Summary
تحليل مشيه الحركية في الطائرة السهمي تعطي معلومات دقيقة جداً حول كيف يتم تنفيذ الحركة. يصف لنا تطبيق هذه التقنيات على تحديد العجز مشيه للفئران التي تتعرض للمناعة الذاتية بوساطة demyelination. كما يمكن استخدام هذه الأساليب لوصف العجز مشيه لنماذج الماوس أخرى تتميز بضعف الحركة.
Abstract
كثيرا ما استخدمت تحليل مشيه الحركية في الطائرة السهمي لتوصيف حالات العجز الحركي في التصلب المتعدد (MS). يصف لنا تطبيق هذه التقنيات على تحديد العجز مشيه في نموذج الفأر من مرض التصلب العصبي المتعدد، المعروفة باسم النخاع الذاتية التجريبية (ع). يتم تقييم العجز الشلل والحركية في الفئران التي تعرضت إلى ع عادة استخدام مقياس التهديف سريرية. ومع ذلك، هذا المقياس غلة البيانات الترتيبية فقط أن يقدم القليل من المعلومات حول الطبيعة الدقيقة لحالات العجز الحركي. وقسمت أيضا شدة المرض إي بأداء روتارود، الذي يوفر قدرا من التنسيق الحركي العام. على النقيض من ذلك، تحليل مشيه الحركية من أطرافهم هند في الطائرة السهمي يولد معلومات دقيقة جداً عن كيفية حركة البصر. لتنفيذ هذا الإجراء، يتم وضع علامات عاكسة على أطرافهم هند للكشف عن الحركة المشتركة بينما ماوس يسير في حلقة مفرغة. الحركة تحليل البرمجيات المستخدمة لقياس حركة علامات أثناء المشي. معلمات مشيه الحركية ثم مستمدة من البيانات الناتجة. وتبين لنا كيف يمكن استخدام هذه المعلمات مشيه لقياس حركات البصر من مفاصل الورك والركبة والكاحل في ع. يمكن استخدام هذه التقنيات لتحسين فهم آليات المرض وتحديد علاج محتمل لمرض التصلب العصبي المتعدد واضطرابات الأعصاب الأخرى التي تعوق التنقل.
Introduction
مشيه عبارة عن سلسلة من الحركات المتكررة للأطراف المستخدمة لتحقيق الحركة. مشيه يتكون من دورات الخطوة التي تنقسم إلى مرحلتين: المرحلة موقفا، وعندما تتحرك القدم إلى الوراء على الأرض لدفع يرسل الجسم؛ وفي مرحلة سوينغ، حيث القدم الخروج الأرض وتتحرك إلى الأمام. اضطرابات مشيه سمات مميزة للعديد من اضطرابات الأعصاب، مثل إصابات النخاع الشوكي (علوم) والتصلب المتعدد (MS)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض)، ومرض باركنسون (PD) والسكتة الدماغية؛ نماذج القوارض الإكلينيكية لهذه الاضطرابات غالباً الخص بهم العاهات مشيه كل منها1. وكانت آليات المراقبة الأساسية للحركة في الفئران دراسة مكثفة2،3. بالإضافة إلى ذلك، هناك نماذج الماوس للعديد من الاضطرابات العصبية البشرية4. ولذلك هو تحليل مشيه في الفئران نهج جذابة لقياس جوانب متعددة من العجز الحركي التي يعرف يرتبط التشريحية. دراسة مشيه في نماذج الفأر قد ثاقبة لاثيل قواعد العجز الحركي في اضطرابات الأعصاب، وتمكين تحديد العلاجات المحتملة.
وتشمل بعض التقنيات التي استخدمت لقياس مشيه في القوارض التفتيش البصري (مثلاً، باسو الماوس مقياس5 وفتح مجال الاختبار6) وتحليل مشيه من الطائرة البطني7. في الآونة الأخيرة، أساليب لقياس الكينماتيكا السهمي الطائرة حركات اللكتات اكتسبت شعبية نظراً لأنها توفر مزيد من المعلومات حول تنفيذ الحركة، وهي بالتالي أكثر حساسية للتغييرات الطفيفة في مشيه8، 9 , 10 , 11-التقنيات الحركية المتقدمة لدراسة حركة اللكتات في الطائرة السهمي بينما كان يسير في حلقة مفرغة9،12 وقد درست على نطاق واسع في سياق الخيال، المرض، الإصابات الرضية القشرية، والسكتة الدماغية، و مرض هنتنغتون8،9،10،11،،من1314،،من1516. وفي المقابل، شهدت هذه التقنيات استخدام محدود في دراسة حالات العجز الحركي لنماذج الماوس من التصلب المتعدد17.
