Summary
Vi har beskrevet en protokol for at udføre delvis hepatectomy (PHx) og celle transplantation via milten i Nik. SCID (NIK. CB17-Prkdcscid/J) mus. I denne protokol, er et snit lavet til at afsløre og resect venstre lap af leveren efterfulgt af et andet snit til intrasplenic transplantation af celler.
Abstract
Delvis hepatectomy er en alsidig og reproducerbar metode til at studere lever regenerering og effekten af celle-baserede therapeutics i forskellige patologiske tilstande. Delvis hepatectomy letter også øget engraftment og spredning af transplanterede celler af accelererende neovascularization og celle migration til leveren. Her beskriver vi en enkel protokol for udfører 30% hepatectomy og transplantation af celler i milt fra en ikke-overvægtige diabetikere/svær kombineret immundefekte NOD. SCID (NIK. CB17-Prkdcscid/J) mus.
I denne procedure, er to små snit lavet. Den første indsnit er at eksponere og resect venstre lap af leveren, og en anden lille snit er lavet til at afsløre milt for intrasplenic transplantation af celler. Denne procedure kræver ikke nogen specialiserede kirurgiske færdigheder, og det kan være afsluttet i 5-7 minutter med mindre stress og smerter, hurtigere helbredelse og bedre overlevelse. Vi har demonstreret transplantation af hepatocytter isoleret fra en grøn fluorescerende protein (NGL) udtrykker mus (genetisk modificeret C57BL/6-Tg (UBC-NGL) 30Scha/J), samt hepatocyt som celler af human oprindelse (NeoHep) i delvis hepatectomized hilsen. SCID mus.
Introduction
I øjeblikket er hepatocyt transplantation foreslået som et alternativ til hele organtransplantation for behandling af patienter med alvorlige leversygdomme. Det menes, at det kan slå bro over patienter til hele orgel transplantation1. Ud over allogen hepatocytter2, xenogen hepatocytter3 og hepatocytter stammer fra stamceller4 er også ved at blive undersøgt i dyremodeller. I denne sammenhæng, målsøgende og engraftment er potentialet i de transplanterede celler i modtageren et vigtigt kriterium for celle-baserede terapi i akut leversvigt (AHF).
For at undersøge transplantation af hepatocytter eller hepatocyt-lignende celler5, er AHF lavet i en dyremodel af kirurgisk6 eller farmakologiske7 procedurer, efterfulgt af transplantation af celler. At gøre en AHF dyremodel af farmakologiske reagenser, mange hepatotoxins d-galactosamine8, acetaminophen9, tetrachlormethan10, thioacetamide11, Concanavalin A12, LPS13 , osv., har været brugt. Fra denne liste, hver reagens genererer et unikt sæt af funktioner for AHF, men desværre ingen enkelt reagens efterligner de menneskelige AHF. Derudover AHF induceret af hepatotoxins tager lang tid, der sætter dyr under kronisk stress, og reproducerbare resultater er vanskelig at opnå.
På den anden side den kirurgiske procedure af delvis hepatectomy (PHx) er dygtighed afhængige, og reproducerbare resultater er let at opnå efter udvikler nødvendige færdigheder. For at fremkalde AHF ved kirurgisk indgreb alene, er resektion af mere end 70% af leveren påkrævet; dog transplanterede mindre end en 70% hepatectomy kan stadig udnyttes til at studere engraftment og spredning af celler i leveren til at analysere deres terapeutiske kapacitet under leverskader14. Transplantation af hepatocytter har været udført post hepatectomy gennem bughinden15, hale vene16, leverens vene17eller milt18. I øjeblikket, er leverens vene infusion og intrasplenic transplantation af hepatocytter de foretrukne procedurer, så de er nemmere at reproducere.
