Summary
Nous avons décrit un protocole permettant d’effectuer une hépatectomie partielle (PHx) et la transplantation de cellules par l’intermédiaire de rate en clin de œil. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris. Dans ce protocole, une incision est faite pour exposer et résection du lobe gauche du foie suivi d’une autre incision pour la transplantation intra-splénique de cellules.
Abstract
Une hépatectomie partielle est une méthode polyvalente et reproductible pour étudier la régénération du foie et l’effet de la thérapeutique de la cellule en fonction dans diverses conditions pathologiques. Une hépatectomie partielle facilite également l’augmentation de prise de greffe et la prolifération des cellules transplantées en accélérant la néovascularisation et la migration des cellules vers le foie. Nous décrivons ici un protocole simple pour effectuer une hépatectomie 30 % et la transplantation de cellules dans la rate d’un diabétique/sévère non obèses combinées NOD immunodéficients. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris.
Dans cette procédure, deux petites incisions sont pratiquées. La première incision est d’exposer et de résection du lobe gauche du foie, et une autre petite incision est faite pour exposer la rate pour la transplantation intra-splénique de cellules. Cette procédure ne nécessite pas des compétences chirurgicales spécialisées, et il peut être complété en 5-7 minutes avec moins de stress et douleurs, une récupération plus rapide et meilleure survie. Nous avons démontré la transplantation des hépatocytes isolés d’une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant des souris (transgéniques C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), mais aussi des hépatocytes comme des cellules d’origine humaine (NeoHep) en partiellement hépatectomisés clin de œil. Souris SCID.
Introduction
Actuellement, la transplantation hépatocytaire est proposée comme une alternative à la transplantation d’organes entiers pour le traitement des patients ayant des troubles hépatiques graves. On croit qu’il peut combler les patients de transplantation organes entiers1. En plus de l’allogreffe hépatocytes2, hépatocytes xénogène3 et dérivées de cellules souches4 les hépatocytes sont également étudiés dans des modèles animaux. Dans ce contexte, la domiciliation et la greffe le potentiel des cellules transplantées chez le receveur est un critère important pour la thérapie cellulaire basé dans l’insuffisance hépatique aiguë (AHF).
Pour enquêter sur la transplantation d’hépatocytes ou cellules semblables à des hépatocytes5, AHF est créée dans un modèle animal par chirurgie6 ou pharmacologiques7 procédures, suivies par la transplantation de cellules. Pour faire un modèle animal de l’AHF de réactifs pharmacologiques, nombreux hépatotoxines comme d-galactosamine8, acétaminophène9, tétrachlorure de carbone10, thioacétamide11, concanavaline A12, lipopolysaccharide13 , etc.., ont été utilisés. Dans cette liste, chaque réactif génère un ensemble unique de fonctionnalités pour AHF, mais malheureusement aucun réactif unique n’imite l’AHF humaine. En outre, l’AHF induite par les hépatotoxines prend beaucoup de temps, ce qui place les animaux sous stress chronique, et des résultats reproductibles sont difficiles à obtenir.
En revanche, l’intervention chirurgicale d’une hépatectomie partielle (PHx) est dépendante de compétence, et des résultats reproductibles sont faciles à obtenir après avoir développé les compétences requises. Pour provoquer l’AHF par elle seule une intervention chirurgicale, la résection de plus de 70 % du foie est nécessaire ; Toutefois, moins d’une hépatectomie 70 % peut encore servir pour étudier la prise de greffe et la prolifération des transplanté des cellules du foie pour analyser leur capacité thérapeutique lors de lésions du foie14. La transplantation des hépatocytes ont été exécutées après hépatectomie par le péritoine15, queue veine16,17de la veine hépatique ou la rate18. Actuellement, la perfusion veineuse hépatique et la transplantation intra-splénique des hépatocytes sont les procédures privilégiées, car ils sont plus faciles à reproduire.
Dans cet article, nous avons décrit une procédure pour une hépatectomie partielle de 30 % en clin de œil. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris dont le lobe gauche du foie est excisé. Il est suivi par la transplantation de 0,2 millions hépatocytes de souris (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) exprimant GFP ainsi que leur origine humaine NeoHep19 dans la rate. Cette procédure conduit à la prise de la greffe des cellules transplantées dans le foie. Cette procédure est la moins invasive et une technique peu douloureuse.
