Summary
矢状面的运动学步态分析获得了关于如何执行运动的高度精确的信息。我们描述了这些技术的应用, 以确定小鼠的步态缺陷受自身免疫介导的鞘。这些方法也可以用来表征步态缺陷的其他小鼠模型的运动障碍。
Abstract
运动步态分析在矢状面经常被用来表征运动缺陷的多发性硬化 (MS)。我们描述了这些技术的应用, 以确定步态缺陷的 MS, 称为实验性自身免疫脑脊髓炎 (EAE) 的小鼠模型。瘫痪和运动缺陷的小鼠受 EAE 通常评估使用临床评分规模。然而, 这个规模只产生的序号数据, 提供了很少的信息的确切性质的电机赤字。EAE 疾病的严重性也评估了 rotarod 的性能, 这提供了一个一般的运动协调的措施。相比之下, 矢状面后肢的运动学步态分析产生了关于运动如何受损的高度精确的信息。为了执行这一过程, 反射标记被放置在后肢, 以检测关节运动, 而鼠标在跑步机上行走。运动分析软件用于测量行走过程中标记物的运动。然后从结果数据中推导出运动学步态参数。我们展示了这些步态参数是如何用来量化 EAE 的髋、膝和踝关节运动损伤的。这些技术可以用来更好地了解疾病的机制, 并确定潜在的治疗 MS 和其他神经退行性疾病, 损害移动性。
Introduction
步态是四肢的一系列重复运动, 用来实现运动。步态由阶梯周期组成, 分为两个阶段: 姿态阶段, 即脚在地面向后移动以推动身体向前;和摆动阶段, 脚下是离地和向前移动。步态紊乱是许多神经退行性疾病的特征, 如脊髓损伤 (SCI)、多发性硬化 (MS)、肌萎缩侧索硬化 (ALS)、帕金森病 (PD) 和中风;这些疾病的临床前鼠模型经常重述他们各自的步态损伤1。对小鼠运动的基本控制机制进行了深入的研究2,3。此外, 还有许多人类神经系统疾病的小鼠模型4。因此, 在小鼠的步态分析是一个很有吸引力的方法, 以测量多个方面的运动赤字已知的解剖关联。研究的步态在小鼠模型可能提供洞察到病理基地的运动赤字的神经退行性疾病, 并使识别的潜在治疗。
一些用于测量啮齿类动物步态的技术包括目视检查 (例如、低音鼠标缩放5和开放字段测试6) 和从腹面的步态分析7。最近, 测量后肢运动矢状面运动学的方法越来越受欢迎, 因为它们提供了有关运动执行的更多信息, 因此对步态的细微变化更敏感8,9,10,11. 为研究矢状面后肢运动而开发的运动学技术在跑步机上的9,12在 SCI、ALS、外伤性皮质损伤、中风和亨廷顿氏病8,9,10,11,13,14,15,16。相比之下, 这些技术在研究多发性硬化症小鼠模型的运动缺陷方面的应用是有限的17。
实验性自身免疫脑脊髓炎 (EAE) 是 MS18最常用的小鼠模型。诱导 EAE 的两种主要方法是通过主动或被动接种。在主动 EAE, 小鼠用髓鞘抗原免疫, 导致脊髓和小脑性 T 细胞介导的 neuroinflammation 和鞘。另一方面, 被动 EAE 是通过将性 T 细胞从具有活性 EAE 的鼠标转移到一个天真的鼠标19而诱导的。如其他地方所述, 疾病病程和神经病受中枢神经系统 (CNS) 抗原和小鼠的影响20,21,22,23,24 ,25。在 EAE 实验中, 控制小鼠注射完整的弗氏的佐剂 (CFA) 没有髓鞘抗原。EAE 的特点是上升麻痹, 从尾部的弱点开始, 并可能涉及前肢, 导致共济失调和瘫痪20。我们最近的特点是 C57Bl/6 小鼠的步态变化, 受髓鞘胶质糖蛋白 35-55 (MOG35-55) 诱导的 EAE。这些研究表明, 步态分析优于经典行为分析, 因为偏离正常踝关节运动是高度相关的程度, 白物质损失在腰椎脊髓的 EAE 小鼠26。相比之下, 白物质损失与其他两种传统行为方法 (临床评分和 rotarod) 的相关性较弱,26更弱。
我们在这里描述了运动步态分析, 以检测 EAE 小鼠在跑步机上行走时矢状面的运动缺陷。五反射标记被放置在后肢, 以确定运动的臀部, 膝盖, 和踝关节在高速录像。运用运动分析软件对联合游览的运动学数据进行提取。这些技术的效用, 以量化移动赤字的 MOG35-55模型的 EAE 讨论。这些技术也适用于研究其他小鼠神经退行性疾病模型的步态缺损。
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Protocol
本议定书符合加拿大动物保育委员会的准则, 并获达尔豪大学实验室动物委员会批准.
