Summary
لقد قمنا بوصف بروتوكول لأداء ظهرت الجزئي (PHx) وزرع الخلايا عن طريق الطحال في إيماءة. إخضاعها (إيماءة. /J CB17-بركدكمشمولان) الفئران. في هذا البروتوكول، ويتم شق إلى فضح ويرسخ الفص الأيسر من الكبد متبوعاً بشق آخر لزرع الخلايا إينتراسبلينيك.
Abstract
ظهرت الجزئي أسلوب تنوعاً واستنساخه لدراسة تجديد الكبد وتأثير الخلية على أساس المداواة في مختلف الحالات المرضية. ظهرت جزئية يسهل أيضا انجرافتمينت زيادة وانتشار الخلايا المزروعة neovascularization المتسارع والهجرة الخلية نحو الكبد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لأداء ظهرت 30% وزرع الخلايا في الطحال من غير السمنة السكري/حاد جنبا إلى جنب إيماءة العوز. إخضاعها (إيماءة. /J CB17-بركدكمشمولان) الماوس.
في هذا الإجراء، يتم إجراء شقوق صغيرة اثنين. الشق الأول هو فضح ويرسخ الفص الأيسر من الكبد، ويتم إجراء شق صغير آخر لفضح الطحال لزرع الخلايا إينتراسبلينيك. هذا الإجراء لا يتطلب أي مهارات جراحية متخصصة، وأنها يمكن أن تكتمل في غضون 5-7 دقائق مع أقل الإجهاد والألم والشفاء أسرع وأفضل البقاء على قيد الحياة. لقد أظهرنا زرع خلايا الكبد المعزولة من بروتين فلورية خضراء (بروتينات فلورية خضراء) معربا عن الماوس (المعدلة وراثيا C57BL/6--تيراغرام (UBC-التجارة والنقل) 30Scha/ي)، فضلا عن تتمثل مثل خلايا المنشأ البشرية (نوب) في هيباتيكتوميزيد جزئيا إيماءة. مشمولان الفئران.
Introduction
في الوقت الراهن، يقترح زرع تتمثل كبديل لزرع كامل لعلاج المرضى بعد اضطرابات حادة في الكبد. ويعتقد أنه يمكن سد المرضى للجهاز كله زرع1. بالإضافة إلى خلايا الكبد allogenic2،3 من خلايا الكبد إكسينوجينيك وخلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية البالغة4 كما يجري التحقيق في نماذج حيوانية. في هذا السياق، بصاروخ موجه وانجرافتمينت إمكانية زرع خلايا المتلقي معياراً هاما للخلية على أساس العلاج في فشل كبدي حاد (AHF).
للتحقيق في زرع خلايا الكبد أو خلايا تتمثل مثل5، يتم إنشاء أهف في نموذج حيوان أما عن طريق الجراحة6 أو الإجراءات الدوائية7 ، متبوعاً بزرع الخلايا. جعل نموذج حيوان AHF الكواشف الدوائية، والعديد من هيباتوتوكسينس مثل د-جالاكتوساميني8، أسيتامينوفين9،10من رابع كلوريد الكربون، ثيواسيتاميدي11، كونكانافالين A12، lipopolysaccharide13 ، إلخ.، وقد استخدمت. من هذه القائمة، كل كاشف ينشئ مجموعة فريدة من ميزات لأهف، ولكن للأسف لا كاشف واحد يقلد AHF البشرية. وعلاوة على ذلك، AHF الناجمة عن هيباتوتوكسينس وقتاً طويلاً، مما يضع الحيوانات تحت الإجهاد المزمن، وصعوبة الحصول على النتائج استنساخه.
من ناحية أخرى، العملية الجراحية لظهرت الجزئي (PHx) تعتمد المهارة، والنتائج استنساخه من السهل الحصول عليها بعد تطوير المهارات المطلوبة. مطلوب لحمل أهف بالتدخل الجراحي وحدها، بتر أكثر من 70% من الكبد؛ ومع ذلك، أقل من ظهرت 70% لا يزال يمكن أن تستخدم لدراسة انجرافتمينت وانتشار زرع الخلايا في الكبد لتحليل قدراتها العلاجية خلال14من تلف في الكبد. وقد زرع خلايا الكبد ظهرت الوظيفة المؤداة عن طريق الصفاق15، ذيل الوريد16، الوريد الكبدي17أو الطحال18. حقن الوريد الكبدي وزرع خلايا الكبد إينتراسبلينيك حاليا الإجراءات المفضلة، كما أنها أسهل في إعادة إنتاج.
