Summary
Kinematisk gait analyse i sagittal flyet gir svært presis informasjon om hvordan bevegelse utføres. Vi beskriver bruk av disse teknikkene for å identifisere gangart underskudd for mus underlegges autoimmune-mediert demyelinisering. Disse metodene kan også brukes til å beskrive gangart underskudd for andre musen modeller med nedsatt bevegelse.
Abstract
Kinematisk gait analyse i sagittal flyet er ofte brukt til å beskrive motor underskudd i multippel sklerose (MS). Vi beskriver bruk av disse teknikkene for å identifisere gangart underskudd i en musemodell av MS, kjent som eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE). Lammelse og motor underskudd i mus underlegges EAE vurderes vanligvis med en klinisk scoring skala. Men gir denne skalaen bare ordenstall data som gir litt informasjon om den nøyaktige naturen av motor underskudd. EAE sykdommens alvorlighetsgrad har også blitt vurdert av rotarod ytelse, som gir et mål på generelle koordinasjon. Derimot genererer Kinematisk gait analyse av baklem i sagittal flyet svært presis informasjon om hvordan bevegelse er svekket. For å utføre denne prosedyren, er reflekterende markører plassert på en hind lem å oppdage felles bevegelse mens en mus er å vandre på en tredemølle. Bevegelse analyseprogramvare brukes til å måle bevegelse av markører ved gåing. Kinematisk gangart parametere er deretter avledet fra resulterende dataene. Vi viser hvordan parameterne gangart kan brukes å kvantifisere svekket bevegelser i hofte og kne ankelen leddene i EAE. Disse teknikkene kan brukes til å bedre forstå sykdom mekanismer og identifisere mulige behandlinger for MS og andre nevrodegenerative sykdommer som forringe mobilitet.
Introduction
Gangart er en serie av repeterende bevegelser av lemmer brukte å oppnå bevegelse. Gangart består av trinn sykluser, som er delt inn i to faser: den holdning fasen, som er når foten går bakover på bakken å drive kroppen fremover; og swing fasen, hvor foten er av bakken og flytte fremover. Forstyrrelser i gangart er kjennemerket kjennetegner mange nevrodegenerative lidelser, som ryggmargsskade (SCI), multippel sklerose (MS), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Parkinsons sykdom (PD) og strøk. prekliniske gnager modeller av disse lidelser recapitulate ofte deres respektive gangart impairments1. Grunnleggende kontrollmekanismer av bevegelse i mus har vært intenst studerte2,3. I tillegg finnes det musen modeller av mange menneskelige nevrologiske lidelser4. Gait analyse i mus er derfor en tiltalende tilnærming til måler flere aspekter av motor underskudd som har kjent anatomiske korrelerer. Studiet av gangart i musen modeller kan gi innsikt i neuropathological baser av locomotor underskudd i nevrodegenerative lidelser, og aktiverer identifisering av potensielle behandlingene.
Noen teknikker som er brukt til å måle gangart i gnagere er visuell inspeksjon (f.eks, Basso musen skala5 og åpne feltet test6) og analyse av gangart fra ventrale flyet7. Flere nylig, metoder for å måle sagittal flyet kinematikk hindlimb bevegelser har vunnet popularitet fordi de gir mer informasjon om gjennomføring av bevegelse, og derfor er mer følsomme for subtile endringer i gangart8, 9 , 10 , 11. Kinematisk teknikker utviklet for å studere hindlimb bevegelse i sagittal fly mens du går på en tredemølle9,12 har vært grundig undersøkt i sammenheng med SCI ALS traumatisk kortikale skader, slag, og Huntingtons sykdom8,9,10,11,13,14,15,16. Disse teknikkene har derimot sett begrenset bruk i studiet av locomotor underskudd musen modeller av multippel sklerose17.