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Protocol
Les procédures présentées dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité d’éthique animale institutionnel du National Institute of Immunology, New Delhi. Le numéro de série de référence de l’agrément est AIVE #319/13.
Remarque : Il y a d’excellentes ressources sur les procédures de chirurgie générale20 et des protocoles spécifiques pour chirurgie de rongeur,21. Pour ceux qui font de la chirurgie animale pour la première fois, il est recommandé de pratiquer intensivement des interventions chirurgicales sur des mannequins avant d’utiliser sur les animaux.
1. préparation
- Avant l’expérience, garder salin stérile tamponnée au phosphate (PBS) ou prêt saline.
- Assembler un kit de chirurgie contenant ciseaux, pinces dentelées, forceps tissue, coton, cotons-tiges, fils de nylon et différentes micro porte-aiguilles. Le kit de chirurgie d’autoclave. Spécial il faut si un clin de œil immunodéprimé. La souris SCID est incluse dans le protocole.
- Effectuer l’ensemble de la procédure expérimentale, de la préparation à la fin de la chirurgie, de la bio-sécurité de classe I du cabinet.
- Peser un clin de œil. Souris SCID 6-8 semaines avant la chirurgie. Pesant entre 14-18 g de souris sont utilisées dans cette étude.
- Raser la région abdominale supérieure centrale et hypocondriaque de la souris avec la tondeuse. Appliquer uniformément dans toute la région, la crème épilatoire avec une spatule pour supprimer complètement les poils taillés. Enlever les poils doucement à l’aide d’un morceau de coton stérile humide après 2 à 5 min.
- Placez votre souris dans la chambre de l’isoflurane et ouvrir le robinet de la bouteille d’oxygène. Maintenir le débit d’oxygène à raison de 4 L/min et la vaporisation isoflurane à 4 % pour induire l’anesthésie.
- Veiller à ce que la souris a été anesthésiée convenablement en pinçant doux orteil.
- Placez une planche en chirurgie à l’intérieur d’une prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Mettez l’animal sur le plateau de chirurgie, de sorte que la partie ventrale de la souris vers le haut et la partie antérieure de la souris est placée à l’intérieur du cône de nez connecté à l’alimentation en oxygène et isoflurane.
- Réduire la vaporisation isoflurane à 2 % et l’entretenir tout au long de l’intervention chirurgicale.
- Désinfecter la peau de la souris et stériliser en les essuyant avec du coton stérile imbibé d’éthanol à 70 %.
2. opération chirurgicale
-
Hépatectomie partielle
- Faire une incision transversale d’environ 1 cm dans la peau juste sous le sternum, perpendiculaire au processus xiphoïde et parallèle à la cage thoracique, avec l’aide de ciseaux d’exploitation droites.
- Doucement, séparer la peau attachée avec la couche de muscles abdominaux dans le voisinage de la zone incisée avec une pince ou conseils de coton humide stérile d’établir une distinction entre la peau et la couche de muscles abdominaux. Faites tremper la région intradermique avec du PBS à l’aide de bouts de coton stérile pour échapper à la dessiccation.
- Exposer la zone du lobe gauche en douceur en faisant une incision transversale à travers la couche péritonéale juste en dessous de la xiphoïde. Deux bouts de coton humide permet d’exposer et de soulever le lobe gauche du foie.
- Placez un des conseils de coton sur la partie abdominale de la coupe, puis placez une autre astuce de coton sur le côté du diaphragme. Appuyez la pointe vers le diaphragme doucement et donner un coup de pouce coulissant par l’autre extrémité pour soulever le lobe gauche du foie.
- Glisser un fil de nylon avec une boucle dans le lobe gauche levé et glisser la boucle vers la base du lobe gauche près du hile, avec l’aide des conseils micro-pince ou coton. Pousser doucement vers le bas de la boucle de fil de nylon à la base du lobe gauche.
- Nouer les deux extrémités du fil en nylon sur le dessus du lobe gauche en utilisant un porte-aiguille de microchirurgie et la pince micro. Faire deux nœuds supplémentaires de l’autre côté.
