Summary
हम आंशिक hepatectomy (PHx) और मंजूरी में तिल्ली के माध्यम से सेल प्रत्यारोपण प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । SCID (मंजूरी. CB17-Prkdcscid/J) चूहों. इस प्रोटोकॉल में, एक चीरा बेनकाब करने के लिए और कोशिकाओं के intrasplenic प्रत्यारोपण के लिए एक और चीरा द्वारा पीछा जिगर की बाईं पालि कीट बना दिया है.
Abstract
आंशिक hepatectomy जिगर पुनर्जनन और विभिन्न रोग की स्थिति में कोशिका आधारित चिकित्सीय उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी और reproducible विधि है । आंशिक hepatectomy भी जिगर की ओर neovascularization और कोशिका प्रवास में तेजी लाकर प्रत्यारोपण कोशिकाओं की वृद्धि हुई engraftment और प्रसार की सुविधा । यहां, हम एक गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह की तिल्ली में 30% hepatectomy और कोशिकाओं के प्रत्यारोपण प्रदर्शन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन/गंभीर संयुक्त immunodeficient मंजूरी । SCID (मंजूरी. CB17-Prkdcscid/J) माउस ।
इस प्रक्रिया में, दो छोटे चीरा बनाया जाता है । पहला चीरा का पर्दाफाश करने के लिए और जिगर की बाईं पालि कीट है, और एक और छोटा सा चीरा कोशिकाओं के intrasplenic प्रत्यारोपण के लिए तिल्ली का पर्दाफाश करने के लिए किया जाता है । इस प्रक्रिया में किसी विशेष शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता नहीं है, और यह कम तनाव और दर्द, तेजी से वसूली, और बेहतर अस्तित्व के साथ 5-7 मिनट में पूरा किया जा सकता है । हम एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त माउस (ट्रांसजेनिक C57BL/6-टीजी (UBC-GFP) 30Scha/J), साथ ही hepatocyte मानव मूल की कोशिकाओं की तरह (NeoHep) आंशिक रूप से hepatectomized मंजूरी में से पृथक हेपैटोसाइट्स के प्रत्यारोपण का प्रदर्शन किया है । SCID चूहे ।
Introduction
वर्तमान में, hepatocyte ट्रांसप्लांटेशन गंभीर जिगर विकारों वाले रोगियों के इलाज के लिए पूरे अंग प्रत्यारोपण के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित है । यह माना जाता है कि यह पूरे अंग प्रत्यारोपण के लिए रोगियों1पुल कर सकते हैं । allogenic हेपैटोसाइट्स2के अलावा, xenogenic हेपैटोसाइट्स3 और हेपैटोसाइट्स स्टेम सेल4 से व्युत्पंन पशु मॉडलों में भी जांच की जा रही है । इस संदर्भ में, प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की होमिंग और engraftment क्षमता तीव्र यकृत विफलता (एएचएफ) में कोशिका आधारित चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी है.
हेपैटोसाइट्स या hepatocyte की तरह कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की जांच के लिए5, एएचएफ एक पशु मॉडल में शल्य6 या औषधीय7 प्रक्रियाओं, कोशिकाओं रोपाई के बाद द्वारा या तो बनाया गया है । औषधीय रिएजेंटों द्वारा एक एएचएफ पशु मॉडल बनाने के लिए, कई hepatotoxins जैसे डी-galactosamine8, एसिटामिनोफेन9, कार्बन टेट्राक्लोराइड10, thioacetamide11, Concanavalin ए12, lipopolysaccharide13 , आदिका प्रयोग किया गया है । इस सूची से, हर एजेंट एएचएफ के लिए सुविधाओं का एक अनूठा सेट उत्पंन करता है, लेकिन दुर्भाग्य से कोई एकल एजेंट मानव एएचएफ नकल । इसके अलावा, hepatotoxins द्वारा प्रेरित एएचएफ एक लंबा समय लगता है, जो पुराने तनाव के तहत पशुओं डालता है, और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए मुश्किल हैं ।