I dette papir, har vi beskrevet en procedure for en 30% delvis hepatectomy i NOD. SCID (NIK. CB17-Prkdcscid/J) mus, hvor den venstre lap af leveren er skåret ud. Det er efterfulgt af transplantation af 0,2 millioner normal god landbrugspraksis udtrykker mus (C57BL/6-Tg (UBC-NGL) 30Scha/J) hepatocytter samt menneskelig oprindelse NeoHep19 i milten. Denne fremgangsmåde fører til engraftment af de transplanterede celler i leveren. Denne procedure er den mindst invasive og et minimalt smertefulde teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerne i denne protokol er blevet godkendt af den institutionelle dyr etiske komité i den nationale Institut for Immunology, New Delhi. Seriel referencenummeret for godkendelsen er IAEC #319/13.
Bemærk: Der er gode ressourcer på almen kirurgi procedurer20 og specifikke protokoller for gnavere kirurgi21. For dem, der gør dyrenes kirurgi for første gang, er det anbefales til omfattende praksis kirurgiske procedurer på dummies før opererer på dyr.
1. forberedelse
- Før forsøget, holde sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) eller saltvand klar.
- Samle en kirurgi kit indeholder saks, savtakket pincet, væv pincet, bomuld, vatpinde, nylon tråde og forskellige mikro nål indehavere. Autoklave kirurgi kit. Særlig omhu bør tages, hvis en immun-kompromitteret NIKKE. SCID mus er medtaget i protokollen.
- Udføre komplet forsøgsmetoden, fra forberedelse til slutningen af kirurgi, i bio-sikkerhed klasse I kabinettet.
- Veje en hilsen. SCID mus af 6-8 uger gamle før operationen. Mus vejer mellem 14-18 g bruges i denne undersøgelse.
- Barbere den øverste centrale og hypokonder maveregionen musen med hår trimmer. Anvende hår fjerner creme jævnt i hele regionen med en spatel til helt at fjerne de trimmet hår. Fjern hår forsigtigt ved hjælp af et stykke vådt sterile bomuld efter 2-5 min.
- Placere musen i isofluran kammeret og låse op ventilen af oxygen cylinder. Opretholde ilt flowet med en sats på 4 L/min og isofluran fordampningsvarme på 4% til at fremkalde anæstesi.
- Sikre, at musen har været bedøvede ordentligt af blid tå klemme.
- Placer en kirurgi bord inde en biosikkerhed kabinet. Placere dyret ombord kirurgi, således at den ventrale del af musen vender opad og den forreste del af musen er placeret inde i næsen kegle tilsluttet isofluran og ilt levering.
- Reducere isofluran fordampningsvarme til 2%, og bevare det hele den kirurgiske procedure.
- Desinficere huden af musen og sterilisere det ved aftørring med 70% ethanol gennemblødt sterile bomuld.
2. kirurgisk Procedure
-
Delvis Hepatectomy
- Foretage en tværgående snit omkring 1 cm i huden, lige under brystbenet, vinkelret på formet som et sværd proces og parallelt med brystkassen, ved hjælp af lige drift saks.
- Forsigtigt adskille huden fastgjort med mavemuskel lag omkring området indridset med pincet eller sterile fugtede bomuld tips til at skelne mellem hud og mavemuskel lag. Nyd den intradermale region med PBS ved hjælp af steril bomuld tips til at undgå udtørring.
- Afdække området i venstre lap glat ved at lave et tværgående snit gennem det peritoneal lag lige under formet som et sværd. Bruge to fugtede bomuld tips til at afsløre og løft den venstre lap af leveren.
- Placer en af bomuld tips i abdominal side af snittet, og sæt en anden bomuld tip i mellemgulvet side. Forsigtigt at trykke spidsen placeret mod mellemgulvet og give en glidende tryk af de andre tip og løft den venstre lap af leveren.
- Slip en nylon tråd med en sløjfe gennem det løftede venstre lap, og skub loop mod bunden af den venstre lap tæt på hilum ved hjælp af mikro-pincet eller bomuld tips. Skub forsigtigt ned nylon tråd loop til bunden af venstre lap.
- Binde to ender af nylon tråd over toppen af den venstre lap ved hjælp af en mikrokirurgi nål holder og mikro pincet. Gøre to ekstra knob på anden siden.
