizada (suficiente para cobrir o gel). Remova cuidadosamente o papel de filtro e incube o gel à temperatura ambiente durante 15 min. O gel será fino, firme e fácil de manipular sem rasgar.
6. Preparar 5x SSC solução (750 mM NaCl; 75 mM citrato de sódio) em água desionizada.
7. Coloque o gel sobre uma malha de nylon (12 in x 12 in). Enrole a malha de nylon e o gel em conjunto, certificando-se de que o gel não esteja em contato consigo mesmo. Coloque a malha e o gel em um tubo de hibridação ( por exemplo , 12 em tubo com 1,5 de diâmetro).
   NOTA: Quando devidamente enrolado, o gel estará em contato com a malha de nylon em ambos os lados.
8. Combine 100 mL de 5x SSC e 12 μL de nucleido fluorescente verde aCid mancha, e coloque no tubo de hibridação. Proteja a solução da luz e incube durante 30 min a 42 ° C num forno de hibridação com rotação.
9. Remova a malha / gel de nylon do tubo de hibridação, role-a e coloque-a em um prato de vidro contendo 250 mL de água desionizada e remova suavemente a malha de nylon. Imagine o gel usando um fosforifador. Use as configurações fluorescentes: 520 BP, 40 Azul e 488 nm. Coloque o tubo fotomultiplicador (PMT) em 375, o plano focal para +3 mm e a sensibilidade ao normal. Salve a imagem em um arquivo.

6. Hibridação

1. Prepare a sonda radioativa de telomere.
   1. Combine 2 μL (2 ng) de sonda telomere (5- (CCC TAA) ₄ 3 '), 2,5 μL de 10x tampão de reação de polinucleótido quinase, 3 μL de γ ³² P-dATP (6.000 Ci / mmol), 4 μL de T4 Água desionizada esterilizada e polinucleotídica quinase e DNase livre para um volume final de 20 μL em um micrTubo de ocentrifugação.
      Cuidado: siga a segurança e regulamentos radioativos das instalações ao usar a radioatividade.
2. Centrifugue brevemente (10-30 s a 16.000 xg) e incuba em banho-maria a 37 ° C durante 1 h. Centrifugar para 10-30 s a 16.000 xg e incubar a 65 ° C durante 20 minutos para parar a reação.
3. Usando uma coluna de microspin de cromatografia G-25, misture o conteúdo da coluna por vortex, depois centrifugue durante 1 min a 700 xg à temperatura ambiente. Descarte o filtrado.
4. Carregar a solução de sonda radioativa na coluna de cromatografia G-25 e centrifugar durante 2 minutos a 700 x g. Salve o filtrado.
   NOTA: Mantenha o filtrado, pois contém a sonda telomere radioativa. A sonda radioativa pode ser armazenada a 4 ° C, se necessário.
5. Prepare 250 mL de solução desnaturante composta de NaCl 1,5 M e NaOH 0,5 M em água desionizada estéril.
6. Coloque o gel em um prato de vidro contendo 250 mL de solução de desnaturação e incubaçãoComeram durante 15 minutos à temperatura ambiente. Remova a solução de desnaturação e substitua-os por 250 mL de água desionizada estéril. Incubar durante 10 minutos em um agitador orbital (40 - 50 rpm) à temperatura ambiente.
7. Prepare 250 mL de solução de neutralização composta de 1,5 NaCl e 0,5 M de Tris-ácido clorídrico, pH 8,0 em água desionizada estéril.
8. Remova a água desionizada e substitua-a por 250 mL de solução de neutralização e incube durante 15 minutos à temperatura ambiente.
9. Durante a incubação na solução de neutralização, prepare 50 mL de solução de hibridação composta por 5x SSC, solução de 5x Denhardt (0,1% de polímero sintético iônico, 0,1% de polivinilpirrolidina, 0,1% de albumina de soro bovino), fosfato dissódico 10 mM (Na2HPO ₄ ) e pirazófato de sódio 1 mM de decaidrato tetrabásico (Na4P2O7.10H2O) em água desionizada estéril.
10. Enrole o gel em malha de nylon e coloque no tubo de hibridação (passo5.7). Adicionar 20 mL da solução de hibridação e incubar em um forno de hibridação a 42 ° C durante 10 minutos com rotação.
11. Remova a solução de hibridação e substitua por 20 mL de solução de hibridação fresca. Adicione a totalidade da sonda telomere e incuba em um forno de hibridação a 42 ° C durante a noite com rotação.