दूसरी ओर, आंशिक hepatectomy (PHx) की शल्य प्रक्रिया कौशल निर्भर है, और reproducible परिणाम आवश्यक कौशल विकसित करने के बाद प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं । अकेले शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप द्वारा एएचएफ प्रेरित करने के लिए, जिगर की अधिक से अधिक ७०% की लकीर की आवश्यकता है; हालांकि, एक ७०% hepatectomy से कम अभी भी engraftment और जिगर में प्रत्यारोपण कोशिकाओं के प्रसार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है यकृत क्षति14के दौरान उनकी चिकित्सीय क्षमता का विश्लेषण । हेपैटोसाइट्स के प्रत्यारोपण के बाद hepatectomy15, पूंछ नस16, यकृत नस17, या तिल्ली18के माध्यम से प्रदर्शन किया गया है । वर्तमान में, यकृत नस अर्क और हेपैटोसाइट्स के intrasplenic ट्रांसप्लांटेशन पसंदीदा प्रक्रिया कर रहे हैं, के रूप में वे पुन: पेश करने के लिए आसान कर रहे हैं ।
इस पत्र में, हमने मंजूरी में 30% आंशिक hepatectomy के लिए एक प्रक्रिया बताई है । SCID (मंजूरी. CB17-Prkdcscid/जम्मू) चूहों जिसमें जिगर की बाईं पालि में उत्पाद है । यह २००,००० GFP एक्सप्रेस माउस के प्रत्यारोपण के बाद है (C57BL/6-टीजी (UBC-GFP) 30Scha/जे) हेपैटोसाइट्स साथ ही मानव मूल NeoHep तिल्ली में19 . यह प्रक्रिया जिगर में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के engraftment की ओर जाता है । इस प्रक्रिया को कम इनवेसिव और एक ंयूनतम दर्दनाक तकनीक है ।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय इम्यूनोलॉजी संस्थान, नई दिल्ली की संस्थागत पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है । अनुमोदन की सीरियल संदर्भ संख्या IAEC है # 319/
नोट: सामान्य सर्जरी प्रक्रियाओं पर उत्कृष्ट संसाधन20 और कुतर सर्जरी के लिए21विशिष्ट प्रोटोकॉल हैं । पहली बार के लिए पशु शल्य चिकित्सा कर रहे लोगों के लिए, यह बड़े पैमाने पर जानवरों पर परिचालन से पहले dummies पर शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं अभ्यास करने के लिए सिफारिश की है.
1. तैयारी
- प्रयोग करने से पहले, बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) या खारा तैयार रखें.
- कैंची, दांतेदार संदंश, ऊतक संदंश, कपास, कपास कलियों, नायलॉन धागे, और विभिन्न माइक्रो सुई धारकों युक्त एक सर्जरी किट इकट्ठा. सर्जरी किट आटोक्लेव । विशेष देखभाल अगर एक प्रतिरक्षा समझौता मंजूरी ले लिया जाना चाहिए । SCID माउस प्रोटोकॉल में शामिल है ।
- पूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदर्शन, तैयारी से शल्य चिकित्सा के अंत तक, जैव सुरक्षा वर्ग मैं कैबिनेट में ।
- एक मंजूरी तौलना । 6-8 सप्ताह पुरानी सर्जरी से पहले के SCID माउस । 14-18 ग्राम के बीच वजन वाले चूहों का उपयोग इस अध्ययन में किया जाता है.
- बाल trimmer के साथ माउस के ऊपरी केंद्रीय और hypochondriac उदर क्षेत्र दाढ़ी । लागू बालों को पूरी तरह से छंटनी बाल हटाने के लिए एक रंग के साथ पूरे क्षेत्र में समान रूप से क्रीम हटाने । 2-5 मिनट के बाद गीले बाँझ कपास का एक टुकड़ा की मदद से धीरे से बाल निकालें.