1. 构造反射标记:
- 使用 hand-held 孔冲床, 从一张反光纸上打出所需的小圆圈数。每只动物需要5个标记为一个单独录音;两个大的和三小的标记.
- 使用细剪刀, 使从周长延伸到圆心的直切口.
- 卸下标记的纸张背面, 以显示粘合剂表面。使用精细钳, 牢牢抓住标记和卷曲它本身使用你的手指形成一个锥形形状。做一个小的标记, 旋紧锥体。做一个大的标记, 卷曲的锥形松散.
- 使用 hand-held 胶枪, 用胶水将锥形标记的内侧填充, 同时用镊子夹紧锥尖, 并将标记粘附在一块扁平的纸板上。胶水将防止标记在录音过程中倒塌和弯曲, 以确保最佳反射光。当胶水是干的 (约10分钟), 从纸板上取下的标志与手术刀 ( 图 1A ).
2。将鼠标置于感应腔中, 准备记录
- 用异氟醚气体 (2.5%; 2 升/分 O 2 ) 麻醉鼠标。一旦鼠标是无意识的, 把它放在一个鼻子锥放置在循环水加热毯的顶部。麻醉的目的是使鼠标固定在标记位置;程序并不痛苦。因此, 不需要对麻醉深度进行评估.
- 对两只眼睛应用局部眼部润滑剂.
- 使用电动快船刮掉所需的后肢。从脚踝开始, 伸展到肋骨的脊柱和底部;确保没有毛皮留下, 因为这将损害标志的附着力.
注: 在这里, 右后肢被记录;然而, 任何一个后肢都可以使用. - 使用永久性标记, 指示髂嵴和髋关节的位置。髂嵴是略低于肋骨底部, 很容易扪通过把膝盖在鼠标和 #39; s 的身体.
注意: 髋关节可以通过弯曲和伸展腿部找到骨盆和股骨之间的关节点. - 使用细钳, 抓住 小 标记的尖端, 并在快速作用的粘合胶中浸出底座, 或等效的替代品。将标记放在第四位数的顶端, 并放置2-3 秒以使胶水干燥。以相同的方式将其他两个小标记放置在趾关节和踝关节上 ( 图 1B ).
- 放置 在髂嵴和髋关节 ( 图 1B ) 上的大 标记, 其方式与小标记相同.
- 从机头锥中取出鼠标, 然后使用转笼立即转到录音室。将鼠标放在固定式跑步机上, 并允许从麻醉中完全恢复.
3。步态记录
- 在记录鼠标和 #39 的步态之前, 请在跑步机上使用已知尺寸的校准块的图片.
注意: 这将允许将视频中的像素转换为实际的测量。相机应该放置大约120厘米从跑步机。- 将照相机放置在与跑步机相同的高度和级别上。为校准图像后的录制保持相同的相机位置.
- 一旦鼠标完全从麻醉中恢复, 将跑步机转到低速 (5 厘米/秒), 让鼠标开始行走。确保跑步机皮带的方向是鼠标上的标记朝向相机.
- 将跑步机的速度逐渐提高到20厘米/秒; 这是大多数健康小鼠的理想的步态速度.
注意: 虽然所有的老鼠都以同样的速度行走是理想的, 但有些人可能无法始终如一地达到这个速度。- 如果鼠标无法在20厘米/秒内行走, 则根据需要降低速度, 并且一定要记下这一点。减少跑步机的速度直到达到一致的步骤周期.
注意: 以后的数据分析可以根据速度的差异进行调整.
- 如果鼠标无法在20厘米/秒内行走, 则根据需要降低速度, 并且一定要记下这一点。减少跑步机的速度直到达到一致的步骤周期.