- Dissekere ud den bundne lap med hjælp af saks. Forsøg ikke at skære meget tæt på tråden. I tilfælde af proceduren, der varer mere end 5 min, holde bughulen og organer fugtig med steril PBS til at undgå udtørring som følge af væsketab.
- Sy bughinden af løbende sutur bruger en 4-0 Tarmstrenge sutur. Efterfølgende, lukke huden ved diskontinuerlige suturering så hurtigt som muligt.
-
Celle Transplantation
Bemærk: Normal god landbrugspraksis udtrykker hepatocytter blev isoleret fra transgene normal god landbrugspraksis mus (C57BL/6-Tg (UBC-NGL) 30 SchÃ/J), ifølge proceduren beskrevet af Lee mfl. 22 og Shen mfl. 23 hepatocyt-lignende celler (NeoHep) af menneskelig oprindelse differentieret fra monocytter24 blev også brugt til transplantation. Celler, der stammer fra andre kilder kan dog også bruges i protokollen.- Suspendere 0,2 millioner levedygtige celler i omkring 50 µL af Iscoves modificerede Dulbecco Medium (IMDM), og Opsug den i en 1 mL insulin sprøjte udjævnede med 30G kanyle. Hold sprøjten koldt ved at placere det på is.
- Placer musen på en måde, at den venstre lateral del vender mod den person, der udfører kirurgi. Identificere området milt og paa tvaers dissekere huden i nærheden hypokonder regionen, efterfulgt af en kort snit gennem laget peritoneal blot at udsætte milten.
- Forsigtigt løfte milten og holde det udenfor hulrum med hjælp fra to PBS fugtet bomuld tips.
- Hold milt omhyggeligt med to bomuld tips i den ene hånd, og Placer nålen i sprøjten præcis lodret til milten. Forsigtigt gennembore milten og tryk nålen meget langsomt inderside; nålen skal ikke komme dybere end 2 mm.
- Skubbe ned stempel af sprøjten langsomt at injicere cellerne i milt. Efter transplantation, holde nålen af sprøjten stabil og fjerne det langsomt fra milt at undgå blødning eller tab af celler.
- Efter at placere milten tilbage ind i bughulen med bomuld tips, lukke peritoneal laget af løbende sutur med en 4-0 Tarmstrenge sutur. Sy huden diskontinuerlig med den samme sutur. Undgå at bruge sår clips til at lukke huden; i stedet lukke den af en 4-0 sutur. Sår klippene begrænse den naturlige bevægelse af musen, og ofte klip bliver løs og kommer hurtigt.
3. postoperative pleje
- Efter lukning af huden, tør omgivelser af begge sutur websteder med jodopløsning (betadine) ved hjælp af en steril bomuld tip.
- Indsprøjtes en dosis af antibiotika cefotaxim som 600 mg/kg kropsvægt (typisk 12 mg cefotaxim i 100 µL af saltvand/mus) intraperitoneal ved hjælp af 1 mL sprøjte.
- Give daglige doser af smertestillende Meloxicam som 1 mg/kg legemsvægt (typisk 12 µg Meloxicam i 100 µL af saltvand/mus) til dyr intraperitoneal, i op til tre dage efter operationen.
- Efter afslutning af kirurgi, stoppe strømmen af isofluran gas og placere musen tilbage i individuelt ventileret buret.
4. euthanization og beskrivelser
- Efter de eksperimentelle end-point (1 dag og 10 dage efter operationen), aflive mus ifølge retningslinjerne for institutionelle Dyreetik.
- Indsamle blod af uhelbredeligt blødning dyr, punktering okulær terminal plexus.
- Isolere serum fra blod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyt spredning efter 30% delvis hepatectomy: Spredning af hepatocytter i de resterende lever efter 30% hepatectomy blev undersøgt ved immunhistokemiske (IHC) farvning til celle spredning markør, Ki-67. Endags-post hepatectomy, mus blev aflivet, de resterende lever kamre var skåret ud og paraffinsnit blev indhentet. Sektionerne var plettet med Ki-67 antistof, efterfulgt af mærkning med peberrod peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundær antistof. Di-Amino benzidin (DAB) blev brugt som substrat for HRP for udvikling af brun farve til at identificere farvede celler. Kernen var tæller farves med hæmatoxylin og set på under 20 X objektive mikroskop. Figur 1 viser et repræsentativt IHC billede af en lever sektion. Omkring 13% af celler (13.66 ± 0.317, N = 3) var Ki-67 positive, som bekræftede, at en 30% hepatectomy letter udbredelsen af hepatocytter i mus leveren.