Eksperimentell autoimmune immunsviktvirus (EAE) er den vanligste musen MS18. De to hovedmetoder for å indusere EAE er via aktiv eller passiv vaksinering. I aktive EAE, er mus vaksinert med myelin antigener, forårsaker autoreactive T celle-mediert neuroinflammation og demyelinisering i ryggmargen og lillehjernen. Passiv EAE, derimot, er indusert ved å overføre autoreactive T celler fra en mus med aktive EAE til en naiv musen19. Som beskrevet andre steder, sykdom kurs og neuropathology er påvirket av sentralnervesystemet (CNS) antigen og mus belastning20,21,22,23,24 ,25. EAE eksperimenter, er kontroll mus injisert med komplett Freund's adjuvant (CFA) uten myelin antigen. EAE er preget av stigende lammelse som begynner med halen svakhet og kan oppstå forelimbs, noe som resulterer i ataksi og lammelser20. Vi har nylig preget gangart endringer i C57Bl/6 mus utsatt for myelin oligodendrocyte glykoprotein 35-55 (MOG35-55)-indusert EAE. Disse studiene har vist gait analyse å være overlegen enn klassisk atferdsanalyse fordi avvik fra normal ankel bevegelse er sterkt korrelert med graden av hvit substans tap i lumbal ryggmargen EAE mus26. Derimot ble styrken på sammenhengen mellom hvit substans tap og to andre tradisjonelle opptreden mål (klinisk scoring og rotarod) mye svakere26.
Her beskriver vi bruk av Kinematisk gait analyse å oppdage bevegelse underskudd i sagittal flyet EAE mus walking på en tredemølle. Fem reflekterende markører ble plassert på en hindlimb til å identifisere bevegelsen hip, kne og ankel leddene i høyhastighets videoopptak. Bevegelse analyseprogramvare ble brukt til å trekke ut Kinematisk data om felles utflukter. Nytten av disse teknikkene å kvantifisere bevegelse underskudd for MOG35-55 modellen av EAE diskuteres. Disse teknikkene gjelder også til studiet av gangart underskudd i andre musen modeller av nevrodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denne protokollen er kanadiske Rådet for Animal Care retningslinjer og ble godkjent av Dalhousie University i forsøksdyr.
1. bygge reflekterende markører:
- ved hjelp av en håndholdt hull punch ønsket antall små sirkler fra et reflekterende papirark. Hvert dyr krever 5 markører for en enkelt opptaket; to store og tre små markører.
- Bruke fine saks, lage en rett snitt som strekker seg fra perimeteren til midten av sirkelen.
- Fjern papir backing av merket å avsløre den selvklebende overflaten. Bruke fine tang, grip markøren fast og krølle det i seg selv ved å bruke fingeren til å danne en kjegle-figur. For å gjøre en liten markør, krølle membran tett. For å gjøre en stor markør, krølle membran løst.
- Bruker en håndholdt limpistolen, fylle innsiden av koniske markøren med lim mens gripende spissen av membran med tang og følge markøren til en flat stykke papp. Limet vil hindre markøren fra skjule og bøye under opptak for å sikre optimal refleksjon av lys. Når limet er tørt (ca 10 min), fjerne merket fra papp med en skalpell ( figur 1A).
2. Forberede dyr innspillingen
- Anesthetize musen med isoflurane gass (2,5%, 2 liter/min O 2) ved å plassere musen i en induksjon kammer. Når musen er bevisstløs, Legg den i en forpart plassert på toppen av en resirkulerende vann varme teppe. Formålet med anesthetization er å nakkens musen for markør plassering; prosedyren er ikke smertefulle. Derfor dybdeskarphet anestesi trenger ikke å bli vurdert.
- Aktuell øye smøremiddel gjelder begge øynene.
- Barbere den ønskede hindlimb med elektrisk avklipt. Begynne på ankelen og utvide til ryggraden og bunnen av ribbeina; sikre ingen pels igjen som dette vil svekke markør vedheft.