- 在鼠标稳步行走时开始录制视频 ( 即 , 以一致的速度行走, 不向一侧饲养或编织)。继续录制, 直到记录了8到12连续的步骤周期。对于每个视频, 记录跑步机的速度和记录的鼠标的侧面.
- 录制完成后, 关闭跑步机并将鼠标返回其笼子。在录音之间彻底清洁跑步机, 因为其他老鼠留下的气味可能会改变老鼠的行为。为了减少压力和皮肤损伤, 不要删除标记;允许老鼠自己移除它们.
4。分析
- 使用运动分析软件处理视频.
注意: 在我们的实验中, 我们使用了为成像和统计软件设计的自定义脚本 (参见 材料表 ), 这是由 Dr. 尼古拉斯 Stifani 写的。使用选定的运动分析软件执行以下步骤。- 从视频中提取标记的像素坐标, 并使用校准视频将像素值转换为厘米并计算每个帧的关节角度.
- 标识每个步骤周期的开始和结束, 从而获得有关步骤持续时间和长度的信息.
- 将步骤周期持续时间正常化为200规范化的帧, 这样 swing 和姿态分别由100帧表示.
- 使用规范化帧, 使用电子表格软件计算数据分析的运动学参数 (请参见 材料表 )。
- 若要建立特定节点的平均角度, 请将规范化框架内所有角度的平均值设置为:
注意: 此处 x 表示给定规范化的角度值框架, n 表示规范化的帧编号. - 要建立给定鼠标的特定关节的运动范围, 请从一组规范化帧中的最大角度减去最小角度, 如下所示:
移动范围 = 角度 最大 角度 最小 。 注意: 这里的角度 最大 和角度 最小 分别是在规范化的步骤周期内达到的最大和最小的角度. - 要建立 RMS 差异, 首先从基线记录中减去每个实验时点的平均角度。其次, 平方的各差, 取所有平方值的平均值和平方根的平均值。等式如下:
注意: 这里
表示基线记录的平均角度; y 代表每个实验时点的平均角度; n , 表示规范化帧的数目。根平均数平方 (RMS) 差是用于评估基线记录中步态偏差的测量方法.
- 若要建立特定节点的平均角度, 请将规范化框架内所有角度的平均值设置为:
- 使用科学的绘图和统计软件分析和显示数据 (请参见 材料表 ).
表示基线记录的平均角度; y 代表每个实验时点的平均角度; n , 表示规范化帧的数目。根平均数平方 (RMS) 差是用于评估基线记录中步态偏差的测量方法. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图 1是用于运动学步态分析的过程的示意图表示。首先, 在5解剖点上制作并放置在鼠标上的反射标记。当鼠标在跑步机上行走时, 步态会被记录下来。运动分析软件用于提取运动学数据进行后续分析。
图 2A-c表示控制 CFA 鼠标对臀部、膝盖和踝关节角度的步进周期, 记录在相隔一周的三连续记录会话中。波形之间的重叠显示1-3 节的步骤周期中的最小偏差。图 2D-f表示第二个控制 CFA 鼠标的步骤周期, 它显示了从记录会话1-3 的更大的行走可变性。虽然步周期沿 y-axis 移动, 波形的形状在录音之间保持一致。这种变化的水平是典型的鼠标行走。
图 3A-c表示 EAE 在三连续记录会话中记录的鼠标的步骤周期。从第一次到第二次录音, 步态的变化极小, 但在第三次会议上, 步态在所有三关节上都发生了深刻的改变。对于臀部, 一个显着的扁平化的步骤周期已经发生, 表明大量的运动损失。膝盖变得更弯曲, 更不能够伸展和支持动物的体重。踝关节的运动也有极大的改变。脚背和跖屈在摆动 (白色面板) 和立场 (绿色面板) 阶段, 分别延迟。这些缺陷表明, 在这个关节肌肉薄弱, 因为它的能力, 以提高其脚在摆动阶段, 并推动身体向前在立场阶段。
在图 4中显示的以下数据是从 Fiander et al.中重新发布的(2017)具有权限的26 。利用 one-way 重复测量方差分析栎-Sidak 多次比较试验, 将所有时间点与基线26进行比较。在每个时点计算平均角度 (图 4A和图 4D)、运动范围 (图 4B和图 4E) 和 RMS 差异 (数字 4C和数字 4F), 以量化步态赤字 (每组 n=8)。在目前的 EAE 实验中, 临床评分的开始是 DPI 14, 这是在第二周的录音之后。CFA 小鼠的平均膝关节角度 (图 4A) 或膝关节 RMS 差异 (图 4C) 没有变化, 但没有表现出一个小的增加膝关节运动范围 [F (27) = 5.871, p = 0.0083], DPI 16 和30相对于基线 (图 4B)。