7. Lavagem de gel, exposição à tela de fósforo e imagem de rádio

1. Preparar 500 mL de solução de SSC 2x (NaCl 300 mM, citrato de sódio 30 mM) em água desionizada estéril.
2. Preparar 250 mL de SSC 0,1x (NaCl 15 mM, citrato de sódio 1,5 mM) e 0,1% de sulfato de dodecil de sódio (SDS) em água desionizada.
3. Remova o gel e a malha do tubo de hibridação e coloque em um prato de vidro contendo 250 mL de SSC 2x. Desenrolar e remover a malha de nylon do prato. Coloque o prato de vidro em um agitador orbital e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
4. Remova o 2x SSC e substitua por 250 mL de 0.1x SSC e 0.1% de solução SDS e incubar durante 15 minutos em um agitador orbital à temperatura ambiente.
5. Durante a incubação, exponha a tela Phosphor ao apagador de imagem por 15 min.
6. Remova o SSC 0.1x e a solução SDS 0,1% e substitua-os por 250 mL de SSC 2x. Incube durante 15 minutos em um agitador orbital.
7. Retire o gel da solução 2x SSC e envolva o gel em plástico ou coloque em uma bolsa termicamente selável. Remova todas as bolhas e bolsos de ar entre o gel e a embalagem de plástico ou bolsa de plástico. Coloque o gel em uma cassete de exposição com a tela Phopshor. Exponha a tela de Fósforo no gel durante a noite.
8. Imagem da tela Phosphor exposta usando um fosforifador.

