Summary
Мы описали протокол для выполнения частичной гепатектомии (ФСК) и трансплантации клеток через селезенку в Нод. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/j) мышах. В этом протоколе разрез делается разоблачить и иссечения левой доли печени, последовал еще один разрез intrasplenic трансплантации клеток.
Abstract
Частичной гепатектомии является универсальным и воспроизводимый метод для изучения регенерации печени и эффект терапии на основе клеток при различных патологических состояниях. Частичной гепатектомии также облегчает увеличение приживления и распространение пересаженные клетки путем ускорения неоваскуляризации и миграции клеток к печени. Здесь мы опишем простой протокол для выполнения 30% гепатектомии и трансплантации клеток в селезенке-ожирением диабетом/тяжелой объединены иммунодефицитных КИВНУЛ. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/j) мыши.
В этой процедуре две небольшие надрезы. Первый разрез разоблачить и иссечения левой доли печени, и еще один небольшой надрез подвергать intrasplenic трансплантации клеток селезенки. Эта процедура не требует каких-либо специализированных хирургических навыков, и она может быть завершена в течение 5-7 минут с меньше стресса и боли, быстрого восстановления и лучше выживания. Мы продемонстрировали трансплантации гепатоцитов, изолированных от Зеленый флуоресцирующий белок (КГВ), выражая мыши (трансгенные C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), а также гепатоцитов как клетки человеческого происхождения (NeoHep) в частично hepatectomized КИВНУЛ. ТКИД мышей.
Introduction
В настоящее время гепатоцит трансплантации предлагается в качестве альтернативы весь трансплантации для лечения пациентов, имеющих серьезные расстройства печени. Считается, что он может преодолеть пациентам весь орган трансплантации1. Помимо аллогенной гепатоцитов2,3 ксеногенные гепатоцитов и гепатоцитов, производный от стволовых клеток4 изучаются также в животных моделях. В этом контексте, головка самонаведения и приживления потенциал пересаженные клетки в получателя является важным критерием для основе клеточной терапии в острой печеночной недостаточности (ОСН).
Для расследования трансплантации гепатоцитов или гепатоцито подобных клеток5, осн создается в животной модели либо хирургического6 или фармакологических7 процедуры по пересадке клеток. Чтобы сделать AHF животной модели фармакологических реагентов, многие гепатотоксинов d-galactosamine8, ацетаминофен9, тетрахлорид углерода10, thioacetamide11, конканавалина А12, липополисахарида13 , и т.д., были использованы. Из этого списка каждый реагент генерирует уникальный набор функций для осн, но к сожалению без единого реагент имитирует человеческое осн. Кроме того ОСН, вызванных гепатотоксинов занимает длительное время, которое ставит животных под хронический стресс, и трудно получить воспроизводимые результаты.
С другой стороны хирургическая процедура частичной гепатектомии (ФСК) это зависит от мастерства, и воспроизводимые результаты легко получить после разработки необходимых навыков. Чтобы побудить AHF путем хирургического вмешательства только, требуется резекция печени более чем на 70%; Однако меньше, чем 70% гепатектомии все еще могут быть использованы для исследования приживления и распространением пересаженные клетки в печени для анализа их терапевтический потенциал во время повреждения печени14. Трансплантация гепатоцитов были гепатектомии выполненных пост через брюшины15, хвост вен16, печеночная Вена17или селезенки18. В настоящее время печеночная Вена инфузии и intrasplenic трансплантация гепатоцитов являются предпочтительным процедуры, как они проще воспроизвести.
В этой статье мы описали процедуру для 30% частичной гепатектомии в Нод. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/J) мышах, в которых вырезана левой доли печени. Это сопровождается трансплантации 0,2 млн GFP-выражая гепатоцитов мыши (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), а также человеческого происхождения19 NeoHep в селезенке. Эта процедура приводит к приживления пересаженных клеток в печени. Эта процедура является наименее инвазивных и минимально болезненной технику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, представленные в настоящем протоколе были утверждены Комитетом по этике институциональных животных Национального Института иммунологии, Нью-Дели. Серийный номер официального утверждения является ИКАЭ № 319/13.