- isoflurane चैंबर में माउस प्लेस और ऑक्सीजन सिलेंडर के वाल्व अनलॉक । 4% की दर पर ऑक्सीजन के प्रवाह को बनाए रखने और 4% पर isoflurane वाष्पीकरण संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए ।
- सुनिश्चित करें कि माउस कोमल पैर की अंगुली चुटकी द्वारा ठीक से anesthetized गया है ।
- एक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक सर्जरी बोर्ड रखें । सर्जरी बोर्ड पर एनिमल प्लेस करें, ऐसे में माउस के ventral हिस्से को ऊपर की ओर करना पड़ रहा है और माउस के पूर्वकालिक हिस्से को isoflurane और ऑक्सीजन सप्लाई से जुड़े नाक कोन के अंदर रखा गया है ।
- 2% करने के लिए isoflurane वाष्पीकरण कम है, और यह शल्य प्रक्रिया के दौरान बनाए रखने ।
- माउस की त्वचा को संक्रमित और यह ७०% इथेनॉल लथपथ बाँझ कपास के साथ पोंछते द्वारा निष्फल ।
2. शल्य प्रक्रिया
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आंशिक Hepatectomy
- सीधे ऑपरेटिंग कैंची की मदद से असिरूप प्रक्रिया और ribcage के समानांतर करने के लिए सीधा, बस उरोस्थि के नीचे त्वचा में लगभग 1 सेमी की एक अनुप्रस्थ चीरा बनाओ ।
- धीरे त्वचा और पेट की मांसपेशी परत के बीच भेद करने के लिए संदंश या बाँझ गीला कपास युक्तियों के साथ incised क्षेत्र के आसपास में पेट की मांसपेशी परत के साथ संलग्न त्वचा को अलग. सुखाना से बचने के लिए बाँझ कपास युक्तियों का उपयोग कर पंजाब के साथ intradermal क्षेत्र सोख.
- बस असिरूप के नीचे पेरिटोनियल परत के माध्यम से एक अनुप्रस्थ चीरा बनाकर सुचारू रूप से बाएँ पालि के क्षेत्र का पर्दाफाश. दो गीला कपास सुझावों का उपयोग करने के लिए बेनकाब और जिगर की बाईं पालि लिफ्ट ।
- कट के उदर ओर कपास सुझावों में से एक जगह है, और डायाफ्राम साइड पर एक और कपास टिप जगह है । धीरे डायाफ्राम की ओर रखा टिप प्रेस, और अंय टिप से एक फिसलने धक्का देने के लिए जिगर की बाईं पालि लिफ्ट ।
- लिफ्ट छोड़ पालि के माध्यम से एक पाश के साथ एक नायलॉन धागे पर्ची, और माइक्रो संदंश या सूती सुझावों की मदद से hilum के पास बाईं पालि के आधार की ओर पाश स्लाइड. धीरे बाएँ पालि के आधार करने के लिए नीचे नायलॉन धागा पाश धक्का.
- एक microsurgery सुई धारक और माइक्रो संदंश का उपयोग कर बाईं पालि के शीर्ष पर नायलॉन धागे के दो सिरों टाई । दूसरी तरफ दो अतिरिक्त गाँठ बनाओ.
- काटना ने कैंची की मदद से बंधे पालि को बाहर निकाला । धागे के बहुत करीब कटौती करने का प्रयास नहीं करते । मामले में प्रक्रिया 5 मिनट से अधिक रहता है, पेरिटोनियल गुहा और बाँझ पंजाबियों के साथ नम अंगों रखने के लिए द्रव नुकसान के कारण सुखाना से बचने के लिए.
- सतत suturing द्वारा एक 4-0 Catgut टांका का उपयोग करके आँख का सीना । इसके बाद, त् वरित रूप से जितनी जल्दी हो सके त्वचा को बंद कर suturing ।
-
कोशिका प्रत्यारोपण
नोट: GFP एक्सप्रेस हेपैटोसाइट्स ट्रांसजेनिक GFP चूहों से अलग थे (C57BL/6-टीजी (UBC-GFP) 30 Scha/जे), ली एट अलद्वारा वर्णित प्रक्रिया के अनुसार । 22 और शेन एट अल. 23 Hepatocyte की तरह कोशिकाओं (NeoHep) मानव मूल के monocytes से विभेदित24 भी प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया गया । हालांकि, किसी भी अंय स्रोत से व्युत्पंन कक्षों का उपयोग प्रोटोकॉल में भी किया जा सकता है ।- Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम (IMDM) के लगभग ५० µ एल में २००,००० व्यवहार्य कोशिकाओं को निलंबित, और यह एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन महाप्राण सुई के साथ छाया सिरिंज में 30G । यह बर्फ पर रखकर सिरिंज ठंडा रखें ।
- माउस एक तरह से है कि बाएं पार्श्व भाग शल्य चिकित्सा प्रदर्शन व्यक्ति की ओर चेहरे पर रखें । प्लीहा क्षेत्र की पहचान और hypochondriac क्षेत्र के पास त्वचा काटना transversely, बस तिल्ली बेनकाब करने के लिए पेरिटोनियल परत के माध्यम से एक छोटी चीरा के बाद.