8. Quantificação do comprimento do Telomere

1. Abra o arquivo fosforilador contendo a imagem fluorescente do gel verde-fluorescente de ácido nucleico verde ( Figura 1 ).
2. Selecione 'Ferramentas' e depois 'Distância de Pixel9 ;. Usando o mouse, desenhe uma linha da parte inferior do gel bem para o meio da primeira faixa de marcador e grave a distância. Repita este procedimento para cada faixa de marcador ( Figura 2 ). Essas distâncias serão usadas no programa de gráficos, conforme descrito abaixo.
3. Abra a imagem fosforada do gel radiomarcado ( Figura 3 ). Selecione 'Gerenciador de objetos' e depois 'Grade'. Defina a grade para 1 coluna e 150 linhas. Ajuste a grade de modo que ele se estenda da parte superior do gel até o fundo do gel. Ajuste a largura da grade para igualar a largura da pista, clicando na borda da grade e arrastando a largura da grade para igualar a largura da pista.
4. Copie esta grade (para que a largura e a altura das caixas permaneçam iguais) e mova a segunda grade para uma faixa vazia (para fins de fundo). Continue a copiar e mover grades adicionais para pistas de amostra adicionais.
   NOTA: Quando terminar, deve haverGrades para cada faixa de amostra e uma grade de uma pista vazia para o fundo ( Figura 4 ).
5. Selecione 'Análise' e depois 'Relatório de volume'. Selecione todas as grelhas para o relatório. Uma vez que o relatório de volume é exibido, clique duas vezes no relatório para ativar a planilha. Salve o arquivo da planilha. Os dados para este arquivo serão Sob a faixa 'Volume'.
6. Abra um programa gráfico apropriado e crie um novo dado e tabela. Selecione 'Y: Digite e trace um único valor Y para cada ponto' e selecione 'Criar'.
7. Rotule a primeira coluna (Coluna X) como "Distância medida" e rotular a segunda coluna (Coluna Y) como "Peso Molecular". Digite os pesos moleculares do marcador de cada faixa de marcador na coluna Y. Digite as distâncias de migração obtidas no passo 8.2 correspondentes a cada marcador de peso molecular.
8. Vá para 'Análise' e selecione 'Analisar' e depois 'Regressi não-linear'On (curve fit) 'e selecione' OK '. Na próxima tela, selecione 'Exponencial e depois' Decadência de uma fase '. Selecione a guia 'Intervalo' e digite '150' em 'número de pontos que definem a curva' e marque 'Criar uma tabela de coordenadas XY para exportar ou copiar a curva para outro programa'.
   NOTA: O resultado, "ajuste não linear de dados 1", contém o peso molecular para cada distância na linha Y.
9. Para análise das pistas da amostra, selecione uma área de análise que esteja acima e abaixo das bandas de telómero reais. Não use todo o comprimento da pista ( Figura 5 ). Determine os locais da grade para a área de análise de cada faixa.
10. Selecione 'Arquivo', 'Novo' 'Criar Nova Tabela e Gráfico'. Selecione 'Y: Digite e trace um único valor Y para cada ponto' e selecione 'Criar'. Copie e cole os valores de volume da linha de fundo (valores de intensidade) do arquivo de planilhaNa primeira coluna (X) e os valores de volume (valores de intensidade) da faixa de amostra para a primeira coluna Y. Se houver várias pistas de amostra, copie cada conjunto de valores de volume do arquivo de planilha em colunas Y adicionais no programa de graficação Arquivo.
11. Exclua os valores da coluna de fundo (X) e de cada faixa de amostra (Y) que estão fora das áreas de análise determinadas no passo 8.8.
    NOTA: A tabela de dados deve conter apenas valores nas áreas de grade correspondentes às áreas de análise.
12. Selecione Análise, depois 'Analisar' e 'transformar'. Clique em 'OK'. Selecione 'Transformar os valores de Y usando Y = YX'. Isso transformará os dados no Data 2 (valor de intensidade transformada (Y) = intensidade da amostra (Y) - intensidade de fundo (X)).
    1. Selecione Análise, depois 'Analisar', 'Análise de Colunas' e 'Estatísticas de Colunas'. Selecione OK. A guia de resultados 'Col. Estatísticas de Transform of Data 2 'mostraSob a linha 'Soma', Σ (Int _i ).
13. Selecione 'Arquivo', 'Novo', 'Criar Nova Tabela e Gráfico'. Selecione 'Y: Digite e trace um único valor Y para cada ponto' e selecione 'Criar'. Copie e cole os dados da coluna Y da página de resultados 'Nonlin fit of Data 1, Curve' na nova coluna X. Copie e cole os dados da coluna Y da página de resultados 'Transformar dados 2' na nova coluna Y. Selecione Análise, então, "Analisar" e "Transformar". Clique em 'OK'. Selecione 'Transformar Y valores usando Y = Y / X'.
    1. Selecione Análise, depois 'Analisar', 'Análise de Colunas' e 'Estatísticas de Colunas'. Selecione OK. A guia de resultados 'Col. Estatísticas de Transform of Data 3 'mostra sob a linha' Sum ', Σ (Int _i / MW _i ). MW = peso molecular.
14. Para calcular o comprimento médio de telómero (TL) para cada amostra, use oFórmula TL = Σ (Int _i ) / Σ (Int _i / MW _i ).

Representative Results

Foram analisadas três concentrações de DNA (1, 2 e 3 μg) isoladas da linha celular BJ-HTERT (fibroblastos de prepúcio humano imortalizado com telomerase) ²² e células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) para o comprimento do telômero. A Tabela 1 mostra as atribuições da pista para cada amostra de DNA. A Figura 1 mostra uma mancha fluorescente de ácido nucleico do gel. Os padrões de peso molecular são claramente visíveis. A distância do topo do gel para cada padrão de peso molecular foi determinada ( Figura 2 ). A Figura 3 mostra a imagem fosforada do gel após a hibridação com a sonda telomere. As bandas de telômeros são mostradas como esfregaços em cada pista. As redes de 150 caixas foram calculadas para cada pista mais uma pista de fundo ( Figura 4 ). As áreas de análise correspondentes às áreas doO gel contendo as bandas de telómero para cada conjunto de amostras é mostrado na Figura 5 . As pistas de fundo separadas foram selecionadas para cada conjunto de amostras para garantir que as intensidades de fundo fossem semelhantes para cada conjunto de amostras (pistas marcadas com B na Figura 5 ). A Tabela 2 mostra os comprimentos de fragmentos de restrição telomere para cada amostra. O comprimento médio dos telômeros na linha celular imortalizada hTERT (BJ-HTERT) é maior que o observado em PBMCs humanas (compare as pistas 2, 4 e 6 com as pistas 10, 12 e 14 na Figura 3 ). Esses resultados também demonstram que a quantidade de DNA genômico analisado em cada faixa é fundamental para a obtenção de um sinal detectável após a hibridação. Para amostras com telômeros que são bastante uniformes ( ou seja , a linha celular BJ-HTERT), apenas 1 μg foi detectável usando este procedimento (embora o sinal fosse muito fraco). No entanto, para amostras com telômeros que têm umaVariância maior ( isto é , PBMCs humanas), a quantidade mínima de DNA que fornece um sinal confiável é de 2 μg.