Примечание: Есть отличные ресурсы по общей хирургии процедуры20 и конкретных протоколов для грызунов хирургии21. Для тех, кто делает животных хирургия в первый раз рекомендуется активно заниматься хирургических процедур на чайников перед началом работы на животных.
1. Подготовка
- До эксперимента Храните стерильные фосфатный буфер (PBS) или физиологический готовы.
- Соберите комплект хирургии, содержащий ножницы, зубчатыми щипцы, щипцы ткани, хлопок, ватные палочки, нитки капроновые и различных микро иглы держатели. Автоклав комплект хирургии. Особое внимание следует использовать, если ослабленным иммунитетом КИВНУЛ. ТКИД мыши включен в протокол.
- Выполнение полной экспериментальной процедуры, от подготовки к концу хирургии, в био безопасности класса I кабинета.
- Весят КИВНУТЬ. ТКИД мыши 6-8 недель до операции. В этом исследовании используются мышей, веся между 14-18 g.
- Бриться верхней центральной и ипохондрик области живота мыши с машинку для стрижки волос. Примените кремы равномерно во всем регионе с помощью шпателя, чтобы полностью удалить обрезанные волосы волосы. Удалите волосы аккуратно с помощью куска влажной стерильной хлопка после 2-5 мин.
- Поместите указатель мыши в изофлюрановая камере и разблокировать клапан кислородный баллон. Поддерживать поток кислорода в размере 4 Л/мин и изофлюрановая испарения в 4% побудить анестезии.
- Убедитесь, что мышь должным образом наркоз, нежный мыс щипать.
- Уложите под него доску хирургии внутри биобезопасности кабинета. Поместите животное на доске, хирургии, что брюшной части мыши вверх и передней части мыши помещается внутри носовой конус, подключен к изофлюрановая и кислорода.
- Уменьшить испарение изофлюрановая до 2% и поддерживать его на протяжении хирургической процедуры.
- Дезинфекция кожи мыши и стерилизовать его, вытирая с 70% этанол пропитанной стерильным хлопка.
2. хирургическая процедура
-
Частичной гепатектомии
- Сделать поперечный разрез около 1 см в кожу чуть ниже грудины, перпендикулярно мечевидного отростка и параллельно грудную клетку, с помощью прямой операционной ножницы.
- Аккуратно отделить кожу, придает с брюшной мышцы слой вблизи области резаная с щипцами или стерильным хлопка смоченной советы для различения кожи и мышц живота слоя. Замочите внутрикожные региона с PBS с помощью стерильных хлопок Советы избежать высыхания.
- Разоблачить области левой доли плавно, сделав поперечный разрез через перитонеальный слой непосредственно под Мечевидный. Используйте два хлопка смоченной советы разоблачить и поднимите левой доли печени.
- Разместите один из хлопка советы на брюшной стороне вырезать и место еще один подсказки хлопка на стороне диафрагмы. Аккуратно прижмите кончик помещены к диафрагмы и дать толчок раздвижные другие кончиком поднять левой доли печени.
- Скольжения капроновая нить с петлю через поднятой левой доли и слайд петли к основанию левой доли рядом рубчика с помощью микро пинцет или хлопка советов. Осторожно надавите нейлон поток цикла на базе левой доли.
- Две рулевые капроновая нить, над верхней части левой доли, с использованием микрохирургии иглодержатель и микро щипцами. Сделайте два дополнительных knots на другой стороне.
- Проанализируем, обусловленной доли с помощью ножниц. Не пытайтесь резать очень недалеко от потока. В случае, если процедура длится более 5 мин, держите брюшной полости и органов влажным с стерильных PBS, чтобы избежать высыхания из-за потери жидкости.