Anatomisk undersøgelse: Et repræsentativt billede af leveren af et nik. SCID mus, 10 dage post hepatectomy er vist i figur 2. Dette billede bekræftede, at de resterende leveren var sund med ingen synlige abnormiteter.
Tilstedeværelse af transplanterede celler i første time i kirurgi: Homing af de transplanterede celler blev bekræftet med flow cytometric analyse ved at undersøge forekomsten af normal god landbrugspraksis positive hepatocytter 2 timer efter transplantation.
En enkelt cellesuspension blev fremstillet af milt og lever af værten musen efter Enzymatisk nedbrydning af skåret væv post 2 timer i normal god landbrugspraksis-hepatocytter transplantation. Procentdelen af transplanterede normal god landbrugspraksis positive celler blev anslået ved hjælp af en flow Flowcytometret. En scatter gate blev valgt fra det tilsvarende FSC-SSC dot plot til at fjerne snavs og doublet celler. Quadrant gate af plottet var lavet af baggrunden fluorokrom intensiteten af celle suspensioner fremstillet af milt og lever af en kontrol mus hvor ingen celler blev transplanteret. Omkring 1,7% normal god landbrugspraksis positive hepatocytter blev fundet i milten, og ingen normal god landbrugspraksis hepatocytter blev ikke fundet i leveren 2 timer efter transplantation. Repræsentative data er vist i figur 3.
Immunhistokemi: Ti dage efter operationen, musene blev aflivet, og den højre laterale lap, lige mediale lobe og venstre mediale lapper i leveren var skåret ud og cryo-skæring blev udført for at opnå 5 µm sektioner. Disse sektioner blev derefter undersøgt målsøgende og engraftment af de transplanterede celler. Figur 4 viser de repræsentative billeder af immunhistokemisk (IHC) farvning mod anti-normal god landbrugspraksis (rød) til at identificere normal god landbrugspraksis udtrykker mus hepatocytter (panel A, Bog C); og mod-anti-humant albumin (rød), samt-anti-humant connexin 32 (grøn), til at identificere hepatocyt-lignende celler (NeoHep) af human oprindelse (panel D, E, Fog G). Kernen var counterstained med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå) i begge tilfælde. I disse billede paneler, et par aflægger NGL udtrykker hepatocytter (panel A, Bog C) og NeoHep (panel D, E, Fog G) er klart synlige.
Biokemiske analyser af leveren udskilles enzymer: For at kontrollere funktionen af leveren efter den kirurgiske procedure, blev biokemiske analyser af forskellige udskilles leverenzymer udført. Søjlediagrammer i figur 5 repræsenterer middelværdien af aspartat aminotransferase (AST), alanin aminotransferase (ALT), og alkalisk fosfatase (ALK-billederne) i serum sund NOD. SCID mus, og forskellige grupper af delvist hepatectomized mus. Det fremgår af grafen at efter 1 dag i hepatectomy, niveauer af AST, ALT og ALK-billederne enzymer øges betydeligt, når man sammenligner med de sunde mus.
ALT og AST enzym niveau blev gendannet til normale, mens ALK-billederne niveauer forblev højt post ti dage kirurgi i ikke-transplanteret mus. Dog niveauer af alle tre enzymer faldet til normale i transplanterede musene efter 10 dage.
Lever histologisk undersøgelse: De lever prøver af hepatectomized og transplanterede mus var videreforarbejdes til histologisk analyse at studere anatomiske ændringer efter operationen. Figur 6 viser de repræsentative lysfelt billeder af hæmatoxylin og eosin (H og E) farves lever dele af sunde mus uden kirurgi, 1 dag bogføre delvise hepatectomy og 10 dage efter delvis hepatectomy og NeoHep transplantation. I disse billeder, leverskader på grund af den milde peri-biliær fibrose eller bindevæv spredning blev observeret efter 1 dag af delvis hepatectomy, og ingen deformiteter blev observeret 10 dage efter operationen.