Figura 1 : Gel manchado de ácido nucleico fluorescente verde. Fosfimagem do gel de agarose seco corado com mancha de ácido nucleico fluorescente verde mostrando a localização das bandas de escadas de DNA (pistas 1 e 8). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2 : Determinação da distância de migração da banda de marcador . As setas azuis indicam a distância medida a partir do topo do gel para aBanda de escada de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 3 : Imagem fosforo de Amostras de DNA Probed com a sonda Telomere. As pistas 2, 4 e 6 contêm DNA BJ-HTERT (1, 2 e 3 μg, respectivamente). As pistas 10, 12 e 14 contêm DNA de PBMC humano (1, 2 e 3 μg, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 4 : Local da grade. Screenshot mostrando a localização de150 grades de contagem para cada faixa analisada. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 5 : Áreas de análise. Fosfimagem de bandas de telómeros mostrando as áreas de análise selecionadas para cada conjunto de amostras. As pistas 2, 4 e 6 contêm DNA BJ-HTERT; As pistas 10, 12 e 14 contêm DNA de PBMC humano. B = pistas de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

faixa	Amostra
1	Escada de DNA
2	BJ-HTERT 1 &# 181; g
3	Em branco
4	BJ-HTERT 2 μg
5	Em branco
6	BJ-HTERT 3 μg
7	Em branco
8	Escada de DNA
9	Em branco
10	PBMCs 1 μg
11	Em branco
12	PBMCs 2 μg
13	Em branco
14	PBMCs 3 ug
	Amostras de DNA separadas em 0,6% de gel de agarose

Tabela 1: Atribuições de Amostras de Agarose de DNA.

Amostra (Pista)	& #8721; (Int i )	Σ (Int i / MW i )	Comprimento médio de Telomere = Σ (Int i ) / Σ (Int i / MW i )
BJTert 1ug (1)	268691	20596	13.04578559
BJTert 2ug (2)	1357000	103204	13.14871517
BJTert 3ug (3)	1962000	148411	13.22004434
PBMC 1ug (4)	-416337	-142585	2.91992145
PBMC 2ug (5)	286653	62845	4.561269791
PBMC 3ug (6)	1880000	524123	3.586944286

Tabela 2: Cálculos médios de comprimento de Telomere.

Discussion

Após a eletroforese, o esfregaço de DNA genômico é superior a 800 pb. Isso pode ocorrer se as enzimas de restrição estiverem com defeito ou se forem necessárias enzimas adicionais (conforme descrito acima). Uma segunda explicação possível é que a proteína ainda está ligada ao DNA. Ao determinar a concentração de DNA por espectrofotômetro, a razão 260/280 deve ser em torno de 1,8. Se essa proporção for <1,5, existe uma contaminação protéica que pode interferir com a digestão das enzimas de restrição. Ou a amostra de DNA precisaria ser re-isolada, ou a proteína precisaria ser removida com uma digestão com proteinase K e extração de fenol: clorofórmio seguido de precipitação com etanol. O uso de um kit comercial de isolamento de DNA rotineiramente resulta em DNA com uma razão 260/280 de 1.8-1.85.

Após a exposição do gel a uma tela de fósforo, não há fragmentos de telômeros detectados. Isso pode resultar de uma baixa sondagem de telômeros marcada por radio, hibridação imprópriaCondições ou quantidade insuficiente de DNA genômico inicial. Ao preparar a sonda telomereira, no final da centrifugação da coluna G-25, deve haver uma radioatividade prontamente detectável no fluxo (representando a sonda telomere radioelizada). Se a radioatividade não for detectada, então houve um problema com a preparação da sonda. Também é importante garantir que a temperatura de hibridação não exceda 42 ° C (para evitar a fusão da sonda: modelo complexo) e que o tampão de hibridação imersa completamente o gel na câmara de hibridação. A quantidade mínima de DNA genômico que fornece telômeros detectáveis ​​é 2,0-3,0 μg. Pequenas quantidades de material de partida podem resultar em muito fraco para nenhum sinal após a hibridação.