- धीरे तिल्ली लिफ्ट और यह दो पंजाबियों कपास सुझावों गीला की मदद से गुहा के बाहर पकड़ ।
- एक हाथ में दो सूती सुझावों के साथ ध्यान से तिल्ली पकड़ो, और तिल्ली के लिए बिल्कुल ऊर्ध्वाधर सिरिंज की सुई जगह. धीरे तिल्ली पियर्स और सुई बहुत धीरे से अंदर धक्का; सुई 2 मिमी से गहरा नहीं मिलना चाहिए ।
- नीचे सिरिंज की पिस्टन पुश धीरे तिल्ली में कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए. प्रत्यारोपण के बाद, सिरिंज की सुई स्थिर रखने के लिए और तिल्ली से धीरे से निकालने के लिए खून बह रहा है या कोशिकाओं की हानि से बचने के लिए.
- तिल्ली पेरिटोनियल गुहा में कपास सुझावों के साथ वापस रखने के बाद, एक 4-0 Catgut टांका के साथ सतत suturing द्वारा पेरिटोनियल परत बंद । एक ही सीवन के साथ लगातार त्वचा सीना । बंद त्वचा के लिए घाव क्लिप का उपयोग करने से बचें; इसके बजाय, यह एक 4-0 सीवन द्वारा बंद करो । घाव क्लिप माउस के प्राकृतिक आंदोलन को सीमित है, और अक्सर क्लिप ढीला हो जाते हैं और जल्दी से बाहर आ जाते हैं ।
3. पोस्ट को-ऑपरेटिव केयर
- त्वचा को बंद करने के बाद, दोनों एक बाँझ कपास टिप का उपयोग आयोडीन समाधान (betadine) के साथ टांका साइटों के आसपास पोंछ ।
- ६०० मिलीग्राम/kg शरीर के वजन के रूप में एंटीबायोटिक सेफोटक्षिमे की एक खुराक सुई (आम तौर पर 12 मिलीग्राम सेफोटक्षिमे १०० µ l में खारा/1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर intraperitoneally.
- 1 मिलीग्राम/kg शरीर के वजन के रूप में एनाल्जेसिक Meloxicam की दैनिक खुराक (आमतौर पर 12 µ जी Meloxicam खारा/माउस के १०० µ एल में) पशु intraperitoneally के लिए, सर्जरी के बाद तीन दिनों तक के लिए ।
- शल्य चिकित्सा के पूरा होने के बाद, isoflurane गैस के प्रवाह को रोकने और व्यक्तिगत हवादार पिंजरे में माउस वापस जगह है ।
4. Euthanization और Characterizations
- प्रायोगिक अंत-अंक (1 दिन और 10 दिनों के बाद सर्जरी) के बाद, संस्थागत पशु नैतिकता के दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों euthanize ।
- टर्मिनली जानवरों से खून बह रहा द्वारा रक्त ले लीजिए, आंख टर्मिनल जाल puncturing ।
- रक्त से सीरम अलग ।
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Representative Results
Hepatocyte प्रसार के बाद 30% आंशिक hepatectomy: 30% hepatectomy के बाद शेष जिगर में हेपैटोसाइट्स के प्रसार immunohistochemical (आइएचसी) एक सेल प्रसार मार्कर, Ki-६७ के लिए धुंधला द्वारा जांच की थी । एक दिन के बाद hepatectomy, चूहे euthanized थे, शेष जिगर पालियों आबकारी थे, और आयल वर्गों प्राप्त किया गया । वर्गों Ki-६७ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे, सहिजन peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग के बाद । डि-अमीनो Benzidine (ढाब) भूरे रंग के विकास के लिए एचआरपी के लिए सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था दाग कोशिकाओं की पहचान । नाभिक hematoxylin के साथ दाग काउंटर और एक 20X उद्देश्य माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया था । चित्रा 1 एक जिगर अनुभाग के एक प्रतिनिधि आइएचसी छवि से पता चलता है. कोशिकाओं के 13% के आसपास (१३.६६ ± ०.३१७, एन = 3) थे-६७ सकारात्मक है, जो पुष्टि की है कि एक 30% hepatectomy माउस जिगर में हेपैटोसाइट्स के प्रसार की सुविधा ।