في هذه الورقة، التي وصفناها إجراء لظهرت جزئية في إيماءة 30%. إخضاعها (إيماءة. CB17-Prkdcscid/J) الفئران هي التي اقتطعت الفص الأيسر من الكبد. تبعتها زرع 0.2 مليون بروتينات فلورية خضراء وإذ تعرب عن الماوس (C57BL/6--تيراغرام (UBC-التجارة والنقل) 30Scha/ي) خلايا الكبد، فضلا عن البشرية المنشأ نوب19 في الطحال. ويؤدي هذا الإجراء إلى engraftment الخلايا المزروعة في الكبد. ويتم هذا الإجراء الأقل الغازية وتقنية دنيا مؤلمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول أقرتها "لجنة الأخلاقيات الحيوان المؤسسية" "المعهد الوطني لعلم المناعة"، نيودلهي. هو الرقم المرجعي التسلسلي للموافقة هيئة الطاقة الذرية رقم 319/13.
ملاحظة: هناك موارد ممتازة في الجراحة العامة إجراءات20 وبروتوكوﻻت معينة لجراحة القوارض21. لأولئك الذين يقومون جراحة الحيوان للمرة الأولى، ينصح بالممارسة على نطاق واسع الإجراءات الجراحية في الدمى قبل التشغيل على الحيوانات.
1-إعداد
- قبل التجربة، تبقى عقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو المالحة جاهزة.
- تجميع مجموعة جراحة تتضمن مقص وملقط مسنن وملقط الأنسجة، القطن، براعم القطن، وخيوط النايلون وأصحاب إبرة صغيرة مختلفة. اﻷوتوكﻻف أدوات الجراحة. ينبغي إيلاء عناية خاصة إذا كان موافقة جهاز المناعة-للخطر. يتم تضمين الماوس مشمولان في البروتوكول.
- تنفيذ الإجراء التجريبي كاملة، من إعداد لنهاية عملية جراحية، وفي السلامة الأحيائية الفئة الأولى مجلس الوزراء.
- وزن إيماءة. مشمولان الماوس من 6-8 أسابيع قبل الجراحة. وتستخدم الفئران وزنها بين 14-18 ز في هذه الدراسة.
- حلاقة منطقة البطن الوسطى و hypochondriac العلوي للماوس مع الشعر المتقلب. تطبيق إزالة كريم بالتساوي في جميع أنحاء المنطقة مع ملعقة لإزالة الشعر المشذبة الشعر. إزالة الشعر بلطف بمساعدة قطعة من القطن المعقم الرطب بعد 2-5 دقائق.
- ضع الماوس في قاعة isoflurane وفتح صمام اسطوانة الأكسجين. الحفاظ على تدفق الأكسجين بمعدل 4 لتر في الدقيقة والتبخر إيسوفلوراني 4% للحث على التخدير.
- تأكد من أنه قد تم تخديره الماوس بشكل صحيح بأصبع لطيف معسر.
- وضع مجلس الوزراء مجلس جراحة داخل السلامة الأحيائية. ضع الحيوان على متنها الجراحة، مثل الجزء البطني من الماوس هو مواجهة ويوضع الجزء الأمامي من الماوس داخل مخروط الآنف متصل بإمدادات إيسوفلوراني واكسجين.
- تخفيض التبخر isoflurane إلى 2 في المائة، والحفاظ عليه طوال العملية الجراحية.
- تطهير جلد الماوس وتعقيم أنه بالمسح بالقطن المعقم الإيثانول 70% غارقة.
2-الجراحة
-
ظهرت جزئية
- جعل شق عرضية من حوالي 1 سم في الجلد تحت القص، عمودي فقط إلى عملية الرهابه ومواز للقفص الصدري، مع مساعدة مقص التشغيل مباشرة.
- فصل الجلد مرفقة مع طبقة العضلات البطن محيط قطعي بالملقط أو نصائح القطن ترطب العقيمة للتمييز بين الجلد وطبقة العضلات البطن بلطف. نقع منطقة الأدمة مع برنامج تلفزيوني استخدام تلميحات القطن المعقمة للتهرب من جفاف.