这种细微的变化可能反映了 CFA 注射的痛苦。与 CFA 动物对比, 有大变动在膝盖关节为 EAE 动物为平均角度 [F (67) = 11.08, p和 #60; 0.0001] (图 4D), 运动范围 [F (67) = 14.42, p 和 #60; 0.0001] (图 4E) 和 RMS差异 (图 4F)。平均角度明显减少, 表明 EAE 小鼠的膝盖在行走时更有弯曲。这可能表明肌肉无力, 因为动物无法伸展他们的膝关节, 以支持他们的体重。运动的范围也减少了, 又可能是由于动物无法伸展膝关节。膝关节有效值差异显著增加, 表明 EAE 小鼠膝关节的运动与基线记录基本不同。
使用 one-way 重复测量分析了图 5中的数据, 栎-Sidak 多次比较测试将步态参数值与临床评分 0.5-3.5 的结果进行了比较, 并将临床分值0。相关分析也进行了使用长矛 (ρ)。平均膝关节角度 (图 5A)、运动范围 (图 5B) 和 RMS 差异 (图 5C) 与临床评分 (p和 #60; 0.001) 密切相关。这些关节运动与经典临床评分的相关性证实了运动步态分析对 EAE 小鼠的运动缺陷进行评估的有效性。膝关节运动范围 (图 5A) 和 RMS 差异 (图 5C) 从临床评分 2.0 (p和 #60; 0.05) 开始显著减少。这些发现表明, 受损的膝部运动不会导致因临床评分低于2.0 而发现的运动缺陷。然而, 膝关节平均角度 (图 5B) 从临床评分 1.0 (p和 #60 0.05) 开始减少。这表明, 对于膝关节运动, 平均角度是最敏感的三措施。
图 1: 用鼠标进行运动学步态记录的示意图.一旦反射标记被做, 他们被放置在髂嵴, 髋关节, 踝关节, 趾关节, 和尖端的第四位数。当鼠标在跑步机上行走时, 用高速摄影机记录步态。运动分析软件用于提取步态参数, 用于后续分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 接收 CFA 的两个控制小鼠的步进周期波形示例
白色和绿色背景分别代表摇摆和姿态阶段。对于鼠标 1, 臀部 (A)、膝部 (B) 和踝关节 (C) 步进周期波形在间隔一周的3连续录制会话中相互重叠。对于鼠标 2, 臀部 (D)、膝部 (E) 和踝关节 (F) 的步进周期波形因行走行为的固有变异性而稍有偏离。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: EAE 小鼠的步进周期波形.白色和绿色背景分别代表摇摆和姿态阶段, 连续三个录音会议间隔一个星期分开。在 3rd记录会话中, 髋关节 (A)、膝部 (B) 和踝关节 (C) 波形因 EAE 疾病进展而大大改变。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 平均角度、运动范围和根均方根用于分析运动学数据.计算平均角度、运动范围和 RMS 差异, 以量化 EAE 小鼠的运动缺陷。平均膝关节角度 (A)、运动范围 (B) 和 RMS (C) 对 CFA 小鼠的影响仍然相对恒定。EAE 的小鼠显示膝关节平均角 (D)、运动范围 (E) 和 RMS (F) 受损。数据以平均±标准差表示;* p和 #60; 0.05, ** p和 #60; 0.01, *** p和 #60; 0.001, 日后免疫接种 (DPI)-2 的差异;# p & #60; 0.05, 与峰值赤字的区别。转载于参考文献 26, 经原出版商许可。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.平均膝关节角度、运动范围和 RMS 差异与临床评分相关
对膝关节运动的三运动学指标与临床评分进行相关分析, 比较两种方法。平均膝关节角度 (A)、运动范围 (B) 和 RMS 差异 (C) 与临床评分密切相关。膝关节的运动和 RMS 的差异减少开始的临床评分为 2.0, 而平均膝关节角下降较早的临床评分为1.0。数据以平均±标准差表示;* p和 #60; 0.05 与临床评分的差异0.0。对于ρ, ** p和 #60; 0.001。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在小鼠与 EAE, 两种最常用的测量运动缺陷的方法是临床评分和秋季潜伏期从 rotarod27,28。这些技术有几个局限性。虽然方便和广泛使用, 临床评分是有限的只产生序号水平的数据, 这意味着, 临床评分之间的差异的大小是未知的。临床评分也因无法提供有关电机缺陷性质的精确信息而遭受损失。rotarod 试验提高了临床评分的一些局限性, 但只测量一般的运动协调, 不衡量步行的具体方面。
