Summary
Analisi cinematica di andatura nel piano sagittale produce informazioni molto precise sulle modalità di esecuzione del movimento. Descriviamo l'applicazione di queste tecniche per identificare i deficit di andatura per topi sottoposti a demielinizzazione autoimmune-mediata. Questi metodi possono anche essere usati per caratterizzare i deficit di andatura per altri modelli di mouse con alterata locomozione.
Abstract
Analisi cinematica di andatura nel piano sagittale sono stato frequentemente utilizzato per caratterizzare i deficit del motore nella sclerosi multipla (MS). Descriviamo l'applicazione di queste tecniche per identificare i deficit di andatura in un modello murino di MS, noto come encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Deficit di paralisi e motore nei topi sottoposti a EAE in genere sono valutati utilizzando una scala di valutazione clinica. Tuttavia, questa scala produce solo dati ordinali che fornisce poche informazioni circa la natura precisa di deficit motori. La gravità della malattia EAE è stata valutata anche da rotarod performance, che fornisce una misura della coordinazione motoria generale. Al contrario, analisi di andatura cinematica dell'arto posteriore nel piano sagittale genera informazioni altamente precise come movimento è alterata. Per eseguire questa procedura, marcatori riflettenti sono collocati su un arto per rilevare il movimento articolare mentre un mouse sta camminando su un tapis roulant. Software di analisi del movimento è utilizzato per misurare il movimento dei marcatori durante la deambulazione. Parametri cinematici andatura sono poi derivati dai dati risultanti. Vi mostriamo come questi parametri di andatura possono essere utilizzati per quantificare alterati movimenti delle articolazioni dell'anca, ginocchio e caviglia in EAE. Queste tecniche possono essere utilizzate per meglio comprendere i meccanismi della malattia e identificare i possibili trattamenti per MS e altre patologie neurodegenerative che compromettere la mobilità.
Introduction
Andatura è una serie di movimenti ripetitivi degli arti utilizzati per raggiungere la locomozione. Andatura è composta da cicli di passaggio, che sono divisi in due fasi: la fase statica, ovvero quando il piede è in movimento all'indietro sul terreno per spingere il corpo in avanti; e la fase dinamica, dove il piede è fuori la terra e movimento spedisce. Dispersioni di andatura sono caratteristiche di marchio di garanzia di molti disordini neurodegenerative, quali la ferita del midollo spinale (SCI), sclerosi a placche (MS), sclerosi laterale amiotrofica (SLA), malattia di Parkinson (MDP) e ictus; modelli preclinici roditore di questi disordini ricapitolano spesso loro rispettivi andatura menomazioni1. I meccanismi di controllo di base di locomozione in topi sono stati intensamente studiati2,3. Inoltre, ci sono modelli murini di molti disordini neurologici umani4. Analisi del passo in topi sono pertanto un approccio attraente per misurare gli aspetti multipli del deficit del motore che hanno conosciuto componenti anatomiche. Lo studio di andatura in modelli murini può fornire intuizioni le basi neuropathological dei deficit motorio nei disordini neurodegenerative e consentire l'identificazione di potenziali trattamenti.
Ispezione visiva (per esempio, il Basso del mouse scala5 e campo aperto test6) e l'analisi di andatura da piano ventrale7includono alcune tecniche che sono state utilizzate per misurare l'andatura in roditori. Più recentemente, metodi per misurare la cinematica sagittale del hindlimb movimenti hanno guadagnato popolarità perché forniscono ulteriori informazioni sull'esecuzione di movimento e di conseguenza sono più sensibili ai sottili cambiamenti nell'andatura8, 9 , 10 , 11. cinematiche tecniche sviluppate per studiare il movimento del hindlimb nel piano sagittale mentre si cammina su un tapis roulant9,12 sono stati ampiamente studiati nel contesto dell'ALS, lesioni corticali traumatiche, SCI, corsa, e Malattia di Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Al contrario, queste tecniche hanno visto uso limitato nello studio dei deficit motorio per modelli murini di sclerosi multipla17.
Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il modello del mouse più comunemente usato di MS18. I due metodi principali di indurre EAE è tramite inoculazione attiva o passiva. In attivo EAE, topi sono immunizzati con antigeni mielinici, causando neuroinflammation mediata da cellule T autoreattive e demielinizzazione del midollo spinale e il cervelletto. EAE passiva, d'altra parte, è indotta da trasferimento di cellule T autoreattive da un mouse con EAE attivo ad un ingenuo del mouse19. Come descritto altrove, il decorso della malattia ed il neuropathology sono influenzati dall'antigene del sistema nervoso centrale (SNC) e mouse ceppo20,21,22,23,24 ,25. Negli esperimenti EAE, topi di controllo sono iniettati con adiuvante di Freund completo (CFA) senza l'antigene della mielina. EAE è caratterizzata da paralisi che inizia con la debolezza di coda e potenzialmente possono coinvolgere gli arti anteriori, ascendente conseguente atassia e paralisi20. Recentemente abbiamo caratterizzato i cambiamenti di andatura in topi C57Bl/6 sottoposti alla glicoproteina del oligodendrocyte di mielina 35-55 (MOG35-55)-indotto EAE. Questi studi hanno dimostrato l'analisi del passo di essere superiore rispetto ad analisi comportamentale classica perché deviazioni dal movimento della caviglia normale sono altamente correlate con il grado di perdita di sostanza bianca nel midollo spinale lombare di EAE topi26. Al contrario, la forza della correlazione tra la perdita di materia bianca e due altre misure comportamentali tradizionali (Punteggio clinico e rotarod) era molto più debole di26.
Qui descriviamo l'uso dell'analisi cinematica andatura per rilevare i deficit di movimento nel piano sagittale dei topi EAE cammina su un tapis roulant. Cinque marcatori riflettenti sono stati collocati su un arto posteriore per identificare il movimento dell'anca, del ginocchio e malleolare in registrazioni video ad alta velocità. Software di analisi del movimento è stato utilizzato per estrarre dati cinematici sulle escursioni congiunte. L'utilità di queste tecniche per quantificare i deficit di movimento per il modello di35-55 MOG di EAE sono discussi. Queste tecniche sono anche applicabili allo studio dei deficit di andatura in altri modelli murini di patologie neurodegenerative.
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Protocol
questo protocollo è in conformità con il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali ed è stato approvato dal comitato di Università di Dalhousie su animali da laboratorio.
1. costruire marcatori riflettenti:
- usando un punzone di foro tenuto in mano, pugno il numero desiderato di piccoli cerchi da un foglio di carta riflettente. Ogni animale richiede 5 segnapunti per una singola registrazione; due grandi e tre piccoli indicatori.
- Utilizzando le forbici bene, fare un taglio dritto, che si estende dal perimetro al centro del cerchio.
- Rimuovere la protezione del marcatore per rivelare la superficie adesiva di carta. Utilizzando una pinzetta, afferrare saldamente il marcatore e incurvarla in su se stesso usando le dita per formare una forma di cono. Per rendere un piccolo indicatore, arricciare il cono strettamente. Per rendere un grande marcatore, arricciare il cono senza bloccare.
- Usando una pistola di colla mano, riempire l'interno del marcatore a forma di cono con colla mentre avvincente la punta del cono con il forcipe e aderire il marcatore per un pezzo di cartone. La colla impedirà il marcatore da compressione e flessione durante la registrazione per garantire la riflessione ottima della luce. Quando la colla è secca (circa 10 min), rimuovere il marcatore dal cartone con un bisturi ( Figura 1A).
2. Preparare l'animale per la registrazione
- Anesthetize il mouse con gas isoflurano (2,5%; 2 litri/min O 2) posizionando il mouse in una camera di induzione. Una volta che il mouse è incosciente, collocarlo in un cono di naso posizionato sulla cima di un acqua di ricircolo riscaldamento coperta. Lo scopo di amputate è per immobilizzare il mouse per il posizionamento dei marcatori; la procedura non è dolorosa. Pertanto, la profondità dell'anestesia non ha bisogno di essere valutata.
- Applicare un lubrificante di occhio d'attualità a entrambi gli occhi.
- La barba del hindlimb desiderata usando tagliatori elettrici. Iniziano alla caviglia e si estendono verso la colonna vertebrale e inferiore delle costole; garantire pelliccia non è lasciato come questo altererà adesione marcatore.