- Шить брюшины с помощью непрерывного сшивающие шовные кетгут 4-0. Впоследствии закройте кожи, разрывные ушивание как можно быстрее.
-
Трансплантация клеток
Примечание: Выражая гепатоцитов ГФП были изолированы от трансгенных мышей GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 ща/J), согласно процедуре, описанной в ли и др. 22 и Шэнь и др. 23 гепатоцито подобных клеток (NeoHep) человеческого происхождения отличаются от моноциты24 были также использованы для трансплантации. Однако клетки, полученные из любых других источников, могут также использоваться в протоколе.- Приостановить 0,2 миллиона жизнеспособных клеток в около 50 мкл Iscove на изменение Дульбекко среднего (IMDM) и удалить его в шприц 1 мл инсулина ограничен с иглой 30G. Держите шприц холодной, поместив его на льду.
- Поместите курсор мыши так, что левый боковой части лица в сторону лица, выполняющего операцию. Определить области селезенки и поперечно рассечения кожи возле ипохондрик региона, следуют короткий разрез через перитонеальный слой только подвергать селезенки.
- Аккуратно поднимите селезенки и держать его вне полости с помощью двух PBS увлажнены хлопок советы.
- Держите селезенки тщательно кончиками двух хлопка в одной руке и поместите иглу шприца точно вертикальные для селезенки. Слегка проколоть селезенки и нажмите иглы очень медленно внутри; игла не должен получить глубже, чем на 2 мм.
- Медленно вдавите поршень шприца для вставки ячеек в селезенке. После пересадки держать иглу шприца стабильной и удалите его медленно из селезенки, чтобы избежать кровотечения или потеря клеток.
- После размещения селезенки обратно в брюшной полости с советами хлопка, закройте перитонеальных слоев, непрерывной ушивание с швом кетгут 4-0. Шить кожи скачком с же швом. Избегайте использования рану клипы для закрытия кожи; Вместо этого закройте его, шовный материал 4-0. Клипы рану ограничить естественного движения мыши, и часто клипы становятся рыхлыми и быстро выйти.
3. послеоперационный уход
- После закрытия кожи, протрите окрестности участков шов раствором йода (Бетадин) с помощью наконечник стерильным хлопка.
- Придать дозы антибиотика Цефотаксим как 600 мг/кг внутрибрюшинно тела вес (обычно Цефотаксим 12 мг в 100 мкл физиологического раствора/мышь) с использованием 1 мл шприц.
- Дать ежедневных доз болеутоляющее Мелоксикам 1 мг/кг веса тела (обычно 12 мкг мелоксикам в 100 мкл физиологического раствора/мышь) к животным внутрибрюшинно, на срок до трех дней после операции.
- После завершения операции остановить поток газа изофлюрановая и поместите курсор мыши обратно в отдельности вентилируемые клетке.
4. euthanization и характеристики
- После экспериментальной конечными точками (1 день и 10 дней после операции) усыпить мышей согласно институциональных животных этических принципов.
- Сбор крови, неизлечимо кровотечение животных, проколов глазной терминала сплетения.
- Изолируйте сыворотки крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гепатоцитов распространения после частичной гепатектомии 30%: С распространением гепатоцитов в оставшиеся печени после 30% гепатектомии был рассмотрен иммуногистохимический (IHC) пятная для клеток маркер распространения, Ki-67. Гепатектомии один день поста, мышей были умерщвлены, остальных долей печени был вырезан и парафиновых срезах были получены. Разделы были окрашенных антитело Ki-67, следуют маркировки с хреном пероксидазы (ПХ) конъюгированных вторичное антитело. Ди-аминокислоты бензидина (DAB) была использована в качестве субстрата для HRP для разработки коричневого цвета для выявления окрашенных клеток. Ядро было счетчика окрашивали гематоксилином и рассматривать под микроскопом объективных 20 X. Рисунок 1 показывает образ представителя IHC печени секции. Около 13% клеток (13.66 ± 0.317, N = 3) были Ki-67 положительный, который подтвердил, что 30% гепатектомии облегчает распространение гепатоцитов в печени мыши.