- Disséquer sur le lobe lié à l’aide de ciseaux. N’essayez pas de couper de très près le thread. Dans le cas où la procédure dure plus de 5 min, gardez la cavité péritonéale et les organes humide avec du PBS stérile pour éviter la dessiccation en raison de la perte de fluide.
- Coudre le péritoine en continu suture utilisant une suture de Catgut 4-0. Par la suite, fermez la peau par une suture discontinus aussi rapidement que possible.
-
Transplantation de cellules
Remarque : Les hépatocytes exprimant de la GFP ont été isolés chez des souris transgéniques de GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), selon la procédure décrite par Lee et al. 22 et Shen et al. 23 cellules semblables à des hépatocytes (NeoHep) d’origine humaine différenciée des monocytes24 servaient aussi à la transplantation. Toutefois, cellules provenant d’autres sources peuvent également être employées dans le protocole.- Suspendre les 0,2 millions de cellules viables dans environ 50 µL de Dulbecco modifiée de Iscove Medium (IMDM) et il aspirer dans une seringue à insuline 1 mL avec aiguille 30 G. Garder au froid la seringue en le plaçant sur la glace.
- Placer la souris de manière que la partie latérale gauche vers le haut vers la personne qui effectue l’intervention chirurgicale. Identifier la région splénique et transversalement disséquer la peau près de la région hypocondriaque, suivie par une courte incision à travers la couche péritonéale juste pour exposer la rate.
- Soulever la rate délicatement et maintenez à l’extérieur de la cavité à l’aide de deux PBS humidifié bouts de coton.
- Tenez la rate avec soin avec deux bouts de coton dans une main et placez l’aiguille de la seringue exactement verticale à la rate. Doucement, percent la rate et pousser l’aiguille très lentement à l’intérieur ; l’aiguille ne devrait pas recevoir plu de 2 mm.
- Abaissez lentement le piston de la seringue pour injecter les cellules de la rate. Après la transplantation, maintenir la stabilité de l’aiguille de la seringue et retirez-la lentement de la rate afin d’éviter un saignement ou une perte de cellules.
- Après avoir placé la rate dans la cavité péritonéale avec les bouts de coton, fermer la couche péritonéale en suturant continue avec une suture de Catgut 4-0. Coudre la peau discontinue avec la suture même. Évitez d’utiliser des clips de la plaie pour la fermeture de la peau ; au lieu de cela, le fermer par une suture 4-0. Les clips de plaie restreignent le mouvement naturel de la souris, et souvent les clips sont desserrent et sortent rapidement.
3. post-opératoire soins
- Après la fermeture de la peau, essuyez les environs des deux sites suture avec la solution d’iode (Bétadine) à l’aide d’un bout de coton stérile.
- Injecter une dose d’antibiotique céfotaxime que 600 mg/kg par voie intrapéritonéale de poids (en général 12 mg céfotaxime dans 100 µL de solution saline/souris) corporel à l’aide de la seringue de 1 mL.
- Donner des doses quotidiennes de Meloxicam analgésique 1 mg/kg de poids corporel (en général 12 µg Meloxicam dans 100 µL de solution saline/souris) à l’animal par voie intrapéritonéale, jusqu'à trois jours après la chirurgie.
- A l’issue de la chirurgie, arrêter l’écoulement du gaz isoflurane et replacez la souris dans la cage ventilée individuellement.
4. euthanasie et caractérisations
- Après les paramètres expérimentaux (1 jour et 10 jours post chirurgie), euthanasier les souris selon les directives d’éthique animale institutionnels.
- Recueillir le sang par un saignement en phase terminale aux animaux, perforant le plexus terminal oculaire.
- Isoler le sérum du sang.
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Representative Results
Prolifération des hépatocytes après hépatectomie partielle de 30 % : La prolifération des hépatocytes dans le reste du foie après hépatectomie 30 % a été examinée par immunohistochimie (IHC) coloration d’un marqueur de prolifération cellulaire, Ki-67. Une journée après hépatectomie, les souris ont été euthanasiés, les lobes du foie restants ont été excisées et sections de paraffine ont été obtenues. Les sections ont été colorées avec les anticorps de Ki-67, suivi par marquage avec l’anticorps secondaire conjugué de raifort peroxydase de raifort (HRP). Di-Amino Benzidine (DAB) a été utilisé comme substrat pour HRP pour le développement de couleur brune pour identifier les cellules colorées. Le noyau a été compteur colorés à l’hématoxyline et vu au microscope objectif 20 X. La figure 1 montre une image d’IHC représentative d’une partie du foie. Environ 13 % des cellules (13,66 ± 0,317, N = 3) étaient Ki-67 positif, ce qui confirme qu’une hépatectomie 30 % facilite la prolifération des hepatocytes dans le foie de souris.