النخاع الذاتية التجريبية (إي) هو النموذج الأكثر استخداماً الماوس من مرض التصلب العصبي المتعدد18. طريقتين الرئيسي لتحريض ع عن طريق التطعيم الإيجابي أو السلبي. وفي EAE نشطة، يتم تحصين الفئران مع المستضدات المايلين وتسبب neuroinflammation تي الخلية بوساطة أوتورياكتيفي وديميليناتيون في الحبل الشوكي والمخيخ. من ناحية أخرى، هو فعل EAE السلبي، نقل الخلايا أوتورياكتيفي تي من ماوس مع EAE النشطة ل ماوس السذاجة19. كما هو موضح في مكان آخر، سير المرض وأمراض الأعصاب تتأثر مستضد الجهاز العصبي المركزي (CNS) وضغط الماوس20،21،،من2223،24 ،25. في التجارب إي، وهي حقن الفئران التحكم الكامل فروند الشعبية adjuvant (CFA) دون مستضد المايلين. EAE تتميز بترتيب تصاعدي الشلل الذي يبدأ مع ضعف الذيل، ويمكن أن تنطوي على الأمامية، أسفر عن ترنح والشلل الذي أصاب20. نحن اتسمت مؤخرا تغييرات مشيه في الفئران C57Bl/6 تعرض لبروتين سكري oligodendrocyte المايلين 35-55 (35-55من موج)-التي يسببها ع. وقد أظهرت هذه الدراسات تحليل مشيه أن تكون متفوقة من التحليل السلوكي الكلاسيكي للانحرافات عن حركة الكاحل طبيعية عالية ترتبط بدرجة فقدان هذه المسألة الأبيض في الحبل الشوكي القطني من الفئران ع26. على النقيض من ذلك، قوة العلاقة بين فقدان هذه المسألة الأبيض واثنين الأخرى السلوكية التدابير التقليدية (التهديف السريرية وروتارود) كان أضعف بكثير26.
يصف لنا هنا في استخدام تحليل مشيه الحركية للكشف عن العجز في الحركة في الطائرة السهمي من الفئران ع المشي في حلقة مفرغة. وضعت خمس علامات عاكسة اللكتات تحديد حركة الورك والركبة، والمفاصل الكاحل في تسجيلات الفيديو عالية السرعة. برمجيات تحليل الحركة استخدمت لاستخراج البيانات الحركية عن الرحلات المشتركة. وتناقش جدوى هذه التقنيات لقياس العجز حركة لنموذج35-55 موج EAE. هذه التقنيات تنطبق أيضا على دراسة العجز مشيه في نماذج أخرى الماوس من اضطرابات الأعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول وفقا "المجلس الكندي" المبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان"، ووافقت عليه "لجنة جامعة دالهوزي" على "الحيوانات المختبرية".
1-"بناء علامات عاكسة":
- استخدام لكمه ثقب اليد، لكمه العدد المطلوب من دوائر صغيرة من ورقة العاكسة. ويتطلب كل الحيوانات 5 علامات لتسجيل واحد؛ اثنان كبيرة وثلاث علامات صغيرة.
- باستخدام مقص جيد، جعل قطع مستقيمة تمتد من المحيط إلى مركز الدائرة.
- إزالة ورق النسخ علامة لتكشف عن السطح اللاصقة. استخدام الملقط غرامة، قبضة العلامة بحزم وحليقة أنه في المعني نفسه باستخدام أصبعك لتشكيل شكل مخروط. لجعل علامة صغيرة، كورل المخروط محكم. لجعل علامة كبيرة، كورل المخروط فضفاضة.
- باستخدام مسدس غراء باليد، ملء داخل علامة على شكل مخروط مع الغراء بينما تجتاح غيض المخروط مع الملقط وتتقيد العلامة على قطعة مسطحة من الورق المقوى. سيتم منع الغراء العلامة من الانهيار والانحناء أثناء التسجيل لضمان انعكاس الأمثل للضوء. عندما يكون الغراء الجاف (حوالي 10 دقائق)، وإزالة العلامة من الورق المقوى مع مشرط ( الشكل 1A).
2. إعداد الحيوان لتسجيل
- أنيسثيتيزي الماوس مع الغاز إيسوفلوراني (2.5%؛ 2 لتر في الدقيقة س 2) بوضع الماوس إلى دائرة التعريفي. مرة واحدة الماوس فاقد الوعي، وضعه في مخروط الآنف تم وضعه فوق مياه تعمل تدفئة بطانية. وغرض أنيسثيتيزيشن إلى شل الماوس لوضع علامة؛ الإجراء غير مؤلم. ولذلك، عمق التخدير لا تحتاج إلى تقييم-
- تطبيق مواد تشحيم عين الموضعية لكلتا العينين.