Nota: Qui, l'arto posteriore destro è stato registrato; Tuttavia, può essere utilizzato in entrambi hindlimb. - Usando un pennarello indelebile, indicare la posizione della cresta iliaca e l'articolazione dell'anca. La cresta iliaca è appena sotto la parte inferiore delle costole ed è facilmente palpabile riunendo le ginocchia sotto il mouse ' corpo di s.
Nota: L'articolazione dell'anca può essere trovato flettendo ed estendendo la gamba per trovare il punto di articolazione tra bacino e femore. - Utilizzando una pinzetta, afferrare l'estremità appuntita di un marcatore di piccolo e immergere la base in colla adesiva ad azione rapida, o un'alternativa equivalente. Posizionare il puntatore sulla punta della quarta cifra e tenere in posizione per 2-3 e consentire la colla si asciughi. Posizionare gli altri due piccoli indicatori sul metatarso-falangea e caviglia nello stesso modo ( Figura 1B).
- Posto grande marcatori sulla cresta iliaca e dell'anca ( Figura 1B) nello stesso modo come i piccoli indicatori.
- Rimuovere il mouse dal cono di naso e trasferire immediatamente per la sala di registrazione utilizzando una gabbia di trasferimento. Posizionare il mouse sul tapis roulant stazionarie e consentire il completo recupero dall'anestesia.
3. Registrazione di andatura
- prima di registrare il mouse ' andatura di s, prendere una foto di un blocco di calibrazione con dimensioni note sul tapis roulant.
Nota: Questo permetterà i pixel del video da convertire in misure reali. La fotocamera dovrebbe essere posizionata circa 120 cm da tapis roulant.- Posizione la macchina fotografica a livello e la stessa altezza come il tapis roulant. Mantenere la stessa posizione della telecamera per le registrazioni seguendo l'immagine di calibrazione.
- Una volta che il mouse ha recuperato pienamente dall'anestesia, girare il tapis roulant ad una velocità bassa (5 cm/s) a lasciare che il mouse iniziare a piedi. Assicurarsi che la direzione di cintura di tapis roulant è tale che i marcatori del mouse sono rivolto verso la fotocamera.
- Aumento il tapis roulant velocità gradualmente fino a 20 cm/s; questa è la velocità ideale per un'andatura costante in topi sani più.
Nota: Sebbene sia ideale per avere tutti i topi camminare alla stessa velocità, alcuni potrebbe essere Impossibile raggiungere costantemente questa velocità.- Se il mouse è in grado di camminare a 20 cm/s, ridurre la velocità se necessario ed essere sicuri di prendere nota di questo. Ridurre la velocità del tapis roulant fino al raggiungono dei cicli coerente passo.
Nota: Un'analisi successiva dei dati possibile regolare per differenze nelle velocità.
- Se il mouse è in grado di camminare a 20 cm/s, ridurre la velocità se necessario ed essere sicuri di prendere nota di questo. Ridurre la velocità del tapis roulant fino al raggiungono dei cicli coerente passo.
- Begin registrazione del video, una volta che il mouse è a piedi costantemente (cioè camminare ad un ritmo costante, non allevamento o tessitura lato a lato). Continuare a registrare fino a 8 a 12 cicli di passaggio consecutivi sono stati registrati. Per ogni video, registrare la velocità del tapis roulant e il lato del mouse registrata.
- Una volta che la registrazione è completa, spegnete il tapis roulant e tornare il mouse alla sua gabbia. Pulire il tapis roulant accuratamente tra le registrazioni come profumi lasciati da altri topi possono alterare il comportamento dei topi in arrivo. Per ridurre lo stress e danni alla pelle, non rimuovere i marcatori; consentire i topi per rimuoverli per conto proprio.
4. Analisi
- elaborare il video utilizzando il software di analisi del movimento.
Nota: Nei nostri esperimenti, abbiamo usato script personalizzati progettati per il software di imaging e statistico (Vedi Tabella materiali) che sono stati scritti da Dr. Nicolas Stifani. Le seguenti operazioni vengono eseguite utilizzando il software di analisi di movimento selezionato.- Estrarre le coordinate in pixel dei marcatori dei video e utilizza il video di calibrazione, trasformare i valori dei pixel in centimetri e calcolare gli angoli articolari in ciascun fotogramma.