- تعرض منطقة الفص الأيسر بسلاسة بجعل شق عرضية من خلال طبقة البريتوني تحت فقط الرهابه. استخدام اثنين القطن ترطب نصائح لفضح ورفع الفص الأيسر من الكبد.
- ضع واحد من نصائح القطن على الجانب البطني من القطع، ومكان آخر نصيحة القطن من ناحية الحجاب الحاجز. اضغط نصيحة وضع نحو الحجاب الحاجز برفق، وإعطاء دفعة انزلاق من طرف أخرى برفع الفص الأيسر من الكبد.
- كشف خيط نايلون مع حلقة من خلال الفص الأيسر رفع، والشرائح في الحلقة نحو قاعدة الفص الأيسر قريبة من هيلوم مع مساعدة نصائح الملقط الصغير أو القطن. ادفع برفق أسفل حلقة الخيط النايلون لقاعدة للفص الأيسر.
- ربط طرفي الخيط النايلون فوق الجزء العلوي من الفص الأيسر استخدام حامل إبرة الجراحة الدقيقة والملقط الصغير. جعل اثنين عقده إضافية على الجانب الآخر.
- تشريح خارج الفص مقيدة بمساعدة المقص. لا تحاول قطع جداً قريبة من الموضوع. في حالة الإجراء الذي يدوم أكثر من 5 دقائق، الحفاظ على التجويف الصفاقى وأجهزة رطبة مع PBS العقيمة لتجنب جفاف بسبب فقدان السوائل.
- خياطة الصفاق بخياطة استخدام المستمر خياطة الوتر 4-0. بعد ذلك، قم بإغلاق الجلد بخياطة متقطع بأقصى سرعة ممكنة.
-
زرع الخلايا
ملاحظة: خلايا الكبد وإذ تعرب عن التجارة والنقل كانت معزولة من الفئران المحورة وراثيا في التجارة والنقل (C57BL/6--تيراغرام (UBC-التجارة والنقل) 30 Scha/J)، وفقا للإجراء الذي وصفته لي وآخرون. 22 وشين وآخرون. واستخدمت تتمثل مثل الخلايا (نيوهيب) من أصل البشرية المتباينة من وحيدات24 23 أيضا لزرع الأعضاء. ومع ذلك، يمكن أيضا الخلايا المشتقة من أي مصادر أخرى في البروتوكول.- تعليق 0.2 مليون خلايا قابلة للحياة في حوالي 50 ميليلتر من المتوسطة (إيمدم "تعديل دولبيكو" ل Iscove)، ونضح أنه في حقنه الأنسولين 1 مل توج بإبرة 30 جرام. الاحتفاظ حقنه الباردة بوضعه على الجليد.
- ضع الماوس بطريقة الجزء الجانبي الأيسر يواجه تجاه الشخص الذي يقوم بعملية جراحية. تحديد منطقة الطحال والعرض تشريح الجلد بالقرب من منطقة هيبوتشوندرياك، تليها شق قصيرة من خلال طبقة البريتوني فقط لفضح الطحال.
- بلطف رفع الطحال وتعقد خارج تجويف بمساعدة اثنين من برنامج تلفزيوني مبلل نصائح القطن.
- عقد الطحال بعناية مع نصائح القطن اثنين في يد واحدة، ومكان الإبر المحاقن بالضبط الرأسي للطحال. بلطف بيرس الطحال ودفع الإبرة ببطء شديد في الداخل؛ لا يجب أن تحصل على الإبرة أعمق من 2 مم.
- دفع أسفل مكبس المحاقن ببطء حقن الخلايا في الطحال. بعد زرع الأعضاء، تبقى الإبرة للمحاقن مستقرة وإزالته ببطء من الطحال لتجنب نزيف أو فقدان الخلايا.
- بعد وضع الطحال مرة أخرى في التجويف الصفاقى مع نصائح القطن، إغلاق الطبقة البريتوني بخياطة مستمرة مع خياطة الوتر 4-0. خياطة الجلد بخياطة نفس discontinuously. تجنب استخدام مقاطع الجرح لإغلاق الجلد؛ بدلاً من ذلك، بإغلاقه قبل خياطة 4-0. مقاطع الجرح تقييد الحركة الطبيعية للماوس، ومقاطع غالباً ما تصبح فضفاضة ويخرج بسرعة.