Merk: Her den høyre hindlimb ble registrert; men enten hindlimb kan brukes. - Med et permanent markør, angi plasseringen til iliaca bølgetopp og hofteleddet. Iliaca bølgetopp rett nedenfor bunnen av ribbeina og er lett håndgripelig ved å bringe knærne sammen under musen ' s kropp.
Merk: Hofteleddet kan finnes ved bøye og utvide benet for å finne den artikulasjon punktet mellom bekken og femur. - Bruke fine tang, forstå den spisse enden av en liten markør og dyppe base i Fort-fungerende selvklebende lim, eller et tilsvarende alternativ. Plasser markøren på tuppen av fjerde sifferet og hold på plass for 2-3 s slik at limet til tørk. Plasser de andre to små markørene på metatarsophalangeal felles og ankelen på samme måte ( figur 1B).
- Plasser store indikatorer på iliaca bølgetopp og hofteleddet ( figur 1B) på samme måte som de små merkene.
- Fjerne musen fra nesen kjegle og øyeblikkelig overføre til opptak rommet ved hjelp av en overføring bur. Plasser musen på stasjonære tredemølle og tillate full gjenoppretting bedøvelsen.
3. Gangart innspillingen
- før å opptak musen ' s gangart, ta et bilde av en kalibrering blokk med kjente dimensjoner på tredemølle.
Merk: Dette vil tillate bildepunktene i videoen til virkelige mål. Kameraet bør plasseres ca 120 cm fra tredemøllen.- Posisjon kameraet på samme høyde og nivå som tredemøllen. Opprettholde samme Kameraposisjonen for innspillingene etter kalibrering bildet.
- Når musen er helt gjenopprettet etter anestesi, slå tredemølle til en lav hastighet (5 cm/s) la musen Begynn å gå. Sikre at tredemølle belte retning slik at markørene på musen er vendt mot kameraet.
- Øker tredemøllen hastighet gradvis opp til 20 cm/s, dette er den ideelle hastigheten for en konsekvent gangart i mest sunn mus.
Merk: Selv om det er ideelt for å nyte alle mus gå med samme hastighet, kan noen være stand til å konsekvent nå denne hastigheten.- Hvis musen ikke kan gå på 20 cm/s, redusere hastigheten som er nødvendig, og sørg for å notere dette. Reduser hastigheten på tredemøllen til konsekvent trinn sykluser er oppnådd.
Merk: Senere dataanalyse kan justere for forskjeller i hastigheter.
- Hvis musen ikke kan gå på 20 cm/s, redusere hastigheten som er nødvendig, og sørg for å notere dette. Reduser hastigheten på tredemøllen til konsekvent trinn sykluser er oppnådd.
- Start videoinnspillingen når musen går jevnt (dvs, går på en konsekvent tempo, ikke oppdrett eller veving siden). Fortsette innspillingen til 8-12 sammenhengende trinn sykluser er spilt. Hver video, ta opp hastigheten på tredemøllen og på siden av musen registrert.
- En gang innspillingen er fullført, slår tredemølle og returnere musen til buret sitt. Rengjør tredemølle grundig mellom opptak som dufter etterlatt av andre mus kan endre virkemåten for innkommende mus. For å redusere stress og hudskader, Fjern ikke markører; tillate at mus til å fjerne dem på egenhånd.
4. Analyser
- Behandle videoene bruker bevegelse analyseprogramvare.
Merk: I våre eksperimenter, vi brukt egendefinerte skript utformet for imaging og statistisk programvare (se Tabell for materiale) som ble skrevet av Dr. Nicolas Stifani. Følgende utføres ved hjelp av valgte bevegelse analyseprogramvare.- Ekstra pikselkoordinater på markørene fra videoer, og bruker kalibrering videoen, transformere pikselverdiene til centimeter og beregne felles vinkler i hver ramme.