- Identificare l'inizio e la fine di ogni ciclo di passaggio, ottenendo così informazioni sulla durata di passo e lunghezza.
- Normalizzare il passo durata del ciclo di 200 fotogrammi normalizzati, tale che swing e posizione sono rappresentate rispettivamente da 100 fotogrammi,.
- Utilizzando i fotogrammi normalizzati, calcolare i parametri cinematici per analisi dei dati con il software del foglio elettronico (Vedi Tabella materiali).
- Per stabilire l'angolo medio di un particolare giunto, prendere la media di tutti gli angoli all'interno di una cornice normalizzato come:
Nota: qui x rappresenta il valore dell'angolo a un dato normalizzato telaio e n rappresenta il numero di telaio normalizzato. - a stabilire il range di movimento di un'articolazione particolare per un determinato mouse, sottrarre l'angolo più piccolo dall'angolo più grande in un set di fotogrammi normalizzati come segue:
Gamma di movimento = angolo massimo - angolo minimo.
Nota: Qui angolo massimo e l' angolo minimo sono gli angoli più grandi e più piccoli realizzati all'interno del ciclo del passo normalizzato, rispettivamente. - Per stabilire la differenza di RMS, in primo luogo sottrarre l'angolo medio di ogni tempo-punto sperimentale dalla registrazione della linea di base. Successivamente, ogni differenza di Piazza, prendere la media dei valori tutti al quadrato e la radice quadrata della media. L'equazione è la seguente:
Nota: qui
rappresenta l'angolo medio dalla linea di base di registrazione; y rappresenta l'angolo medio da ogni punto di tempo sperimentale; n rappresenta il numero di fotogrammi normalizzati. Radice significa quadrato della differenza (RMS) è una misura utilizzata per valutare la deviazione in andatura da registrazioni di base.
- Per stabilire l'angolo medio di un particolare giunto, prendere la media di tutti gli angoli all'interno di una cornice normalizzato come:
- Utilizzare grafica scientifica e software di statistiche per analizzare e presentare i dati (Vedi Tabella materiali).
rappresenta l'angolo medio dalla linea di base di registrazione; y rappresenta l'angolo medio da ogni punto di tempo sperimentale; n rappresenta il numero di fotogrammi normalizzati. Radice significa quadrato della differenza (RMS) è una misura utilizzata per valutare la deviazione in andatura da registrazioni di base.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1 è una rappresentazione schematica della procedura utilizzata per l'analisi cinematica di andatura. In primo luogo, riflettenti marcatori sono fatti e collocati su un mouse a 5 punti anatomici. Andatura viene poi registrato mentre il mouse sta camminando su un tapis roulant. Software di analisi del movimento è utilizzato per estrarre dati cinematici per la successiva analisi.
Figura 2A -C rappresentano il ciclo di passaggio di un controllo del mouse CFA per gli angoli articolari dell'anca, ginocchio e caviglia registrato alle tre sessioni di registrazione consecutivi distanziate di una settimana a parte. La sovrapposizione tra le forme d'onda Mostra la deviazione minima nei cicli di passaggio dalle sessioni 1-3. Figura 2D -F rappresentano il ciclo di passaggio di un secondo controllo del mouse CFA che visualizzate una maggiore variabilità a piedi da 1-3 sessioni di registrazione. Anche se i cicli di passaggio sono spostati lungo l'asse y, la forma delle forme d'onda rimane coerenza tra le registrazioni. Questo livello di variabilità è tipico per la camminata del mouse.
Figura 3A -C rappresentano il ciclo di passaggio del mouse con EAE registrati su tre sessioni di registrazione consecutivi. Non ci sono cambiamenti minimi nell'andatura dalla prima alla seconda sessione di registrazione, ma per la terza sessione, andatura è stato profondamente alterata in tutti e tre articolazioni. Per l'anca, un significativo appiattimento su tutto il ciclo di passaggio si è verificato, che indica una perdita sostanziale di movimento. Il ginocchio è diventata peso più flesso e meno in grado di estendere e sostenere il corpo dell'animale. I movimenti dell'articolazione della caviglia sono stati anche sostanzialmente modificati. Piede dorsiflessione e flessione plantare sono ritardati durante le fasi di presa di posizione (pannello verde) e swing (pannello bianco) rispettivamente. Questi deficit sono indicativi della debolezza di muscolo in questo comune, in quanto l'animale è alterata nella sua capacità di sollevare il piede durante la fase di oscillazione e spingere il corpo in avanti durante la fase statica.