संरचनात्मक अध्ययन: एक मंजूरी के जिगर की एक प्रतिनिधि छवि । SCID माउस, 10 दिनों के बाद hepatectomy चित्रा 2में दिखाया गया है । इस छवि की पुष्टि की है कि शेष जिगर नहीं दिखाई विषमताओं के साथ स्वस्थ था ।
शल्य चिकित्सा के पहले घंटे के दौरान प्रत्यारोपण कोशिकाओं की उपस्थिति: रोपाई के होमिंग कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के 2 घंटे बाद GFP पॉजिटिव हेपैटोसाइट्स की मौजूदगी की जांच करके फ्लो cytometric एनालिसिस के साथ पुष्टि की गई ।
एक एकल सेल निलंबन GFP-हेपैटोसाइट्स ट्रांसप्लांटेशन के 2 घंटे के बाद उत्पादेड ऊतक के पाचन एंजाइमी के बाद मेजबान माउस की तिल्ली और जिगर से प्राप्त किया गया था । एक प्रवाह cytometer का उपयोग करके प्रत्यारोपित GFP सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत अनुमानित था । मलबा और नक़ल कोशिकाओं को खत्म करने के लिए इसी FSC-एसएससी डॉट प्लाट से कैटरिंग गेट का चयन किया गया । भूखंड का चक्रीय फाटक कक्ष एक नियंत्रण माउस की तिल्ली और जिगर से प्राप्त निलंबन की पृष्ठभूमि fluorochrome तीव्रता द्वारा बनाया गया था जिसमें कोई कोशिकाओं प्रत्यारोपण किया गया था. तिल्ली में करीब १.७% GFP पॉजिटिव हेपैटोसाइट्स पाए गए थे और प्रत्यारोपण के 2 घंटे बाद लिवर में कोई GFP हेपैटोसाइट्स पाया गया । प्रतिनिधि डेटा आरेख 3में दिखाया जाता है ।
Immunohistochemistry: दस दिनों के बाद शल्य चिकित्सा, चूहों euthanized थे, और सही पार्श्व पालि, सही औसत दर्जे का पालि, और बाईं और जिगर की औसत प्रखंडों के उत्पाद थे और क्रायो-खंड के लिए 5 µm वर्गों को प्राप्त करने के लिए किया गया था । इसके बाद इन वर्गों के प्रत्यारोपण कक्षों के होमिंग और engraftment की जांच की गई । चित्रा 4 immunohistochemical के प्रतिनिधि छवियों (आइएचसी) विरोधी GFP (लाल) के खिलाफ दाग से पता चलता है चूहों हेपैटोसाइट्स (पैनल ए, बी, और सी) व्यक्त GFP की पहचान; और विरोधी के खिलाफ मानव एल्ब्युमिन (लाल), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विरोधी मानव connexin ३२ (ग्रीन), की पहचान करने के लिए hepatocyte की तरह कोशिकाओं (NeoHep) मानव मूल (पैनल डी, ई, एफ, और जी) । नाभिक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, नीला) के साथ दोनों मामलों में counterstained था । इन इमेज पैनलों में कुछ engrafted GFP expression हेपैटोसाइट्स (पैनल ए, बी, एण्ड सी) तथा NeoHep (पैनल डी, ई, एफ, एण्ड जी) स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं ।
जिगर स्रावित एंजाइमों के जैव रासायनिक विश्लेषण: आदेश में शल्य प्रक्रिया के बाद जिगर की कार्यक्षमता की जांच करने के लिए, विभिंन जिगर स्रावित एंजाइमों के जैव रासायनिक विश्लेषण किया गया । चित्रा 5 में बार रेखांकन स्वस्थ मंजूरी के सीरम में aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) और क्षारीय फॉस्फेट (ALK-PHOS) का मतलब मूल्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । SCID चूहों, और आंशिक रूप से hepatectomized चूहों के विभिन्न समूहों. यह ग्राफ से स्पष्ट है कि hepatectomy के 1 दिन के बाद, AST, ऑल्ट के स्तर, और ALK-PHOS एंजाइमों काफी वृद्धि हुई है, जब स्वस्थ चूहों के साथ तुलना में ।
ऑल्ट और AST एंजाइम का स्तर सामान्य करने के लिए बहाल किया गया है, जबकि ALK-PHOS स्तर उच्च पद दस दिनों गैर प्रत्यारोपण चूहों में सर्जरी बनी रही. हालांकि, सभी तीन एंजाइमों के स्तर 10 दिनों के बाद प्रत्यारोपण चूहों में सामान्य करने के लिए गिरा दिया.