Étude anatomique : Une image représentative du foie d’un clin de œil. Souris SCID, 10 jours après hépatectomie est illustrée à la Figure 2. Cette image a confirmé que le foie restant était en bonne santé avec aucune anomalie visible.
Présence de cellules transplantées au cours de la première heure de la chirurgie : Le homing des cellules transplantées a été confirmé par cytométrie en examinant la présence des hépatocytes positives GFP 2 heures après la transplantation.
Une suspension monocellulaire provenait de la rate et le foie de souris hôte après digestion enzymatique des tissus excisés après 2 heures de la transplantation de GFP-hépatocytes. Le pourcentage de cellules transplantées GFP a été estimé à l’aide d’un cytomètre en flux. Une barrière de nuages de points XY a été choisie d’après le correspondant FSC-SSC dot pour éliminer les cellules de débris et doublet. La porte du quadrant de la parcelle a été créée par l’intensité de fluorochrome de fond des suspensions de cellules provenant de la rate et le foie de souris contrôle dans lequel aucune des cellules ont été transplantées. Environ 1,7 % hépatocytes positives de la GFP ont été trouvés dans la rate, et aucun hépatocytes GFP ne trouvées dans le foie, 2 heures après la transplantation. Des données représentatives sont indiquées à la Figure 3.
Immunohistochimique : Post-opératoire de dix jours, les souris ont été euthanasiés et le lobe latéral droit, le lobe droit médial et le lobe gauche médial du foie ont été excisé et cryo-sectionnement a été réalisée pour obtenir 5 µm sections. Ensuite, ces coupes ont été examinées pour la domiciliation et la greffe des cellules transplantées. La figure 4 montre les images représentatives de l’immunohistochimie (IHC) coloration contre les anti-GFP (rouge) pour identifier la GFP exprimant les hépatocytes de souris (panneau A, Bet C) ; et contre l’albumine humaine (rouge), mais aussi anti-humain connexine 32 (vert), pour identifier les cellules semblables à des hépatocytes (NeoHep) d’origine humaine (panneaux D, E, Fet G). Le noyau a été Eosine avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu) dans les deux cas. Dans ces panneaux d’image, quelques GFP implantée exprimant des hépatocytes (panneau A, Bet C) et NeoHep (panneaux D, E, Fet G) sont clairement visibles.
Analyse biochimique du foie sécrétée enzymes : Afin de vérifier la fonctionnalité du foie après l’intervention chirurgicale, une analyse biochimique des différentes enzymes sécrétées hépatiques a été réalisée. Les graphiques à barres dans la Figure 5 représente la valeur moyenne de l’aspartate aminotransférase (AST), alanine aminotransférase (ALT) et la phosphatase alcaline (ALK-PHOS) dans le sérum de clin de œil sain. Souris SCID et les différents groupes de partiellement hépatectomisés souris. Il est clair d’après le graphique qu’après 1 jour d’hépatectomie, niveaux d’enzymes AST, ALT et ALK-PHOS a sensiblement augmentent, en comparaison avec les souris saines.
Les taux d’enzymes ALT et AST ont été restaurées à la normale, tandis que les niveaux de ALK-PHOS est demeurées élevées après chirurgie de dix jours chez les souris non transplantés. Toutefois, les niveaux des trois enzymes ont chuté à la normale chez les souris transplantées après 10 jours.
L’étude histologique du foie : Les échantillons de foie du hépatectomisés et transplantés de souris ont été traitées ultérieurement pour analyse histologique étudier la chirurgie après les changements anatomiques. Figure 6 illustre le champ lumineux représentant des images de l’hématoxyline et éosine (H et E) teintés des sections du foie des souris saine sans chirurgie, 1 jour après hépatectomie partielle et 10 jours après l’hépatectomie partielle et NeoHep transplantation. Dans ces images, atteinte hépatique due à la prolifération de la fibrose ou tissu conjonctif péri-biliaire bénigne est observée après 1 journée d’une hépatectomie partielle, et aucune anomalie ont été observés après chirurgie de dix jours.