I seguenti dati presentati nella Figura 4 sono stati ripubblicati da Fiander et al. (2017) 26 con permesso. I dati sono stati analizzati utilizzando unidirezionale misure ripetute ANOVA con Holm-Sidak test comparazioni multiple per confrontare tutti i punti di tempo alla linea di base26. La gamma di angolo medio (Figura 4A e Figura 4), di movimento (Figura 4B e Figura 4E) e differenza di RMS (Figura 4 e Figura 4F) sono stati calcolati in ogni momento per quantificare l'andatura deficit (n = 8 per gruppo). Nell'esperimento di EAE presente, l'insorgenza di punteggi clinici era 14, DPI, che è dopo la seconda settimana di registrazione. CFA topi ha mostrato nessun cambiamento medio ginocchio angolo (Figura 4A) o il ginocchio differenza RMS (Figura 4), ma ha esibito un piccolo aumento nella gamma di ginocchio di movimento [F(2,7) = 5.871, p = 0,0083], su entrambi i DPI 16 e 30 rispetto alla linea di base ( Figura 4B). Questo piccolo cambiamento può riflettere il dolore derivando dall'iniezione CFA. In contrasto con gli animali CFA, c'erano grandi cambiamenti al ginocchio congiunta per gli animali EAE per l'angolo medio [F(6,7) = 11,08, p < 0,0001] (Figura 4), gamma di movimento [F(6,7) = 14,42, p < 0,0001] (Figura 4E) e RMS differenza (Figura 4F). L'angolo medio è stato ridotto significativamente, che indica che i topi EAE hanno avuti loro ginocchia più flessa durante la deambulazione. Questo può essere indicativo di debolezza muscolare, come gli animali erano in grado di estendere le loro articolazioni di ginocchio per sostenere il loro peso corporeo. La gamma di movimento inoltre è stata diminuita, ancora una volta probabilmente a causa di un'incapacità degli animali di estendere l'articolazione del ginocchio. L'aumento significativo nel ginocchio differenza RMS indica che i movimenti dell'articolazione del ginocchio in topi EAE erano sostanzialmente differenti da loro registrazione della linea di base.
I dati nella Figura 5 sono stati analizzati usando unidirezionale misure ripetute ANOVA con Holm-Sidak più test di confronto che rispetto i valori dei parametri di andatura a punteggi clinici di 0,5 - 3,5 a quelli rilevati in un punteggio clinico di 0. Analisi correlazionali inoltre è stata effettuata utilizzando rho di Spearman (ρ). L'angolo medio del ginocchio (Figura 5A), la gamma di movimento (figura 5B) e la differenza di RMS (Figura 5) sono stati fortemente correlati con punteggi clinici (p < 0.001). Queste correlazioni tra movimenti articolari e segnando clinica classica comprovare la validità delle analisi cinematica di andatura per valutare i deficit del motore per topi EAE. Gamma di ginocchio di movimento (Figura 5A) e differenza di RMS (Figura 5) erano significativamente diminuiti a partire da un punteggio clinico di 2.0 (p< 0.05). Questi risultati suggeriscono che i movimenti del ginocchio alterata non contribuiscono a deficit motori rilevato da punteggi clinici inferiore a 2.0. Tuttavia, angolo medio del ginocchio (figura 5B) è stata diminuita a partire da un punteggio clinico di 1.0 (p< 0.05). Questo suggerisce che per il movimento del ginocchio, angolo medio è il più sensibile delle tre misure.