- Identifisere begynnelsen og slutten av hvert trinn syklus, dermed få informasjon om trinnets varighet og lengde.
- Normalisere trinnet varighet 200 normalisert rammer, slik at swing og holdning er representert ved 100 rammer, henholdsvis.
- Bruke de normaliserte rammene, beregne Kinematisk parametere for dataanalyse ved hjelp av regneark (se Tabell for materiale).
- å etablere gjennomsnittlig vinkelen på en bestemt felles, tar gjennomsnittet av alle vinkler i en normalisert ramme som:
Merk: her x representerer vinkel verdien en gitt normalisert ramme, og n representerer den normaliserte bildenummer. - å etablere bevegelsesområdet av en bestemt felles for en gitt musen, trekke minste vinkelen fra den største vinkelen i et normalisert rammer som følger:
Bevegelsesutslag = vinkel maksimal - vinkel minimum.
Merk: Her vinkel maksimal og vinkel minimum er de største og minste vinklene oppnådd i normalisert trinnet syklusen, henholdsvis. - å etablere RMS forskjellen, først trekke gjennomsnittlig vinkelen av hver eksperimentelle tidspunkt fra planlagte opptaket. Deretter kvadrat hver forskjellen, tar gjennomsnittet av alle kvadrerte verdier og kvadratrot gjennomsnittet. Formelen er som følger:
Merk: her
representerer gjennomsnittlig vinkelen fra grunnlinjen opptak; y angir gjennomsnittlig vinkel fra hver eksperimentelle tidspunkt; n og representerer antall normalisert rammer. Rot betyr kvadrerte (RMS) forskjellen er en måling som brukes til å vurdere avvik i gangart planlagte opptak.
- å etablere gjennomsnittlig vinkelen på en bestemt felles, tar gjennomsnittet av alle vinkler i en normalisert ramme som:
- Bruk vitenskapelige grafer og statistikk programvare å analysere og presentere dataene (se Tabell for materiale).
representerer gjennomsnittlig vinkelen fra grunnlinjen opptak; y angir gjennomsnittlig vinkel fra hver eksperimentelle tidspunkt; n og representerer antall normalisert rammer. Rot betyr kvadrerte (RMS) forskjellen er en måling som brukes til å vurdere avvik i gangart planlagte opptak.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er en skjematisk fremstilling av prosedyren brukes for Kinematisk gait analyse. Første, reflekterende markører er laget og plassert på en mus på 5 anatomiske punkter. Gangart registreres deretter mens musen er å vandre på en tredemølle. Bevegelse analyseprogramvare brukes til å hente Kinematisk dataene for senere analyse.
Figur 2A C representerer trinnet syklusen av kontroll CFA mus for hip, kne og ankel felles vinklene innspilt på tre påfølgende innspillingen linjeavstand en uke fra hverandre. Overlappingen mellom bølgeformene viser minimal avvik i trinn sykluser fra økter 1-3. Figur 2D -F representerer trinnet syklusen av andre kontroll CFA mus som vist større gangavstand variasjon fra innspillingen økter 1-3. Selv om trinn sykluser er flyttet langs y-aksen, forblir formen på bølgeformene konsekvent mellom opptak. Denne variasjonen er typisk for musen gangavstand.
Figur 3A C representerer trinnet syklusen av en mus med EAE registrert på tre påfølgende innspillingen. Det er minimal endringer i gangart fra første til andre innspillingen økten, men den tredje økten, gangart er dypt endret i alle tre ledd. For hoften oppstod en betydelig flatere over trinn syklus, som viser en betydelig tap av bevegelse. Kneet har blitt mer flexed og mindre i stand til å utvide og støtte dyr kropp vekt. Bevegelser i ankelleddet var også betydelig endret. Foten dorsiflexion og plantar strekking er forsinket i løpet av swing (hvit panel) og holdning (grønn panel) faser, henholdsvis. Disse underskudd er tegn på muskelsvakhet på denne felles som dyret er svekket evne til å både øke foten i swing-fasen, og drive kroppen frem i holdning fasen.