Este protocolo requer 2-3 μg para cada determinação de comprimento de telômetro. Se as amostras devem ser executadas em duplicado ou triplicado, é necessário 6-12 μg de DNA. Isso evita que O procedimento é usado em amostras com quantidade limitada de DNA. O procedimento é bastante laborioso, exigindo 3-4 dias para ser concluído. O número de amostras analisadas ao mesmo tempo é limitado ao número de equipamentos de eletroforese em gel e ao tamanho do pente de gel de agarose. Como resultado, é menos do que ideal para estudos que empregam um grande número de amostras (como estudos epidemiológicos).

As técnicas de hibridização de DNA de telômeros separados por eletroforese em gel permanecem o padrão-ouro para determinar o comprimento do telômero. Nenhum outro procedimento mede diretamente o tamanho do telómero, resultando em tamanhos de telômeros reais.

Existem vários passos críticos neste procedimento. Primeiro, a amostra de DNA deve ter boa integridade, ou seja , não cortada. O DNA que é cortado pode resultar em falsos resultados de comprimento de telómero. Também é importante que as digestões de DNA estejam completas. A digestão do DNA genômico deve resultar em um esfregaço de DNA de 800 pb ou menos"Xref"> 2. Para garantir uma digestão adequada, alguns procedimentos descreveram um total de 6 enzimas de restrição (em vez de apenas RsaI e Hinf1 como descrito neste procedimento). As enzimas de restrição adicionais incluem HhaI, MspI, HaeIII e AluI ² . Um segundo passo crítico é permitir que o gel de agarose funcione o suficiente para obter uma separação adequada do DNA digerido. Se houver uma melhor separação, então há uma melhor precisão nas análises. O tempo de funcionamento do gel deve ser suficientemente longo para que os fragmentos de DNA que representem 1 Kbp estejam localizados na parte inferior do gel ( Figura 1 ). Dependendo do tamanho do gel e da tensão da eletroforese, isso pode exigir 12 a 24 h. Um terceiro passo crítico é a hibridação. Deve haver um buffer de hibridação suficiente no tubo da câmara para mergulhar todo o gel quando o tubo estiver horizontal. Níveis insuficientes de buffer de hibridação podem resultar em hibridação desigual da sonda telomere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biologics
Rsa1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0167S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Hinf1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0155S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Seakem GTG Agarose	Lonza	50071	electrophoresis grade agarose
Optikinase	affymetrix	78334X 500 UN	T4 Polynucleotide Kinase
SYBR Green Nucleic Acid Stain I	ThermoFisher Scientific	S7567	Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kB	Fisher Scientific	BP2580100
C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)	Integrated DNA Technologies		Custom ordered DNA oligonucleotide
Gamma-ATP-P32	Perkin Elmer	BLU502Z	Radioisotope
Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit	Qiagen	13323	DNA extraction kit
GE Illustra Microspin G-25 column	GE Healthcare Life Sciences	27-5325-01	For purification of readioactive oligo probe
Ficoll 400			non-ionic synthetic polymer
Equipment/Software
Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)	ThermoFisher Scientific	A5	Gel electrophoresis
Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)	Corel Life Sciences	11068020	Gel electrophoresis
Nylon mesh, 50, 12" x 12"	Ted Pellam, Inc	41-12105
GE Storage Phosphor Screens	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-75
Phosphor Screen Exposure Cassette	GE Healthcare Life Sciences	63-0035-44
Isotemp Hybridzation Incubator	Fisher Scientific	13-247-20Q
Cylindrical hybridization tubes	Fisher Scientific	13-247-300
The Belly Dancer orbital shaker	Sigma-aldrich	Z768499-1EA	Orbital shaker
Typhoon 9400	ABI		For imaging of gels and phosphor screens
GraphPad Prism 6	GraphPad	Version 6.05	Graphing Program
Microsoft Excel	Microsoft	Office 365	Spreadsheet program
Nanodrop	Thermo Scientific	Nanodrp 2000	Spectrophotometer