3-بعد العمليات الجراحية الرعاية
- بعد إغلاق الجلد، مسح المنطقة المحيطة بكل المواقع خياطة الجروح بمحلول اليود (تدين) استخدام تلميح القطن معقمة.
- حقن جرعة من المضادات الحيوية cefotaxime كما 600 مغ/كغ وزن (عادة cefotaxime 12 ملغ في 100 ميليلتر من المحلول الملحي/الماوس) جسم إينترابيريتونيلي استخدام المحاقن 1 مل.
- إعطاء جرعات يومية من ميلوكسيكام مسكن ك 1 مغ/كغ من وزن الجسم (عادة 12 ميكروغرام ميلوكسيكام في 100 ميليلتر من المحلول الملحي/الماوس) للحيوان إينترابيريتونيلي، لمدة تصل إلى ثلاثة أيام بعد الجراحة.
- بعد الانتهاء من عملية جراحية، وقف تدفق الغاز isoflurane وضع الماوس مرة أخرى في القفص التهوية على حدة.
4-يوثانيزيشن والأوصاف
- وبعد اندبوينتس التجريبية (1 يوم و 10 أيام بعد الجراحة)، euthanize الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية الحيوان المؤسسية.
- جمع الدم بالنزيف الميؤوس من شفائهم الحيوانات، وثقب الضفيرة المحطة الطرفية العين.
- عزل المصل من الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتمثل في انتشار بعد 30% ظهرت الجزئي: انتشار خلايا الكبد في بقية الكبد بعد 30% ظهرت بحثت المناعي (المدينة) تلطيخ لعلامة انتشار الخليوي، كي-67. ظهرت بعد يوم واحد، كانت euthanized الفئران والفصوص الكبد المتبقية قد اقتطعت وتم الحصول على مقاطع البارافين. المقاطع كانت ملطخة بجسم كي-67، متبوعاً بوضع العلامات مع الفجل البيروكسيديز (HRP) مترافق جسم الثانوية. دي الأمينية البنزيدين (DAB) استخدمت كالركيزة لبرنامج الصحة الإنجابية لوضع اللون البنى لتحديد الخلايا الملون. وكان النواة العداد الملون مع الهيماتوكسيلين والنظر إليها تحت مجهر موضوعية X 20. ويبين الشكل 1 صورة المدينة ممثل قسم الكبد. حوالي 13% خلايا (± 13.66 0.317، N = 3) بأن كي-67 الإيجابية، التي أكدت أن ظهرت نسبة 30% ويسهل انتشار خلايا الكبد في الكبد الماوس.
الدراسة التشريحية: صورة تمثيلية للكبد من إيماءة. مشمولان الماوس، 10 أيام ظهرت وظيفة هو هو مبين في الشكل 2. هذه الصورة أكد أن الكبد المتبقية سليمة مع لا شذوذ مرئية.
وجود الخلايا المزروعة خلال الساعة الأولى من الجراحة: وأكد صاروخ موجه الخلايا المزروعة مع تدفق سيتوميتريك تحليل فحص وجود خلايا الكبد إيجابية بروتينات فلورية خضراء 2 ساعة بعد زرع الأعضاء.
تم الحصول على تعليق خلية مفردة من الطحال والكبد من الماوس المضيف بعد الهضم الأنزيمي الأنسجة قصت بعد ساعتين زرع خلايا الكبد بروتينات فلورية خضراء. وقدرت النسبة المئوية لزرع الخلايا إيجابية في التجارة والنقل استخدام cytometer تدفق. تم اختيار بوابة مبعثر من المؤامرة دوت SSC منتدى التعاون الأمني القضاء على الخلايا الحطام ويبنوا المقابلة. تم إنشاء بوابة رباعي المؤامرة بكثافة fluorochrome الخلفية من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من الطحال والكبد بالماوس التحكم التي تم زرع خلايا لا. تم العثور على خلايا الكبد بروتينات فلورية خضراء إيجابية في الطحال حوالي 1.7 في المائة، وتم العثور على لا خلايا الكبد بروتينات فلورية خضراء في الكبد 2 ساعة بعد زرع الأعضاء. وترد البيانات الممثلة في الشكل 3.