Figure 1 : Une image représentative de Ki-67 piqueté de NOD. Article de SCID hépatique après 1 jour de 30 % une hépatectomie. Section était tachée avec de l’anticorps de Ki-67, la peroxydase de raifort (HRP) conjugués anticorps secondaire, DAB (brown) a été utilisé comme substrat HRP et noyaux étaient Eosine par l’hématoxyline (bleu). Pointes de flèche indicatives soulignent certaines des cellules positives (bruns) Ki-67. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Régénéré des lobes du foie d’un clin de œil. SCID souris 10 jours après la chirurgie. A: noyau caudé lobe (processus caudé), B: droit lobe latéral, C: droite lobe médian, D: gauche lobe médian, coeur E:, F: restant du lobe latéral gauche après hépatectomie et G: lobe caudé (processus papillaire). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Pourcentage de GFP souris positif heptatocytes dans la rate et le foie d’un clin de œil. La souris SCID. Les panneaux supérieurs montrent le profil de cellule d’une souris de témoin d’âge dans laquelle aucune des cellules ont été transplantées. Panneau du bas montre le profil de cellule après 2 heures de transplantation hépatocytaire GFP dans une souris hépatectomisés. L’axe y des parcelles indique l’intensité de la fluorescence de la GFP (canal FITC) mesurée en unités arbitraires sur une échelle logarithmique, et l’axe des x indique la dispersion vers l’avant (FSC) en unités arbitraires sur une échelle linéaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Le homing des transplantés GFP exprimant des hépatocytes de souris et NeoHep dans le foie de l’hôte régénérée. Images représentant des sections du foie d’un partiellement hépatectomisés clin de œil. Souris à SCID transplantée avec hépatocytes de souris positif de GFP (A-C), montrant la prise de greffe de cellules et d’autoguidage. Groupe A: noyau (bleu : DAPI), groupe B: anti-GFP (rouge : Alexa Fluor 594), image C: panneau fusionné. Panneaux (D-G) montre une partie du foie de la partiellement hépatectomisés clin de œil. La souris SCID dans lequel NeoHep ont été transplantés. Groupe D: noyau (bleu : DAPI), E: panneau humaine anti-connexine 32 (vert : Alexa Fluor 488), anti-l’albumine humaine groupe F: (rouge : Alexa Fluor 594) et image : fusion groupe G:. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse biochimique du foie différente sécrétées enzymes dans le sérum de la souris. Barres de colonne représentent les valeurs moyennes des différentes enzymes (AST/SGOT, ALT/SGPT, ALK-PHOS). Le point de temps d’étude après la chirurgie est indiqué sur l’axe des X. Dans le groupe témoin, il n’y a NOD appariés selon l’âge. Souris SCID et aucune chirurgie a été effectuée. Barres d’erreur signifient l’erreur-type de la moyenne, N = 3 et * indique p< 0,05, NS indique le caractère non significatif à p> 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Étude histopathologique des sections de tissu du foie de souris. Images de microscopie de champ lumineux représentatifs de l’hématoxyline et éosine (H et E) colorent des sections de tissu hépatique du NOD. Souris SCID sous 20 X objectif. Paroi A montre une section du foie d’un clin de œil sain. Souris SCID du même âge sans aucune intervention chirurgicale. Panneau B montre une section du foie 1 jour une hépatectomie partielle post. Dans cette image, têtes de flèche indiquent la région de prolifération bénigne peri-biliaires fibrose ou tissu conjonctif. Panneau C montre une section du foie dix jours post partiel hépatectomie et cell transplantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une hépatectomie partielle est une technique établie pour la régénération du foie chargée de l’enquête, et une hépatectomie excessive est signalée à imiter le modèle de l’AHF. Parmi les modèles animaux de l’AHF, rongeurs, en particulier des souris, sont le modèle plus étudié. Pour obtenir un modèle de lésions hépatiques chez les souris, jusqu'à une hépatectomie 70 % ont été signalés avec une bonne survie taux25,26. Cependant en nu et autres souris immunodéficientes, une hépatectomie 70 % a été rapportée comme fatal et animaux morts dans les 24 heures27.