Følgende data vises i Figur 4 ble publisert på nytt fra Fiander et al. (2017) 26 med tillatelse. Dataene ble analysert med enveis gjentatte measures ANOVA Holm-Sidak flere sammenligninger testen til å sammenligne alle tidspunkt til planlagte26. Det gjennomsnittlige vinkel (figur 4A og Figur 4 d), utvalget av bevegelse (figur 4B og figur 4E) og RMS forskjellen (figur 4C og figur 4F) ble beregnet på hvert tidspunkt å kvantifisere gangart underskudd (n = 8 per gruppe). I stede EAE eksperimentet var utbruddet av kliniske resultater DPI 14, som etter den andre uken av innspillingen. CFA mus viste ingen endring i gjennomsnittlig kneet vinkel (figur 4A) eller kneet RMS forskjellen (figur 4C), men viser en liten økning i kneet bevegelsesutslag [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], både DPI 16 og 30 i forhold til grunnlinjen ( Figur 4B). Denne lille endringen kan gjenspeile smerter som følge CFA injeksjon. I motsetning til CFA dyrene, var det store endringer på kneet felles for EAE dyr for gjennomsnittlig vinkel [F(6,7) = 11.08, p < 0,0001] (Figur 4 d), bevegelsesutslag [F(6,7) = 14.42, p < 0,0001] (figur 4E) og RMS forskjellen (figur 4F). Gjennomsnittlig vinkelen ble betydelig redusert, noe som indikerer at EAE musene hadde knærne mer bøyes ved gåing. Dette kan være indikativ av muskel svakheter som dyrene var stand til å utvide deres kneledd for å støtte deres kroppsvekt. Bevegelsesområdet ble også redusert, igjen sannsynlig på grunn av en manglende evne til dyrene å utvide kneleddet. Den betydelige økningen i kneet RMS forskjellen angir at bevegelsene til kneleddet i EAE mus var grunnleggende forskjellige fra deres opprinnelige innspilling.
Dataene i figur 5 ble analysert med enveis gjentatte measures ANOVA Holm-Sidak flere sammenligninger test som sammenlignet gangart parameterverdier på klinisk score på 0,5 - 3,5 til de oppdaget på klinisk skåren 0. Correlational analyse ble også fremført med Spearman rho (ρ). Den gjennomsnittlige kneet vinkel (figur 5A), utvalg av bevegelse (figur 5B), og RMS forskjellen (figur 5C) var sterkt korrelert med kliniske resultater (p < 0,001). Slike sammenhenger mellom felles bevegelser og klassisk klinisk scoring underbygge gyldigheten av Kinematisk gait analyse å vurdere motor underskudd for EAE mus. Kneet utvalg av bevegelse (figur 5A) og RMS forskjellen (figur 5C) ble betydelig redusert fra en klinisk score på 2.0 (p< 0,05). Disse funnene tyder på at svekket kneet bevegelser ikke bidrar til motor underskudd oppdaget av klinisk score lavere enn 2.0. Imidlertid kneet gjennomsnittlig vinkel (figur 5B) ble redusert fra klinisk poengsummen 1,0 (p< 0,05). Dette tyder på at kneet bevegelse, gjennomsnittlig vinkel er de mest sensitive av tre tiltak.