إيمونوهيستوتشيميستري: جراحة بعد عشرة أيام، كانت euthanized الفئران، والفص الجانبي حق والفص حق الآنسي والفصوص الآنسي الأيسر للكبد وقد اقتطعت وتمزيقها البرد وأجرى للحصول على 5 ميكرومتر المقاطع. ثم درست هذه المقاطع لصاروخ موجه وانجرافتمينت للخلايا المزروعة. ويبين الشكل 4 صور الممثل المناعي (المدينة) تلطيخ ضد مكافحة-التجارة والنقل (الأحمر) التعرف على بروتينات فلورية خضراء معربا عن الفئران من خلايا الكبد (الفريق أ وب وج)؛ وضد الإنسان المضادة الزلال (أحمر)، فضلا عن الإنسان المضادة كونيكسين 32 (الأخضر)، لتحديد الخلايا تتمثل مثل (نيوهيب) من أصل البشرية (لوحة د، ه، و، و زاي). وكان كونتيرستينيد النواة مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، الأزرق) في كل الحالات. في هذه اللوحات صورة، التجارة والنقل انجرافتيد قليلة التعبير عن خلايا الكبد (الفريق أ وب وج) ونيوهيب (لوحة د، ه، و، وز) واضحة للعيان.
تحليل الكيمياء الحيوية للكبد يفرز الإنزيمات: وبغية التحقق من الأداء الوظيفي للكبد بعد العملية الجراحية، أجرى تحليل البيوكيميائية مختلفة إنزيمات يفرزها الكبد. شريط الرسوم البيانية في الشكل 5 تمثل قيمة الوسطية اسبارتاتي aminotransferase (AST)، ألانين aminotransferase (ALT) والفوسفاتيز القلوية (كيه-فوس) في المصل الإيماءة صحية. مشمولان الفئران، ومجموعات مختلفة من الفئران هيباتيكتوميزيد جزئيا. يتضح من الرسم البياني أن بعد يوم واحد من ظهرت، مستويات إنزيمات AST و ALT وكيه-فوس زادت زيادة كبيرة، بالمقارنة مع الفئران صحية.
مستويات إنزيم ALT و AST أعيدت إلى وضعها الطبيعي، بينما مستويات كيه-فوس مرتفعا بعد عشرة أيام من إجراء عملية جراحية في الفئران غير زرع. ومع ذلك، مستويات الإنزيمات الثلاثة جميع انخفض إلى العادي في الفئران زرع بعد 10 أيام.
دراسة الكبد النسيجي: كذلك تم تجهيز عينات الكبد هيباتيكتوميزيد والفئران زرع للتحليل النسيجي لدراسة التغيرات التشريحية بعد الجراحة. ويبين الشكل 6 ميدان مشرق الممثل الصور الهيماتوكسيلين وويوزين (ح وه) الملون أقسام الكبد من الفئران صحية دون جراحة، يوم 1 وظيفة ظهرت الجزئي وبعد 10 أيام ظهرت جزئية وزرع نوب. في هذه الصور، ولوحظ تلف الكبد بسبب انتشار التليف أو النسيج الضام المحيطة الصفراوية خفيف بعد يوم 1 من ظهرت جزئيا، ولم يلاحظ أي شذوذ عشرة أيام ما بعد الجراحة.