Figura 1 : Schematico per andatura cinematica registrazione con topi. Una volta che vengono apportati marcatori riflettenti, essi sono posti sulla cresta iliaca, anca, caviglia, metatarso-falangea e la punta della quarta cifra. Andatura è registrato da una telecamera ad alta velocità mentre il mouse sta camminando su un tapis roulant. Software di analisi di movimento viene utilizzato per estrarre i parametri di andatura per la successiva analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Esempio di forme d'onda ciclo di passo a due topi di controllo che hanno ricevuto CFA
Gli sfondi bianchi e verdi rappresentano la fase di swing e presa di posizione, rispettivamente. Per mouse 1, anca (A), ginocchio (B) e forme d'onda di caviglia (C) passaggio ciclo si sovrappongono in 3 sessioni di registrazione consecutivi distanziate di una settimana a parte. Per mouse 2, anca (D), ginocchio (E) e passo alla caviglia (F) ciclo di forme d'onda si discostano leggermente da altro a causa della variabilità intrinseca a pochi passi di comportamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Forme d'onda ciclo di passaggio in topi con EAE. Gli sfondi bianchi e verdi rappresentano fase di swing e presa di posizione, rispettivamente, per tre sessioni di registrazione consecutivi distanziate di una settimana a parte. Da caviglia, anca (A), ginocchio (B) e la sessione di registrazionerd 3 forme d'onda (C) sono notevolmente cambiate a causa della progressione della malattia EAE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Angolo medio, gamma di movimento e significa radice quadrata sono utilizzati per analizzare i dati cinematici. Angolo medio, gamma di movimento e differenze di RMS sono stati calcolati per quantificare i deficit del motore nei topi EAE. L'angolo del ginocchio media (A), gamma di movimento (B) e (C) RMS per topi CFA è rimasto relativamente costante. Topi con EAE hanno mostrato angolo medio di ginocchio alterata (D), gamma di movimento (E) e RMS (F). I dati sono espressi come media ± deviazione standard; p< 0.05, * * p< 0,01, * * * p< 0.001, la differenza da immunizzazione di giorno post (DPI) -2; n # p < 0.05, la differenza da deficit di picco. Ristampato da riferimento 26 con il permesso da editori originali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Angolo medio ginocchio, gamma di movimento e differenza di RMS correlare con punteggio clinico
Analisi di correlazione è stato effettuato tra tre misure di cinematiche dei movimenti del ginocchio e punteggi clinici per confrontare i due metodi. L'angolo del ginocchio media (A), gamma di movimento (B) e la differenza di RMS (C) sono stati fortemente correlati con punteggi clinici. La gamma di ginocchio di movimento e differenza di RMS è diminuito inizio a un punteggio clinico di 2.0, mentre angolo ginocchio medio è stato ridotto prima a un punteggio clinico di 1.0. I dati sono espressi come media ± deviazione standard; p< 0,05 differenza dagli studi clinici Punteggio 0.0. Per rho di Spearman (ρ), * * * p< 0.001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In topi con EAE, i due metodi più comuni di deficit motori di misurazione sono punteggi clinici e cadono la latenza da un rotarod27,28. Queste tecniche hanno diverse limitazioni. Anche se conveniente e ampiamente utilizzato, segnando clinico è limitato cedendo solo ordinali dati livelli, nel senso che la grandezza delle differenze tra punteggi clinici non sono noti. Punteggio clinico soffre anche di essere in grado di fornire informazioni precise circa la natura dei deficit motori. Il rotarod test migliora alcune limitazioni di punteggio clinico, ma solo misure di coordinazione motoria generale e non misura aspetti specifici di camminare.
In confronto, analisi cinematica di andatura fornisce misure sensibili su aspetti specifici della locomozione, compresa la gamma di angoli di movimento e media alle varie articolazioni. I deficit sottili in movimenti articolari dell'anca e del ginocchio per topi EAE di MOG35-55 sono stati rilevati a DPI9, circa il 5-9 giorni prima dell'inizio dei sintomi clinici o rotarod deficit26. Questi deficit hanno persistito malgrado una remissione completa dei segni clinici e sono stati osservati in assenza di deficit di rotarod26. D'importanza, alterata movimenti della caviglia come misurato dalla differenza di RMS correlato estremamente bene con perdita di sostanza bianca nel midollo spinale26.