Figur 1 : Et repræsentativt billede af Ki-67 farvning af NOD. SCID lever afsnit efter 1 dag i 30% hepatectomy. Afsnit var plettet med Ki-67 antistof, peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundær antistof, og DAB (brun) blev brugt som HRP substrat og kerner blev counterstained af hæmatoxylin (blå). De vejledende pilespidser påpege nogle af Ki-67 positive (brun) celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Regenereres lever kamre af et nik. SCID mus 10 dage efter operationen. A: spiegelske lap (spiegelske proces), B: højre laterale lap, C: ret mediale lap, D: venstre mediale lap, E: hjerte, F: resterende venstre laterale lap efter hepatectomy og G: spiegelske lap (papillære proces). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Procentdelen af normal god landbrugspraksis positive mus heptatocytes i milt og lever af en hilsen. SCID mus. De øverste paneler Vis den celle profil af en alder-matchede kontrol mus hvor ingen celler blev transplanteret. Lavere paneler viser profilen celle efter 2 timer i normal god landbrugspraksis hepatocyt transplantation i en hepatectomized mus. Y-aksen af observationsområderne betegner fluorescens intensiteten af normal god landbrugspraksis (FITC kanal) målt i arbitrære enheder på en log-skala, og x-aksen betegner den forward scatter (FSC) i arbitrære enheder på en lineær skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Homing af transplanterede normal god landbrugspraksis udtrykker mus hepatocytter og NeoHep i folier vært leveren. Repræsentative billeder af leveren dele af en delvist hepatectomized hilsen. SCID mus transplanteret med normal god landbrugspraksis positive mus hepatocytter (A-C), viser cellen engraftment og homing. Panel A: kernen (blå: DAPI), bedømmelseskomite B: anti-normal god landbrugspraksis (Red: Alexa Fluor 594), Panel C: fusioneret billede. Paneler (D-G) Vis lever sektion af delvist hepatectomized hilsen. SCID mus i hvilke NeoHep blev transplanteret. Panelet D: kernen (blå: DAPI), Panel E: menneskelige anti-Connexin 32 (grøn: Alexa Fluor 488), Panel F: humant anti-Albumin (Red: Alexa Fluor 594) og panelet G: fusioneret billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Biokemiske analyser af forskellige leveren udskilles enzymer i mus serum. Kolonne søjler repræsenterer de gennemsnitlige værdier af forskellige enzymer (AST/SGOT, ALT/SGPT, ALK-billederne). Tidspunkt for undersøgelsen efter operationen er vist på X-aksen. I kontrolgruppen, der var alder matchede NOD. SCID mus og ingen operation blev udført. Fejllinjer betyde standardafvigelsen på middelværdien, N = 3 og * angiver p< 0,05, NS angiver ikke betydning på p> 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Histopatologiske undersøgelse af mus leveren væv sektioner. Repræsentative lysfelt mikroskopi billeder af hæmatoxylin og eosin (H og E) farves levervæv sektioner NOD. SCID mus under 20 X mål linse. Panel A viser en sektion af lever fra en sund NOD. SCID mus i samme aldersgruppe uden nogen kirurgi. Panelet B viser en lever sektion 1 dag efter delvis hepatectomy. I dette billede angive pilespidser regionen mild peri-billiary fibrose eller bindevæv spredning. Panelet C viser en lever afsnit ti dage post delvise hepatectomy og celle transplantation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Delvis hepatectomy er en etableret teknik for behandlende lever regenerering, og overdreven hepatectomy er rapporteret at efterligne AHF model. Blandt dyremodeller af Husholdningsfolie af aluminium er gnavere, især mus, de mest undersøgte model. For at opnå en leverskade model i mus, op til en 70% hepatectomy er blevet rapporteret med en god overlevelse sats25,26. Men i nøgen og andre immundefekte mus, en 70% hepatectomy blev rapporteret som fatal og dyr døde inden for 24 timer27.