الشكل 1 : صورة تمثيلية لكي-67 تلطيخ الإيماءة. قسم مشمولان الكبد بعد يوم واحد من ظهرت 30%- قسم كانت ملطخة بجسم كي-67 والفجل البيروكسيديز (HRP) مترافق جسم الثانوية، والدأب (براون) كبرنامج الصحة الإنجابية الركيزة وكانت كونتيرستينيد الأنوية التي توضع (أزرق). رؤوس الأسهم الإرشادية نشير إلى بعض الخلايا (براون) إيجابية كي-67. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مجدد الفصوص الكبد الإيماءة. مشمولان الماوس 10 أيام ما بعد الجراحة- ج: كاوداتي الفص (عملية Caudate)، ب: الحق الفص الجانبي، c: حق الآنسي الفص، d: ترك الفص الآنسي، قلب هاء، واو: المتبقي من الفص الجانبي الأيسر بعد ظهرت، وزاي: caudate الفص (عملية الحليمية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : النسبة المئوية للتجارة والنقل هيبتاتوسيتيس الماوس الإيجابية في الطحال والكبد الإيماءة. ماوس مشمولان. لوحات العلوي إظهار صورة الماوس التحكم المتطابقة العمر الذي تم زرع خلايا لا خلية. إظهار لوحات أقل الشخصية الخلية 2 بعد ساعات زرع تتمثل التجارة والنقل في ماوس هيباتيكتوميزيد. المحور y من المؤامرات يدل على شدة الأسفار للتجارة والنقل (قناة فيتك) تقاس بوحدات التعسفي على نطاق سجل، ويدل على المحور x المبعثر إلى الأمام (FSC) في وحدات التعسفي على نطاق خطي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : استضافة أكثر من زرع بروتينات فلورية خضراء معربا عن الماوس خلايا الكبد ونيوهيب في الكبد المضيف المجددة. إيماءة الصور التمثيلية لأقسام الكبد من هيباتيكتوميزيد جزئيا. مشمولان الماوس زرعها مع بروتينات فلورية خضراء الماوس إيجابية خلايا الكبد (أ-ج)، عرض الخلية انجرافتمينت وصاروخ موجه. الفريق ج: نواة (الأزرق: DAPI)، "الفريق باء:" مكافحة-التجارة والنقل (الأحمر: أليكسا فلور 594)، صورة "الفريق جيم:" ممزوج. تظهر لوحات (د-ز) قسم الكبد شكل جزئي هيباتيكتوميزيد إيماءة. ماوس مشمولان في نوب التي تم زرعها. الفريق d: نواة (الأزرق: DAPI)، "هاء: لوحة" البشرية المضادة كونيكسين 32 (الأخضر: أليكسا فلور 488)، "واو: لوحة" الزلال المضادة الإنسان (الأحمر: أليكسا فلور 594) والصورة ممزوج "زاي: الفريق". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تحليل الكيمياء الحيوية للكبد مختلفة ويفرز الإنزيمات في مصل الفئران. أشرطة عمود تمثل القيم الوسطية للإنزيمات المختلفة (AST/سجوت، ALT/سجبت، كيه-فوس). تظهر نقطة الوقت لدراسة ما بعد الجراحة على المحور س. في مجموعة المراقبة، هناك تطابق العمر إيماءة. تم إجراء لا جراحة والفئران مشمولان. أشرطة الخطأ يعني الخطأ المعياري للوسط، N = 3 و * يشير إلى ف< 0.05، NS يشير إلى عدم أهمية في p> 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : دراسة نسيجية للفئران الكبد الأنسجة المقاطع. الصور مجهرية الممثل الميداني مشرق ه الهيماتوكسيلين ويوزين (ح وه) الملون مقاطع أنسجة الكبد الإيماءة. الفئران إخضاعها تحت عدسة الهدف X 20. تظهر لوحة بقسم كبد من إيماءة بصحة جيدة. ماوس إخضاعها لنفس الفئة العمرية دون أي عملية جراحية. تظهر لوحة ب قسم كبد يوم 1 ظهرت وظيفة جزئية. في هذه الصورة، تشير رؤساء السهم إلى منطقة انتشار التليف أو النسيج الضام المحيطة-billiary معتدل. تظهر لوحة ج قسم كبد عشرة أيام وظيفة جزئية ظهرت وخلية زرع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ظهرت الجزئي أسلوب المنشأة لتجديد الكبد التحقيق، وذكر ظهرت المفرط لتقليد النموذج أف. بين نماذج حيوانية من أف، من القوارض، خاصة من الفئران، نموذج بحث آخر. للحصول على نموذج إصابة كبد في الفئران، حتى ظهرت 70% سجلت مع25،معدل البقاء على قيد الحياة جيدة26. ومع ذلك عارية وأخرى الماوس العوز، ظهرت 70% أفيد كقاتلة والحيوانات توفي خلال 24 ساعة27.
ميتشل وويلينبرينج28 أظهر أسلوب جيد التحمل واستنساخه لظهرت الجزئي 2/3 في الفئران. للايماءة. مشمولان الفئران، حصلنا على معدل 100 ٪ البقاء على قيد الحياة عندما كانت مقيدة حتى استئصال فص الكبد الأيسر، وما يقرب من 30% من مجموع كتلة الكبد ظهرت. تمشيا مع الملاحظات في الفئران عارية27، لاحظنا أن أي زيادة في النسبة المئوية لظهرت في إيماءة. الماوس مشمولان يؤدي إلى خفض كبير لمعدل البقاء على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك، تأكيد انتشار خلايا الكبد في بقية الكبد الفصوص نشر يوم 1 من 30% الجزئية ظهرت فائدة هذا الإجراء في الدراسات انجرافتمينت وزرع.