Diversi punti metodologici meritano menzione specifica: 1) posizionamento accurato e coerenza dei marcatori congiunti è cruciale - articolazione dell'anca e cresta iliaca deve essere identificati attentamente di palpitazione; 2) è necessario ottenere registrazioni da 8-12 cicli di passaggio. In media questi cicli di passaggio produce un ciclo di passo medio rappresentativo che può essere ulteriormente analizzato; 3) condizioni di illuminazione ottimale devono essere stabilite per garantire che i marcatori sono chiaramente visibili nelle registrazioni. Se gli indicatori non sono illuminati correttamente, questo può rendere digitalizzazione video un processo laborioso come molti programmi di analisi di movimento sarà in grado di rilevare i marcatori, rendente necessaria verifica manuale.
Una ulteriore limitazione di questa tecnica è che è alta intensità di manodopera. Ad esempio, per registrare e analizzare i dati da un gruppo di 10 topi, stimiamo che l'intero processo richiede circa 7.0-9.0 ore (h). Fare 50 marcatori (5 per topo) prende circa 2,0 h. mouse registrazione a piedi di comportamento può essere fatto da soli o in coppia. Lavorando da solo, ci vogliono circa 25 min per topo, mentre lavorando in una coppia prende circa 10 min per topo; di conseguenza, registrazione 10 topi potrebbe richiedere da 1,5 h (coppia) a 4,0 h (assolo). Infine, l'analisi dei dati e grafici prendere circa 3,5 h. Anche se questa tecnica è alta intensità di manodopera, riteniamo che i potenziale comprensioni nei meccanismi di malattia offerti da analisi cinematica di andatura giustifica questo investimento. Avendo buoni correlati comportamentali della patologia delle malattie è utile in quanto le misure di serie possono essere preso da un mouse dal vivo non invadente. Dato il vicino perfetta correlazione tra cinematica della caviglia e del midollo spinale lombare materia bianca perdita26, questo metodo può essere utilizzato per accertare il profilo temporale del demyelination e il remyelination in topi EAE nel corso di un esperimento, permettendo recupero da valutare.
Analisi del passo è complicata da grave paralisi che limita il movimento delle zampe posteriori. Tuttavia, anche gravemente paralizzato topi (Punteggio clinico > 3.0) sono spesso in grado di deambulare in una certa misura. In questi casi, gli arti anteriori sono utilizzati per tirare l'animale in avanti, e qualche movimento hindlimb si verifica che può essere misurato dall'analisi cinematica di andatura. Anche in questi casi gravi, è ancora possibile misurare il recupero della funzione del hindlimb nel corso del tempo. Solo in casi molto gravi (20% degli animali con punteggi clinici > 3.5 a malattia di picco, DPI 16-23) siamo stati in grado di ottenere utili registrazioni del hindlimb movimento. Tuttavia, questi animali solitamente riguadagnare qualche funzione hindlimb da 30 DPI, consentendo significative registrazioni da ottenere a quel punto di tempo.
Una futura applicazione di questa tecnica è accoppiamento dati cinematici con le registrazioni elettromiografiche simultanee dell'arto posteriore durante la locomozione. Questa tecnica è stato fatto in modelli murini di ALS e SCI e può essere utilizzata per chiarire la relazione tra l'attività muscolare, innervazione e andatura. Questa tecnica può anche essere accoppiata con più mirati modelli di MS e demielinizzazione che può produrre ulteriori deficit di andatura discreti, compreso focale EAE modelli29,30 o demielinizzazione indotta da cuprizone31.
Le tecniche che abbiamo descritto per la misura di movimenti articolari in topi EAE possono applicarsi anche ad altri disturbi che alterano l'andatura. Distinti cambiamenti nell'andatura sono stati segnalati per modelli murini di PD, SCI, ALS e colpo8,9,10,11,13,14. Ad esempio, modelli del roditore del PD sono caratterizzati dalla lunghezza del passo ridotto e velocità, con conseguente elevata cadenza di mantenere a piedi velocità32. Analisi cinematica di andatura pertanto fornisce potenti strumenti comportamentali per delucidare i meccanismi della malattia e identificare i possibili trattamenti utilizzando questi modelli.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere Sid Chedrawe per la sua assistenza tecnica con le riprese. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti dalla MS Society of Canada (EGID 2983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
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