- يحلق اللكتات المطلوب استخدام كليبرز الكهربائية. تبدأ في الكاحل ويشمل العمود الفقري وأسفل الأضلاع؛ التأكد من ترك لا الفراء كهذا من شأنه أن يقلل التصاق علامة.
ملاحظة: هنا، اللكتات حق تم تسجيلها؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أما اللكتات. - باستخدام علامة دائمة، تشير إلى الموقع في الحرقفي والورك. الحرقفي الموجود أسفل الجزء السفلي من الأضلاع وهو محسوس بسهولة بالجمع بين الركبتين تحت الماوس ' الجسم s.
ملاحظة: يمكن الاطلاع على الورك بالثناء وتمديد الساق للعثور على نقطة الترابط بين الحوض وعظم الفخذ. - استخدام الملقط غرامة، فهم أشار نهاية علامة صغيرة وتراجع القاعدة في الغراء لاصق سريع المفعول أو بديل مكافئ. ضع العلامة على غيض الرقم الرابع وعقد في مكان ل s 2-3 للسماح بالغراء لتجف. ضع العلمين الصغيرة الأخرى في الكاحل والمشترك ميتاتارسوفالانجيل بنفس الطريقة ( الشكل 1B).
- وضع علامات كبيرة على الحرقفي والورك ( الشكل 1B) بنفس الطريقة كعلامات صغيرة. إزالة الماوس من مخروط الآنف
- ونقل على الفور إلى غرفة تسجيل استخدام قفص نقل. ضع الماوس في حلقة مفرغة ثابتة والسماح للانتعاش الكامل من التخدير.
3. مشيه تسجيل
- السابقة لتسجيل الماوس ' s مشيه، تتخذ صورة كتلة المعايرة مع الأبعاد المعروفة في حلقة مفرغة.
ملاحظة: هذا سوف يسمح بكسل في الفيديو لتحويلها إلى قياسات حقيقية. وينبغي وضع الكاميرا حوالي 120 سم من حلقة مفرغة.- وضع الكاميرا في نفس الارتفاع ومستوى كحلقة مفرغة. المحافظة على نفس الموقف الكاميرا للتسجيلات بعد الصورة المعايرة.
- مرة واحدة الماوس تعافي تماما من التخدير، تشغيل المطحنة إلى سرعة منخفضة (5 سم/ثانية) للسماح للماوس يبدأ المشي. التأكد من أن اتجاه حزام المطحنة أن تواجه علامات على الماوس صوب الكاميرا.
- زيادة المطحنة السرعة تدريجيا تصل إلى 20 سم/ثانية؛ وهذا هو سرعة مثالية لمشية متسقة في الفئران صحية أكثر.
ملاحظة: على الرغم من أنها مثالية لجميع الفئران يسير بنفس السرعة، بعض قد تكون غير قادر على استمرار الوصول إلى هذه السرعة. تقليل السرعة عند الاقتضاء- إذا كان الماوس غير قادر على المشي في 20 سم/ثانية، ومن المؤكد أن تقديم مذكرة من هذا. الحد من سرعة المطحنة حتى تتحقق دورات خطوة متسقة.
ملاحظة: يمكن ضبط تحليل البيانات الأحدث للاختلافات في سرعة.
- إذا كان الماوس غير قادر على المشي في 20 سم/ثانية، ومن المؤكد أن تقديم مذكرة من هذا. الحد من سرعة المطحنة حتى تتحقق دورات خطوة متسقة.
- بدء تسجيل الفيديو وبمجرد الماوس هو المشي في اطراد (أي، يسير بوتيرة متسقة، لا تربية أو النسيج جنبا إلى جنب). يستمر التسجيل حتى سجلت دورات متتالية الخطوة 8 إلى 12. لكل فيديو، تسجيل سرعة المطحنة وجانب الماوس المسجلة.
- بمجرد اكتمال التسجيل، إيقاف تشغيل المطحنة والعودة الماوس إلى قفصة. تنظيف مطحنة دقيق بين التسجيلات الروائح التي خلفتها وراءها الفئران الأخرى قد يغير سلوك الفئران واردة. للحد من التوتر والأضرار بالبشرة، لا تقم بإزالة العلامات؛ السماح للفئران لإزالتها بمفردها.