Mitchell og Willenbring28 demonstreret en reproducerbar og veltolereret metode for 2/3 delvis hepatectomy i mus. For Nik. SCID mus, vi opnåede en 100% overlevelsesrate når hepatectomy var begrænset til resektion af den venstre lever lap, som er næsten 30% af den samlede leveren masse. I overensstemmelse med observationerne i nøgen mus27konstaterede vi, at enhver yderligere stigning i procentdelen af hepatectomy i NOD. SCID musen fører til en dramatisk forringelse af overlevelsesraten. Derudover bekræftede spredning af hepatocytter i de resterende lever lapper post 1 dag af 30% delvis hepatectomy nytten af denne procedure i transplantation og engraftment undersøgelser.
I en nyere papir, Ahmed S.U. et al. 29 har demonstreret en procedure for intrahepatisk hepatocellulært carcinom xenografts hos immundefekte mus. De har vist en procedure for transplantation af tumorceller i forskellige organer, herunder milten, og udført hepatectomy for at lette intrahepatisk engraftment.
I de procedurer, der er rapporteret af Mitchell28 og Ahmed29, er der mulighed for forbedringer ved at gøre meget mindre incisioner, som mindre incisioner er generelt foretrækkes i kirurgi. Der er beviser30 der en mindre længde kirurgiske indsnit fører til mindre udskillelse af stresshormoner, såsom kortisol og catecholamin. Derudover fandt vi, at procedurer, der involverer et større indsnit kræver et højere niveau af færdigheder, og er mere vanskelige at formere, i forhold til procedurer har to mindre incisioner.
I dette papir, vi har beskrevet en procedure, hvor minimum indsnit er forpligtet til at udsætte den venstre lap af leveren, og efter at have udført en 30% hepatectomy, en anden lille snit blev gjort for at udsætte milten hvor celler blev implanteret. Denne procedure kræver ikke nogen specialiserede kirurgiske færdigheder og kan være afsluttet i 5-7 min. Derudover fandt vi ingen tegn på nogen morfologiske eller anatomiske abnormalitet i de resterende lever masse, som det fremgår af histologiske undersøgelser. Derudover var der et fravær af iskæmi eller nekrose i løbet af den kirurgiske procedure af 6-8 ugers-gamle immun kompromitteret mus. Induktion af leverskade efter delvis hepatectomy bekræftes af de forhøjede niveauer af leverenzymer AST, ALT og ALK-PHOSin mus serum. En intrasplenic rute blev valgt til celle transplantation over andre venøs ruter, fordi de portalen venøse system har højere tilgængelighed i leveren cortex end andre venøs systemer. Vi har demonstreret transplantation af hepatocytter isoleret fra transgene normal god landbrugspraksis musen og NeoHep, som er differentierede hepatocyt-lignende celler af human oprindelse, i delvis hepatectomized hilsen. SCID dyr. Proceduren, der begrænser ikke typen celler, der bruges til transplantation.
Men denne fremgangsmåde skaber ikke AHF tilstand i en mus, som kun en 30% delvis hepatectomy udføres. Denne begrænsede hepatectomy giver en proliferativ potentiale til hepatocytter stede i de resterende leveren, som dermed giver ekstra muligheder for transplanterede hepatocytter engraftment. Det kun viser migration og engraftment af hepatocytter, og NeoHep fra milten til leveren, og ingen yderligere skader på leveren sker ved transplantation procedure.
Over alle, kan denne procedure er enkel, og praktiseres og mestret nemt for at opnå reproducerbare resultater. Regenerativ potentiale af flere cellulære kilder (stamceller eller hepatocyt-lignende celler) inden for rammerne af leverskade eller leveren regenerering undersøgelse, kan nemt vurderes med denne kirurgiske procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af core tilskuddet modtaget fra Institut for bioteknologi, Indiens regering til de nationale Institut for Immunology, New Delhi. Dr. Bhattacharjee nuværende adresse er afdelingen for gastroenterologi, hepatologi og ernæring, children's Hospital Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