लिवर ऊतकवैज्ञानिक स्टडी: hepatectomized और प्रत्यारोपण चूहों के जिगर के नमूनों आगे संरचनात्मक परिवर्तन के बाद सर्जरी का अध्ययन करने के लिए ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए कार्रवाई की गई । चित्रा 6 hematoxylin और eosin के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (एच और ई) सर्जरी के बिना स्वस्थ चूहों के दाग जिगर वर्गों, 1 दिन के बाद आंशिक hepatectomy और 10 दिन आंशिक hepatectomy और NeoHep ट्रांसप्लांटेशन पोस्ट से पता चलता है । इन छवियों में, जिगर हल्के पेरि-पित्त फाइब्रोसिस या संयोजी ऊतक प्रसार के कारण नुकसान आंशिक hepatectomy के 1 दिन के बाद मनाया गया था, और कोई विषमता दस दिनों के बाद सर्जरी मनाया गया ।
चित्र 1 : की एक प्रतिनिधि छवि की-६७ की मंजूरी की धुंधला । SCID लिवर सेक्शन 30% hepatectomy के 1 दिन बाद । धारा के साथ सना हुआ था-६७ एंटीबॉडी, सहिजन peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, और ढाब (ब्राउन) एचआरपी सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और नाभिक counterstained द्वारा hematoxylin (नीला) थे । संकेत ऐरोहेड की कुछ-६७ सकारात्मक (ब्राउन) कोशिकाओं के बाहर बिंदु । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : एक मंजूरी के जिगर पालियों पुनर्जीवित । SCID माउस 10 दिनों के बाद सर्जरी । एक: caudate पालि (caudate प्रक्रिया), बी: दायां पार्श्व पालि, सी: सही औसत दर्जे का पालि, डी: शेष औसत पालि, ई: हार्ट, एफ: वाम पार्श्व पालि के hepatectomy के बाद, और जी: caudate पालि (इल्लों प्रक्रिया) छोड़ दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : एक मंजूरी की तिल्ली और जिगर में GFP सकारात्मक माउस heptatocytes का प्रतिशत. SCID माउस । ऊपरी पैनलों एक उंर के सेल प्रोफ़ाइल नियंत्रण माउस जिसमें कोई कोशिकाओं प्रत्यारोपण किया गया मिलान दिखाते हैं । लोअर पैनलों एक hepatectomized माउस में GFP hepatocyte ट्रांसप्लांटेशन के 2 घंटे के बाद सेल प्रोफ़ाइल दिखाते हैं । भूखंडों की वाई अक्ष एक लॉग स्केल पर मनमाने ढंग से इकाइयों में मापा GFP (FITC चैनल) की प्रतिदीप्ति तीव्रता का अर्थ है, और एक्स अक्ष एक रैखिक पैमाने पर मनमाने ढंग से इकाइयों में आगे तितर बितर (FSC) का अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : होमिंग का प्रत्यारोपण GFP एक्सप्रेस माउस हेपैटोसाइट्स और NeoHep में पुनर्जीवित मेजबान जिगर । एक आंशिक रूप से hepatectomized मंजूरी के जिगर वर्गों के प्रतिनिधि छवियों । SCID माउस GFP सकारात्मक माउस हेपैटोसाइट्स (एक-सी) के साथ प्रत्यारोपित, सेल engraftment और होमिंग दिखा । पैनल एक: नाभिक (नीला: DAPI), पैनल बी: विरोधी GFP (लाल: Alexa Fluor ५९४), पैनल सी: विलय छवि । पैनलों (डी जी) आंशिक रूप से hepatectomized मंजूरी के जिगर अनुभाग दिखाओ । SCID माउस जिसमें NeoHep का प्रत्यारोपण किया गया । पैनल डी: नाभिक (नीला: DAPI), पैनल ई: मानव विरोधी Connexin ३२ (ग्रीन: Alexa Fluor ४८८), पैनल एफ: मानव विरोधी एल्ब्युमिन (लाल: Alexa Fluor ५९४) और पैनल जी: विलय छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 : विभिन्न जिगर के जैव रासायनिक विश्लेषण चूहों सीरम में एंजाइमों स्रावित. स्तंभ पट्टियां भिंन एंजाइमों (AST/SGOT, ALT/एसजीपीटी, ALK-PHOS) के माध्य मानों का प्रतिनिधित्व करती हैं । अध्ययन के बाद के समय बिंदु सर्जरी एक्स अक्ष पर दिखाया गया है । नियंत्रण समूह में, वहां उंर मिलान मंजूरी थे । SCID चूहों और कोई सर्जरी नहीं की गई । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाता है, N = 3 और * p< 0.05 इंगित करता है, NS p> 0.05 पर ग़ैर-महत्व को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6 : चूहों जिगर ऊतक वर्गों के Histopathological अध्ययन । प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र hematoxylin और eosin की माइक्रोस्कोपी छवियां (एच और ई) कांच की मंजूरी के जिगर ऊतक वर्गों । SCID चूहों के तहत 20X उद्देश्य लेंस । पैनल एक एक स्वस्थ मंजूरी से एक जिगर अनुभाग से पता चलता है । बिना किसी सर्जरी के उसी उम्र के SCID चूहे । पैनल बी एक जिगर अनुभाग 1 दिन पोस्ट आंशिक hepatectomy से पता चलता है । इस छवि में, तीर सिर हल्के पेरि-billiary फाइब्रोसिस या संयोजी ऊतक प्रसार क्षेत्र का संकेत है । पैनल सी एक जिगर की धारा दस दिनों के बाद आंशिक hepatectomy और कोशिका प्रत्यारोपण से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
आंशिक hepatectomy जिगर पुनर्जनन की जांच के लिए एक स्थापित तकनीक है, और अत्यधिक hepatectomy एएचएफ मॉडल की नकल करने के लिए सूचित किया है । एएचएफ, कुतर, विशेष रूप से चूहों के पशु मॉडलों के बीच, सबसे शोध मॉडल हैं । चूहों में एक जिगर की चोट मॉडल प्राप्त करने के लिए, अप करने के लिए एक ७०% hepatectomy एक अच्छा जीवित रहने की दर के साथ रिपोर्ट किया गया है25,26. हालांकि नग्न और अंय immunodeficient माउस में, एक ७०% hepatectomy घातक और जानवरों के रूप में सूचित किया गया था 24 घंटे के भीतर27मर गया ।
मिशेल और Willenbring28 चूहों में 2/3 आंशिक hepatectomy के लिए एक reproducible और अच्छी तरह से सहन विधि का प्रदर्शन किया । मंजूरी के लिए । SCID चूहों, हम एक १००% जीवित रहने की दर जब hepatectomy छोड़ दिया जिगर पालि, जो कुल जिगर द्रव्यमान का 30% के करीब है की लकीर तक ही सीमित था प्राप्त की । नग्न चूहों पर टिप्पणियों के साथ लाइन में27, हमने देखा कि मंजूरी में hepatectomy के प्रतिशत में कोई और वृद्धि हुई है । SCID माउस को जीवित रहने की दर के एक नाटकीय कम करने की ओर जाता है । इसके अलावा, शेष जिगर पालियों में हेपैटोसाइट्स के प्रसार 30% आंशिक hepatectomy के 1 दिन के बाद प्रत्यारोपण और engraftment अध्ययन में इस प्रक्रिया की उपयोगिता की पुष्टि की ।
एक और हाल ही में कागज, अहमद S.U. एट अल । 29 immunodeficient चूहों में intrahepatic hepatocellular कार्सिनोमा xenografts के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है । वे तिल्ली सहित विभिन्न अंगों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक प्रक्रिया को दिखाया गया है, और intrahepatic engraftment की सुविधा के लिए hepatectomy प्रदर्शन किया ।
मिशेल28 और अहमद29द्वारा रिपोर्ट की गई प्रक्रियाओं में, वहाँ बहुत छोटे चीरा बनाने के द्वारा शोधन के लिए एक अवसर है, के रूप में छोटे चीरा आम तौर पर सर्जरी में पसंद कर रहे हैं. 30 सबूत है कि एक छोटी लंबाई सर्जिकल चीरा ऐसे कोर्टिसोल और catecholamine के रूप में तनाव हार्मोन, के कम स्राव की ओर जाता है । इसके अतिरिक्त, हम एक बड़ा चीरा शामिल प्रक्रियाओं कौशल का एक उच्च स्तर की आवश्यकता होती है कि पाया, और दो छोटे चीरा होने प्रक्रियाओं की तुलना में, पुन: पेश करने के लिए और अधिक मुश्किल हैं.