4. تحليل
- العملية الفيديو باستخدام برمجيات تحليل الحركة.
ملاحظة: في تجاربنا، ونحن استخدام البرامج النصية المخصصة المصممة للبرامج الإحصائية والتصوير (انظر الجدول للمواد) التي كتبها الدكتور نيكولاس ستيفاني. يتم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام برمجيات تحليل الحركة المحددة.- استخراج إحداثيات البكسل من العلامات من أشرطة الفيديو، واستخدام الفيديو المعايرة، تحويل قيم بكسل إلى سنتيمترات وحساب الزوايا المشتركة في كل إطار.
- تحديد بداية ونهاية كل دورة خطوة، وبالتالي الحصول على معلومات حول الخطوة المدة وطول-
- تطبيع الخطوة مدة دورة إلى 200 إطارات طبيعية، مثل أن سوينغ وموقف تتمثل بإطارات 100، على التوالي.
- باستخدام إطارات تم تسويتها، حساب معلمات الحركية لتحليل البيانات باستخدام برنامج جداول البيانات (انظر الجدول للمواد).
- لإنشاء زاوية متوسط مشترك معين، واتخاذ المتوسط من جميع الزوايا في إطار تطبيع ك:
ملاحظة: هنا يمثل x قيمة زاوية في نظراً لطبيعية الإطار، و n تمثل عدد الإطار تم تسويتها. - لإنشاء نطاق الحركة مشترك خاص لماوس معينة، طرح الزاوية أصغر من زاوية أكبر في مجموعة من الأطر الموحدة على النحو التالي:
مجموعة من الحركة = الزاوية القصوى-زاوية الحد الأدنى.
ملاحظة: هنا زاوية الحد الأقصى وهي زاوية الحد الأدنى زوايا أكبر وأصغر تحقيقها ضمن دورة خطوة طبيعية، على التوالي. - على إنشاء الفرق RMS، وطرح أولاً متوسط زاوية كل نقطة الوقت التجريبي من تسجيل خط الأساس. بعد ذلك، ساحة كل الفرق، وأخذ متوسط قيم جميع التربيعية والجذر التربيعي يعني. المعادلة كالتالي:
ملاحظة: هنا
يمثل زاوية متوسط من خط الأساس تسجيل؛ y تمثل زاوية متوسط من كل وقت نقطة تجريبية؛ n، ويمثل عدد الإطارات تم تسويتها. يعني الجذر التربيعي (RMS) الفرق قياس يستخدم لتقييم الانحراف في مشيه من تسجيلات الأساس.
- لإنشاء زاوية متوسط مشترك معين، واتخاذ المتوسط من جميع الزوايا في إطار تطبيع ك:
- استخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية لتحليل وعرض البيانات (انظر الجدول للمواد)-
يمثل زاوية متوسط من خط الأساس تسجيل؛ y تمثل زاوية متوسط من كل وقت نقطة تجريبية؛ n، ويمثل عدد الإطارات تم تسويتها. يعني الجذر التربيعي (RMS) الفرق قياس يستخدم لتقييم الانحراف في مشيه من تسجيلات الأساس.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمثل الشكل 1 تمثيل تخطيطي للإجراءات المستخدمة لتحليل مشيه الحركية. أولاً، تعكس علامات مصنوعة ووضعها على ماوس عند 5 نقاط تشريحية. ثم يتم تسجيل مشيه بينما الماوس يسير في حلقة مفرغة. الحركة تحليل البرمجيات المستخدمة لاستخراج البيانات الحركية للتحليل اللاحق.
الشكل 2 ألف -C تمثل دورة الخطوة ماوس فرنكات الجماعة المالية الأفريقية مراقبة الزوايا المشتركة الورك والركبة والكاحل سجلت في ثلاث دورات متتالية تسجيل متباعدة أسبوع واحد عن بعضها البعض. ويظهر التداخل بين الطول الموجي الانحراف الحد الأدنى في خطوة دورات من دورات 1-3. الشكل 2D -و يمثل دورة الخطوة الثانية التحكم الماوس فرنكات الجماعة المالية الأفريقية التي عرضها تقلب المشي أكبر من تسجيل الدورات 1-3. على الرغم من أن يتم إزاحة دورات خطوة على طول المحور الصادي، يبقى الشكل من الطول الموجي متسقة بين التسجيلات. هذا المستوى من تقلب نموذجي للمشي الماوس.