Figur 1 : Skjematisk for Kinematisk gangart med mus. Når reflekterende markører er laget, er de plassert på iliaca bølgetopp, hofteleddet, ankel, metatarsophalangeal felles og spissen av fjerde sifferet. Gangart registreres av et høyhastighets kamera mens musen er å vandre på en tredemølle. Bevegelse analyseprogramvare brukes til å hente gangart parametere for påfølgende analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempel på trinnet syklusen bølgediagrammer på to kontroll mus mottatt CFA
Den hvite og grønne bakgrunn representerer den swing og holdning fasen, henholdsvis. For musen 1 overlapper hip (A), kneet (B) og ankel (C) trinn syklus bølgeformer hverandre over 3 påfølgende innspillingen linjeavstand en uke fra hverandre. Mus 2 syklus hip (D), kneet (E) og ankel (F) trinn bølgeformer avviker litt fra hverandre på grunn av iboende variasjon innen atferd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Trinn syklus bølgeformer i mus med EAE. Den hvite og grønne bakgrunn representerer swing og holdning fase, henholdsvis for tre påfølgende innspillingen linjeavstand fra hverandre i uken. 3rd innspillingen økten, hip (A), kne (B) og ankel endres (C) bølgeformer sterkt på grunn av EAE sykdomsprogresjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Gjennomsnittlig vinkel, utvalg av bevegelse, og rot betyr kvadrat brukes til å analysere Kinematisk data. Gjennomsnittlig vinkel, utvalg av bevegelse og RMS forskjeller ble beregnet for å kvantifisere motor underskudd i EAE mus. Gjennomsnittlig kneet vinkelen (A), utvalg av bevegelse (B), og RMS (C) for CFA mus forble relativt konstant. Mus med EAE viste svekket kneet gjennomsnittlig vinkel (D), utvalg av bevegelse (E), og RMS (F). Dataene er uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavvik; p< 0,05, ** p< 0.01, *** p< 0,001, forskjell fra dagen innlegget immunisering (PPT) -2; # p < 0,05, forskjell fra topp underskudd. Gjengitt fra referanse 26 med tillatelse fra opprinnelige utgivere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Gjennomsnittlig kneet vinkel, utvalg av bevegelse og RMS forskjellen korrelerer med klinisk score
Korrelasjon-analyse ble gjennomført mellom tre Kinematisk tiltak av kneet bevegelser og kliniske resultater å sammenligne de to metodene. Den gjennomsnittlige kneet vinkel (A), utvalg av bevegelse (B), og RMS forskjellen (C) var sterkt korrelert med kliniske resultater. Kneet utvalg av bevegelse og RMS forskjellen redusert begynnelsen på en klinisk score på 2.0, mens gjennomsnittlig kneet vinkel ble redusert tidligere til kliniske poengsummen 1,0. Dataene er uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavvik; p< 0,05 forskjell fra klinisk score 0,0. For Spearman rho (ρ), *** p< 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I mus med EAE, de to vanligste måtene å måle motor underskudd er klinisk scoring og falle ventetid fra en rotarod27,28. Disse teknikkene har flere begrensninger. Selv om praktisk og brukte, er klinisk scoring begrenset av gir bare ordenstall nivå data, betyr at omfanget av forskjellene mellom kliniske resultater ikke er kjent. Klinisk scoring også lider av ikke å gi nøyaktig informasjon om naturen av motor underskudd. Rotarod testen forbedrer noen begrensninger av klinisk scoring, men bare måler generelle motorisk koordinasjon og måle ikke spesifikke aspekter av å gå.
Sammenligning gir Kinematisk gait analyse sensitive tiltak om spesifikke aspekter av bevegelse, inkludert omfanget av bevegelse og gjennomsnittlig vinkler på ulike ledd. Subtile underskudd i hofte og kne felles bevegelser for MOG35-55 EAE mus er oppdaget på DPI9, ca 5-9 dager før utbruddet av kliniske symptomer eller rotarod underskudd26. Disse underskudd opprettholdt til tross for en komplett forlatelse for klinisk underskriver og ble observert i fravær av rotarod underskudd26. Viktigere, nedsatt ankel bevegelser målt ved RMS forskjellen korrelert ytterst frisk med hvit substans tap i ryggmargen26.