Анатомические исследования: Представитель образ печени КИВНУТЬ. ТКИД мышь, 10 дней, гепатектомии сообщение показано на рисунке 2. Этот образ подтвердил, что оставшиеся печень здоровой без видимых отклонений.
Наличие пересаженные клетки в течение первого часа хирургии: Головка самонаведения пересаженные клетки было подтверждено с анализа потока гранулярных проверив наличие положительных гепатоцитов GFP 2 часа после пересадки.
Одна ячейка подвеска была получена из селезенки и печени хоста мыши через ферментативного пищеварения подакцизным ткани после 2 часов GFP-гепатоцитов трансплантации. Процент положительных клеток пересаженных GFP оценивалась с использованием проточный цитометр. Разброс ворот был выбран из соответствующего участка точка FSC-SSC по ликвидации мусора и Дуплет клетки. Квадрант ворот участка был создан фон флюрохром интенсивность клеточных суспензий, полученные из селезенки и печени мышь управления, в котором были пересажены не клетки. Около 1,7% GFP позитивные гепатоцитов были найдены в селезенке, а не GFP гепатоцитов были обнаружены в печени 2 часа после пересадки. Репрезентативных данных показано на рисунке 3.
Иммуногистохимии: Через десять дней после операции, мышей были умерщвлены и вырезан правой боковой доли, право медиальной лоб и медиальной левой доли печени и крио резании была выполнена для получения 5 мкм секций. Эти разделы были затем рассмотрены для самонаведения и приживления пересаженных клеток. Рисунок 4 показывает представитель изображения иммуногистохимический (IHC) пятная против анти GFP (красный) для идентификации GFP, выражая мышей гепатоцитов (группы A, Bи C); и против античеловеческие альбумина (красный), а также антинародным connexin 32 (зеленый), чтобы идентифицировать гепатоцито подобных клеток (NeoHep) человеческого происхождения (группа D, E, Fи G). Ядро было counterstained с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, синий) в обоих случаях. В эти изображения панели хорошо видны несколько прижившимися GFP, выражая гепатоцитов (группы A, Bи C) и NeoHep (группа D, E, Fи G).
Биохимический анализ печени выделяется ферментов: Чтобы проверить функциональность печени после хирургической процедуры, проводился биохимический анализ различных ферментов печени выделяется. Гистограммы на рисунке 5 представляют собой среднее значение аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ) и щелочной фосфатазы (ALK-фосфора) в сыворотке крови здоровых КИВНУЛ. ТКИД мышей и различные группы частично hepatectomized мышей. Это ясно из графа, что после 1 дня гепатектомии, уровень ферментов АСТ, ALT и ALK-фосфора значительно возросло, когда по сравнению с здоровых мышей.
Фермент уровни АЛТ и АСТ были восстановлены к нормальной жизни, в то время как уровни ALK-фосфора оставался высоким пост десять дней хирургии-пересаженные мышей. Однако уровень ферментов всех трех упала до нормальной пересаженных мышей после 10 дней.
Гистологическое исследование печени: Пробы печени hepatectomized и пересаженные мышей были дополнительно обработаны для гистологического анализа для изучения послеоперационный анатомические изменения. На рисунке 6 показан представитель светлые области изображения гематоксилином и эозином (H и E) окрашенных печени разделы здоровых мышей без хирургического вмешательства, 1 день после частичной гепатектомии и 10 дней после частичной гепатектомии и NeoHep трансплантации. В этих образах повреждение печени из-за мягкой Пери желчных фиброза или соединительной ткани распространения наблюдалось после 1 дней частичной гепатектомии, и без аномалии были замечены десять дней после операции.