في ورقة أكثر حداثة، أحمد S.U. et al. وقد أظهرت 29 إجراء لتكثيفها أحياناً سرطانه الخلية الكبدية في الفئران العوز. وأظهرت أنهم إجراء لزرع الخلايا السرطانية في مختلف الأجهزة، بما في ذلك الطحال، وظهرت لتسهيل انجرافتمينت أحياناً.
في الإجراءات التي أبلغت عنها ميتشيل28 وأحمد29، هناك فرصة لإدخال التحسينات شقوق أصغر بكثير، كما شقوق صغيرة ويفضل عموما في الجراحة. وهناك أدلة30 شق جراحي طول أصغر يؤدي إلى إفراز أقل من هرمونات الإجهاد، مثل الكورتيزول والكاتيكولامينات. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن الإجراءات التي تنطوي على أكبر شق واحد يتطلب مستوى أعلى من المهارات، وهي أكثر صعوبة استخراج، مقارنة بإجراءات وجود شقوق أصغر اثنين.
في هذه الورقة، التي وصفناها إجراءات التي تتطلب الحد الأدنى من شق لفضح الفص الأيسر من الكبد، وبعد أداء ظهرت نسبة 30 في المائة، وكان إجراء شق صغير آخر لفضح الطحال حيث تم زرع الخلايا. هذا الإجراء لا يتطلب أي مهارات جراحية متخصصة ويمكن أن تكتمل في 5-7 دقيقة. وعلاوة على ذلك، وجدنا أي دليل على وجود أي شذوذ المورفولوجية أو تشريحية في كتلة الكبد المتبقية، كما يتضح من الدراسات النسيجي. وعلاوة على ذلك، كان هناك وجود الاسكيمية أو نخر أثناء العملية الجراحية للأسبوع 6-8-المناعة القديمة للخطر الفئران. التعريفي لإصابة الكبد بعد تأكيد ظهرت جزئيا بمستويات مرتفعة من إنزيمات الكبد AST و ALT وكيه-فوسين المصل الفئران. اختير عن طريق إينتراسبلينيك لزرع الخلايا عبر طرق أخرى الوريدية، نظراً لأن نظام وريدي المدخل لديه إمكانية الوصول إلى أعلى في القشرة الكبد من النظم الأخرى وريدي. لقد أظهرنا زرع خلايا الكبد معزولة عن ماوس بروتينات فلورية خضراء المعدلة وراثيا ونوب هي متباينة تتمثل مثل خلايا المنشأ البشرية، في صورة جزئية هيباتيكتوميزيد إيماءة. الحيوانات إخضاعها. هذا الإجراء لا يقيد نوع الخلايا المستخدمة لزرع الأعضاء.
ومع ذلك، هذا الإجراء لا إنشاء الشرط AHF في ماوس، كما يتم تنفيذ سوى 30% ظهرت جزئية. يوفر هذا ظهرت محدودية إمكانات التكاثري لخلايا الكبد في الكبد المتبقية، والتي مما يوفر فرصاً إضافية لزرع خلايا الكبد انجرافتمينت. أنها فقط يدل على الهجرة وانجرافتمينت من خلايا الكبد، ونوب من الطحال إلى الكبد، وأي ضرر إضافي للكبد يتم عن طريق عملية زرع الأعضاء.
على كل، هذا الإجراء بسيطة، ويمكن يمارس ويتقن بسهولة الحصول على النتائج استنساخه. ويمكن بسهولة تقييم إمكانات التجدد من عدة مصادر الخلوية (الخلايا الجذعية أو الخلايا مثل تتمثل) في سياق إصابة الكبد، أو دراسة تجديد الكبد، مع هذا الإجراء الجراحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المنحة الأساسية الواردة من إدارة التكنولوجيا الأحيائية، "حكومة الهند" إلى "المعهد الوطني لعلم المناعة"، نيودلهي. الدكتور بهاتاشارجى العنوان الحالي هو شعبة من أمراض الجهاز الهضمي والكبد والتغذية ومستشفى لوس أنجليس في الأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