Mitchell et Willenbring28 a démontré une méthode reproductible et bien tolérée pour 2/3 une hépatectomie partielle chez la souris. Pour le clin de œil. Les souris SCID, nous avons obtenu un taux de survie de 100 % lorsque l’hépatectomie était limitée jusqu'à la résection du lobe gauche du foie, qui avoisine les 30 % de la masse totale du foie. En ligne avec les observations sur des souris Nudes27, nous avons observé que toute augmentation de plus du pourcentage d’hépatectomie en clin de œil. La souris SCID conduit à une baisse spectaculaire du taux de survie. En outre, post de lobes de prolifération des hépatocytes dans le reste du foie hépatectomie partielle de 30 % de 1 jour a confirmé l’utilité de cette procédure en transplantation et greffe.
Dans un article plus récent, S.U. Ahmed et al. 29 ont démontré une procédure de xénogreffes de carcinome hépatocellulaire intrahépatique dans des souris immunodéficientes. Ils ont montré une procédure pour la transplantation de cellules tumorales dans divers organes, y compris la rate et effectué une hépatectomie pour faciliter la prise de greffe intrahépatique.
Dans les procédures signalées par Mitchell28 et Ahmed29, il y a une occasion pour les raffinements en faisant des incisions plus petites, comme plus petites incisions sont généralement préférées en chirurgie. Il y a preuve30 une plus petite incision chirurgicale de longueur menant à moins la sécrétion des hormones de stress, telles que le cortisol et de catécholamines. En outre, nous avons constaté que les procédures impliquant une plus grande incision nécessitent un niveau supérieur de compétences et sont plus difficiles à reproduire, par rapport aux procédures ayant deux incisions plus petites.
Dans cet article, nous avons décrit une procédure dans laquelle une incision minimale est nécessaire pour exposer le lobe gauche du foie et, après avoir effectué une hépatectomie 30 %, une autre petite incision a été faite pour exposer la rate où les cellules ont été implantés. Cette procédure ne nécessite aucune qualification chirurgicale spécialisée et peut être complétée en 5-7 min. Par ailleurs, nous avons ne trouvé aucune preuve d’aucune anomalie morphologique ou anatomique dans la masse du foie restante, comme en témoignent des études histologiques. En outre, il y avait une absence d’ischémie ou de nécrose au cours de l’intervention chirurgicale de la semaine du 6-8-vieux immunitaire compromis souris. L’induction de lésions hépatiques après que hépatectomie partielle est confirmée par les taux élevés de sérum de souris AST, ALT et ALK-PHOSin d’enzymes hépatiques. Un itinéraire intra-splénique a été choisi pour la transplantation de cellules au-dessus des autres voies veineuses, car le système veineux portal a accessibilité plus élevée dans le cortex du foie que les autres systèmes veineux. Nous avons démontré la transplantation des hépatocytes isolés de souris transgénique GFP et NeoHep qui sont différenciées des hépatocytes cellules d’origine humaine, en partiellement hépatectomisés clin de œil. Animaux de SCID. La procédure ne limite pas le type de cellules utilisées pour la transplantation.
Toutefois, cette procédure ne crée pas la condition de l’AHF chez une souris, seulement une hépatectomie partielle de 30 % est assurée. Cette hépatectomie limitée offre un potentiel prolifératif d’hépatocytes présents dans le foie restant, qui fournit ainsi des possibilités supplémentaires aux hépatocytes transplantés pour greffe. Il démontre seulement la migration et la prise de greffe des hépatocytes et NeoHep de la rate vers le foie, et aucun autres dommages au foie ne se fait par la procédure de transplantation.
Dans l’ensemble, cette procédure est simple et peut être pratiquée et maîtrisée facilement afin d’obtenir des résultats reproductibles. Le potentiel de régénération de plusieurs sources cellulaires (cellules souches ou cellules semblables à des hépatocytes) dans le cadre de lésions du foie, ou l’étude de la régénération du foie, peut être facilement évalué avec cette intervention chirurgicale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de base provenance du département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde à l’Institut National d’immunologie, New Delhi. Adresse actuelle de m. Bhattacharjee est Division de gastro-entérologie, hépatologie et Nutrition, Hospital de Los Angeles pour enfants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
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