इस पत्र में, हम एक प्रक्रिया का वर्णन किया है जिसमें न्यूनतम चीरा जिगर की बाईं पालि बेनकाब करने के लिए आवश्यक है और, एक 30% hepatectomy प्रदर्शन करने के बाद, एक और छोटा सा चीरा तिल्ली जहां कोशिकाओं प्रत्यारोपित किया गया था बेनकाब करने के लिए बनाया गया था. इस प्रक्रिया में किसी विशेष शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता नहीं है और 5-7 मिनट में पूरा किया जा सकता है । इसके अलावा, हम शेष जिगर द्रव्यमान में किसी भी रूपात्मक या संरचनात्मक विषमता का कोई सबूत नहीं मिला, के रूप में ऊतकवैज्ञानिक अध्ययन द्वारा सबूत । इसके अलावा, वहां ischemia या परिगलन 6-8 सप्ताह पुराने प्रतिरक्षा चूहों समझौता की शल्य प्रक्रिया के दौरान एक अभाव था । जिगर की चोट की प्रेरण आंशिक hepatectomy के बाद जिगर एंजाइमों AST, ऑल्ट, और ALK-PHOSin चूहों सीरम के ऊंचा स्तर की पुष्टि की है । पोर्टल शिरापरक प्रणाली अन्य शिरापरक प्रणालियों की तुलना में जिगर प्रांतस्था में उच्च पहुंच गया है, क्योंकि एक intrasplenic मार्ग, अन्य शिरापरक मार्गों पर सेल ट्रांसप्लांटेशन के लिए चुना गया था । हम आंशिक रूप से hepatocyte मंजूरी में, मानव मूल के hepatectomized की तरह कोशिकाओं विभेदित कर रहे हैं जो एक ट्रांसजेनिक GFP माउस और NeoHep से पृथक हेपैटोसाइट्स के प्रत्यारोपण का प्रदर्शन किया है. SCID पशु । प्रक्रिया प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं के प्रकार को सीमित नहीं है ।
केवल 30% आंशिक hepatectomy किया जाता है के रूप में हालांकि, यह कार्यविधि एएचएफ शर्त एक माउस में नहीं बनाता है । इस सीमित hepatectomy शेष जिगर में मौजूद हेपैटोसाइट्स के लिए एक प्रफलन क्षमता प्रदान करता है, जिससे engraftment के लिए प्रत्यारोपण हेपैटोसाइट्स के लिए अतिरिक्त अवसर प्रदान करता है । यह केवल हेपैटोसाइट्स के प्रवास और engraftment को दर्शाता है, और NeoHep तिल्ली से जिगर के लिए, और जिगर के लिए कोई अतिरिक्त क्षति प्रत्यारोपण प्रक्रिया द्वारा किया जाता है ।
सब से अधिक, इस प्रक्रिया सरल है, और अभ्यास किया जा सकता है और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए आसानी से महारत हासिल है । कई सेलुलर स्रोतों की अपक्षयी क्षमता (स्टेम सेल या hepatocyte-कोशिकाओं की तरह) जिगर की चोट, या जिगर पुनर्जनन अध्ययन के संदर्भ में, आसानी से इस शल्य प्रक्रिया के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह कार्य जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार के राष्ट्रीय संस्थान इम्यूनोलॉजी, नई दिल्ली से प्राप्त कोर अनुदान द्वारा समर्थित था. डॉ भट्टाचार्य वर्तमान पता गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, हीपैटोलॉजी और पोषण, बच्चों के अस्पताल लॉस एंजिल्स के प्रभाग है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
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