Flere metodologiske punkter fortjener spesifikke nevner: 1) nøyaktig og konsekvent plassering av felles markører er avgjørende - hofteleddet og iliaca bølgetopp skal være nøye identifisert med hjertebank; 2) det er nødvendig å få opptak fra 8-12 trinn sykluser. Snitt disse trinn syklusene produserer en representant gjennomsnittlig skritt syklus som kan analyseres videre; 3) optimal lysforhold må etableres slik at markørene er synlig i opptak. Hvis indikatorer ikke er lyser riktig, kan dette gjøre digitalisering videoer en arbeidskrevende prosess som mange bevegelse analyse programmer vil kunne spore markører, nødvendiggjør manuell oppfølging.
En ytterligere begrensninger av denne teknikken er at det er arbeidsintensiv. For eksempel for å registrere og analysere data fra en gruppe 10 mus, anslå vi den totale prosessen tar ca 7.0-9.0 timer (h). Gjør 50 markører (5 per mus) tar ca 2.0 h. kan opptak musen gå atferd gjøres enten alene eller i et par. Arbeide alene, tar det ca 25 min per mus, mens arbeider i et par tar ca 10 min per mus; Derfor kan opptak 10 mus ta fra 1,5 t (par) 4.0 h (solo). Til slutt, dataanalyse og grafiske ta ca 3,5 timer. Selv om denne teknikken er arbeidsintensiv, føler vi at potensielle innsikt i sykdommen mekanismer som Kinematisk gait analyse rettferdiggjør denne investeringen. Har god atferdsmessige korrelerer sykdom patologi er nyttig som føljetong målinger kan hentes fra en levende mus ikke-invasively. Gitt den nær perfekte korrelasjonen mellom ankel kinematikk og lumbale ryggmargen hvit substans tap26, denne metoden kan brukes til å fastslå den timelige profilen av demyelinisering og remyelination i EAE mus i løpet av et eksperiment, slik at gjenoppretting skal vurderes.
Gait analyse er komplisert ved alvorlig lammelse som begrenser bevegelsen av hindlimbs. Men selv alvorlig lammet mus (klinisk score > 3.0) er ofte kunne ambulate til en viss grad. I disse tilfellene forelimbs brukes til å trekke dyret frem og noen hindlimb bevegelse oppstår som kan måles ved Kinematisk gait analyse. Selv i disse alvorlige tilfeller er det fortsatt mulig å måle utvinning av hindlimb funksjonen over tid. Bare i svært alvorlige tilfeller (20% av dyr med klinisk score > 3.5 på topp sykdom, DPI 16-23) har vi kunnet få nyttig opptak av hindlimb bevegelse. Likevel, disse dyrene vanligvis få en hindlimb funksjon av DPI 30, slik at meningsfull opptak innhentes på dette tidspunkt.
En fremtidig anvendelse av denne teknikken er kopling Kinematisk data med samtidige electromyographic opptak av hindlimb under bevegelse. Denne teknikken er gjort i musen modeller av ALS og SCI og kan brukes til å belyse forholdet mellom muskelaktivitet, gir og gangart. Denne teknikken kan også kombineres med mer målrettet modeller av MS og demyelinisering som kan produsere mer diskret gangart underskudd, inkludert fokal EAE modeller29,30 eller cuprizone-indusert demyelinisering31.
Teknikkene vi har for måling av felles bevegelser i EAE mus kan også brukes til andre lidelser som forringe gangart. Forskjellige endringer i gangart er rapportert for musen modeller av PD, SCI, ALS og hjerneslag8,9,10,11,13,14. For eksempel er gnager modeller av PD preget av redusert skrittlengde og hastighet, resulterer inne opphøyet tråkkfrekvens å opprettholde gangavstand hastighet32. Kinematisk gait analyse gir derfor kraftige atferdsmessige verktøy for å belyse sykdom mekanismer og identifisere mulige behandlinger med disse modellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne Sid Chedrawe for hans kundestøtte med filming. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra MS Society of Canada (GID 2983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