Рисунок 1 : Образ представителя Ki-67 окрашивания Нод. Раздел SCID печени после 1 день 30% гепатектомии. Раздел был запятнан антитело Ki-67, пероксидаза (ПХ) конъюгированных вторичное антитело, DAB (коричневый) был использован в качестве субстрата ПХ и ядра были counterstained по гематоксилином (синий). Ориентировочные стрелки указывают некоторые из Ki-67 (коричневый)-положительных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Регенерации печени лопастями КИВНУТЬ. ТКИД мыши 10 дней после операции. A: хвостатого лепестка (хвостатого процесс), B: правой боковых лепестков, C: право медиальной лоб, D: оставил медиальной лепесток, сердце E:, F: оставшиеся левой боковых лепестков после гепатектомии и G: хвостатого лепестка (папиллярный процесс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Доля GFP позитивные мыши heptatocytes в селезенке и печени КИВНУЛ. ТКИД мышь. Верхней панели показывают ячейки профиля мыши соответствием контроля возраст, в котором были пересажены не клетки. Нижней панели показывают профиль клеток после 2 часов GFP гепатоцитов трансплантации в hepatectomized мыши. Ось y участков обозначает интенсивность флуоресценции GFP (FITC канал) измеряется в произвольных единицах в масштабе журнала, и оси x обозначает вперед точечной (FSC) в произвольных единицах на линейной шкале. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Самонаведения пересаженных GFP, выражая мыши гепатоцитов и NeoHep в печени восстановленный узел. Представитель изображения печени секций частично hepatectomized КИВНУЛ. ТКИД мышь пересаженные с GFP позитивные мыши гепатоцитов (A-C), показывая приживления клеток и самонаведения. Группа A: ядро (синий: DAPI), Группа B: анти GFP (красный: Alexa Fluor 594), Группа C: Merged изображение. Панели (D-G) показывают печени Секция частично hepatectomized КИВНУЛ. ТКИД мыши в котором NeoHep были пересажены. Группа D: ядро (синий: DAPI), Группа E: человека анти Connexin 32 (зеленый: Alexa Fluor 488), Группа F: человека анти альбумина (красный: Alexa Fluor 594) и Группа G: Merged изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Биохимический анализ различных печень выделяется ферментов в сыворотке мышей. Столбцов представляют собой средние значения различных ферментов (АСТ/СГОТ, ALT/Аминотрансфераза, ALK-фосфора). Суть времени исследования послеоперационного показана на оси X. В контрольной группе, были возраст соответствует КИВНУЛ. Была выполнена SCID мышей и без хирургического вмешательства. Планки погрешностей означают Среднеквадратичная ошибка среднего значения, N = 3 и * указывает p< 0,05, NS указывает не значение на p> 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Гистопатологические исследования разделов ткани печени мышей. Представитель светлые области изображения микроскопии гематоксилином и эозином (H и E) окрашенные ткани печени секции Нод. ТКИД мыши под 20 X объектив. Группа A показывает раздел печени от здоровых КИВНУЛ. ТКИД мыши того же возраста, без какой-либо операции. Группа B показывает печени раздел 1 день после частичной гепатектомии. На этом изображении стрел указывают области распространения мягкая Пери желчных фиброза или соединительной ткани. Группа C показывает печени раздел десять дней поста частичной гепатектомии и трансплантации клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Частичной гепатектомии является установленным техника для расследования регенерации печени, и сообщается, что чрезмерное гепатектомии имитировать модель осн. Среди животных моделей AHF грызунов, особенно мышей, являются наиболее исследуемой модели. Чтобы получить модель повреждения печени в мышах, до 70% гепатектомии поступили с хорошей выживаемости ставка25,26. Однако в обнаженном виде и других иммунодефицитных мышь, 70% гепатектомии было сообщено как роковой и животные погибли в течение 24 часов27.