相比之下, 运动学步态分析提供了有关运动的具体方面的敏感措施, 包括不同关节的运动范围和平均角度。MOG35-55 EAE 小鼠在髋关节和膝关节运动中的细微缺陷已在 DPI9 发现, 大约5-9 天前出现临床症状或 rotarod 缺陷26。尽管临床症状完全缓解, 但在缺乏 rotarod 赤字的情况下, 这些缺陷仍然存在26。重要的是, 受损的踝关节运动测量的 RMS 差异非常好与白物质损失在脊髓26。
有几个方法论上的要点值得特别提及: 1) 准确和一致地放置关节标记是至关重要的-髋关节和髂嵴必须仔细识别心悸;2) 有必要从8-12 步周期获得录音。平均这些步骤周期产生一个代表性的平均步骤周期, 可以进一步分析;3) 必须建立最佳照明条件, 以确保标记在录音中清晰可见。如果标记没有被正确地照亮, 这可能使数字化录影一个费力的过程, 因为许多运动分析节目将无法跟踪标记, 需要手工跟踪。
这项技术的另一个限制是劳动密集型。例如, 要记录和分析来自一组10只老鼠的数据, 我们估计整个过程大约需要 7.0-9.0 小时 (h)。制作50标记 (每只老鼠 5) 需要大约2.0 小时. 记录鼠标行走行为可以单独完成或在一对。单独工作时, 每只老鼠大约需要25分钟, 而对每只老鼠的工作需要大约10分钟;因此, 记录10只老鼠可能需要从 1.5 h (对) 到 4.0 h (独奏)。最后, 数据分析和绘图大约需要3.5 小时。虽然这项技术是劳动密集型, 我们认为, 潜在的洞察力的疾病机制提供的运动学步态分析证明这一投资。有良好的行为相关性疾病病理学是有用的, 因为串行测量可以采取从活老鼠性。鉴于踝关节运动与腰椎脊髓白质损耗的近乎完美的相关性26, 该方法可用于确定实验过程中 EAE 小鼠鞘和髓的时间分布, 从而要评估的恢复。
步态分析是复杂的严重瘫痪, 限制运动的后肢。然而, 即使是严重瘫痪的小鼠 (临床评分和 #62; 3.0) 在某种程度上也能走动。在这些情况下, 前肢是用来拉动动物向前, 和一些后肢运动发生, 可以通过运动学步态分析测量。即使在这些严重的情况下, 仍然可以测量后肢功能的恢复时间。只有在非常严重的情况下 (20% 的动物的临床评分和 #62; 3.5 在峰值疾病, DPI 16-23), 我们一直无法获得有用的录音后肢运动。然而, 这些动物通常恢复一些后肢功能的 DPI 30, 允许有意义的录音, 以获得在那个时间点。
这项技术的未来应用是耦合运动学数据与同时肌录音的后肢在运动。该技术已在小鼠 ALS 和 SCI 模型中进行, 可用于阐明肌肉活动、神经支配和步态之间的关系。这项技术还可以与更多的 MS 和鞘的目标模型结合, 这可能产生更多的离散步态缺陷, 包括焦点 EAE 模型29,30或 cuprizone 诱导的鞘31。
我们所描述的测量 EAE 小鼠关节运动的技术也可以应用于其他损害步态的疾病。不同的步态变化已经报告了小鼠 PD, SCI, ALS, 和中风8,9,10,11,13,.例如, 帕金森病模型的特点是减少步幅长度和速度, 导致提高节奏, 以保持步行速度32。因此, 运动学步态分析提供了强有力的行为工具, 以阐明疾病的机制和识别潜在的治疗使用这些模型。
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Disclosures
作者声明他们没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢希德 Chedrawe 的技术援助与拍摄。这项工作得到了加拿大 MS 协会 (EGID 2983) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
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