Митчелл и Willenbring28 продемонстрировал воспроизводимость и хорошо переносится метод для 2/3 частичной гепатектомии в мышах. Для Нод. ТКИД мышей, когда гепатектомии было ограничено до резекции левой доли печени, который приближается к 30% от общей массы печени, мы получили 100% выживаемости. С учетом замечания по обнаженной мышей27мы отметили, что любое дальнейшее увеличение доли гепатектомии в Нод. ТКИД мыши приводит к резкое снижение выживаемости. Кроме того распространение гепатоцитов в оставшиеся печени лопастями пост 1 дней частичной гепатектомии 30% подтвердили полезность этой процедуре в трансплантации и исследования приживления.
В более недавнем документе, Ахмед у.е. и др. 29 продемонстрировали процедура внутрипеченочных гепатоцеллюлярной карциномы ксенотрасплантатов иммунодефицитных мышей. Они показали процедура трансплантации опухолевых клеток в различных органах, включая селезенки и выполняется гепатектомии для облегчения внутрипеченочных приживления.
В процедурах, сообщили28 Митчелл и Ахмед29есть возможность для уточнения, делая гораздо меньше разрезов, как небольших разрезов как правило, предпочитают в хирургии. Есть доказательства30 , что меньше длины хирургический разрез приводит к менее секрецию стресс гормонов, как кортизол и катехоламинов. Кроме того мы обнаружили, что процедуры, связанные с одной большой разрез требуется более высокий уровень навыков и более трудно воспроизвести, по сравнению с процедурами, имея два небольших разрезов.
В этой статье мы описали процедура, в которой требуется минимальный разрез подвергать левой доли печени, и, после выполнения гепатектомии 30%, еще один небольшой разрез был сделан подвергать селезенки, где клетки были имплантированы. Эта процедура не требует каких-либо специализированных хирургических навыков и может быть завершена в 5-7 мин. Кроме того мы нашли никаких доказательств любого морфологического или анатомические аномалии в оставшихся печени массы, что подтверждается гистологических исследований. Кроме того, было отсутствие ишемии или некроза во время хирургической процедуры 6-8 недели-старый иммунной скомпрометированы мышей. Индукции повреждения печени после частичной гепатектомии подтверждается повышенный уровень ферментов печени АСТ, ALT и ALK-PHOSin сыворотке мышей. Intrasplenic маршрут был выбран для трансплантации клеток над другими венозной маршрутов, потому что Портал венозной системы имеет более высокой доступности в печени коре чем другие венозной системы. Мы продемонстрировали трансплантации гепатоцитов, изолированных от трансгенные мыши GFP и NeoHep, которые являются дифференцированной гепатоцито подобных клеток человеческого происхождения, в частично hepatectomized КИВНУЛ. ТКИД животных. Процедура не ограничивает тип клеток для трансплантации.
Однако эта процедура не создать условие ОСН в мышь, как производится только 30% частичной гепатектомии. Этот ограниченный гепатектомии обеспечивает пролиферативный потенциал для гепатоцитов в оставшихся печень, которая тем самым предоставляет дополнительные возможности для пересаженных гепатоцитов для приживления. Он только демонстрирует миграции и приживления гепатоцитов и NeoHep из селезенки в печень, и никаких дополнительных повреждений печени осуществляется процедура трансплантации.
Над всеми эта процедура является простой и может практикуется и освоил легко получить воспроизводимые результаты. Регенеративный потенциал нескольких сотовых источников (стволовые клетки или клетки гепатоцито подобных) в контексте повреждения печени, или регенерации печени исследования, можно легко оценить с этой хирургической процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана основных грантов, полученных из Департамента биотехнологии, правительство Индии Национальный Институт иммунологии, Нью-Дели. Д-р Бхаттачарджи текущий адрес является Отдел гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Детская больница Лос-Анджелеса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