الشكل 3 ألف -ج تمثل دورة خطوة بالماوس مع EAE المسجلة في ثلاث دورات متتالية من التسجيل. وهناك تغيرات طفيفة في مشيه من الأولى إلى الدورة الثانية للتسجيل، ولكن قبل الدورة الثالثة، مشيه تم تغيير عميق المفاصل الثلاثة. الورك، حدث تسطيح كبيرة على مدى دورة خطوة، مما يشير إلى حدوث خسارة كبيرة للحركة. وقد أصبح الركبة الوزن القرفصاء أكثر وأقل قدرة على تقديم الدعم والمساندة جسم الحيوان. تم تغيير الحركات في الكاحل أيضا بشكل كبير. يتم تأخير عطف ظهري سيرا على الأقدام والانحناء أخمصي خلال مرحلتي الموقف (الفريق الأخضر)، والبديل (الفريق الأبيض) على التوالي. هذه العجوزات، يدل على ضعف العضلات في هذا المشترك كما هو ضعف الحيوان في قدرتها على رفع القدم به خلال مرحلة سوينغ، ودفع الجسم إلى الأمام أثناء مرحلة الموقف.
تم نشر البيانات التالية المعروضة في الشكل 4 من فيندر et al. (2017) 26 مع الإذن. حللت البيانات باستخدام التدابير المتكررة أحادي الاتجاه ANOVA مع هولم-صداق اختبار المقارنات المتعددة لمقارنة جميع النقاط الزمنية لخط الأساس26. وحسبت النطاق (4A الشكل و الشكل 4)، زاوية متوسط الحركة (الشكل 4 باء و 4E الشكل) والفرق RMS (الشكل 4 و الشكل 4F) في كل مرة نقطة التحديد الكمي لمشية العجز (n = 8 كل مجموعة). في هذه التجربة ع، كان ظهور علامات سريرية 14 نقطة في البوصة، وبعد الأسبوع الثاني من التسجيل. فرنك الفئران أظهرت أي تغيير في زاوية الركبة متوسط (الشكل 4A) أو الركبة RMS الفرق (الشكل 4)، ولكن المعرض زيادة صغيرة في الركبة نطاق الحركة [F(2,7) = 5.871، ف = 0.0083] في 16 نقطة في البوصة و 30 بالنسبة لخط الأساس ( الشكل 4). وقد يعكس هذا التغيير الصغيرة الألم الناجم عن حقن فرنكات الجماعة المالية الأفريقية. وعلى النقيض من الحيوانات فرنكات الجماعة المالية الأفريقية، وكانت هناك تغييرات كبيرة في الركبة المشتركة للحيوانات ع لزاوية متوسط [F(6,7) = 11.08، ف < 0.0001] (الشكل 4)، مجموعة من الحركة [F(6,7) = 14.42، ف < 0.0001] (4E الشكل) وجمهورية مالوكو الجنوبية الفرق (4F الشكل). زاوية متوسط انخفضت انخفاضا كبيرا، مما يشير إلى أن الفئران ع ركبهم استعرضوا أكثر أثناء المشي. قد يكون هذا يدل على ضعف العضلات، كما كانت الحيوانات غير قادر على توسيع المفاصل الركبة لدعم وزن الجسم. كما انخفض نطاق الحركة، عرضه مرة أخرى بسبب عدم قدرة الحيوانات على تمديد الركبة. الزيادة الكبيرة في الركبة الفرق RMS يشير إلى أن تحركات الركبة في الفئران ع كانت تختلف اختلافاً جوهريا عن تسجيلها خط الأساس.
تم تحليل البيانات في الشكل 5 استخدام تدابير أحادية الاتجاه المتكررة ANOVA مع هولم-صداق اختبار المقارنات المتعددة مقارنة قيم المعلمة مشيه في عشرات السريرية من 0.5-3.5 إلى تلك التي تم اكتشافها في نقاط سريرية من 0. كما أجرى تحليل علائقية باستخدام سبيرمان رو (ρ). زاوية الركبة متوسط (الشكل 5A)، مجموعة من الحركة (الشكل 5 (ب))، والفرق RMS (الشكل 5) كانت ارتباطاً وثيقا مع عشرات السريرية (ف < 0.001). هذه العلاقات المتبادلة بين الحركات المشتركة وسجل السريرية الكلاسيكية إثبات صحة تحليل مشيه الحركية لتقييم العجز الحركي للفئران ع. مجموعة الركبة من الحركة (الشكل 5A) والفرق RMS (الشكل 5) قد تناقص بصورة كبيرة بدءاً من نقاط سريرية من 2.0 (ف< 0.05). وتوحي هذه النتائج أن حركات الركبة البصر لا تساهم في العجز الحركي الكشف عنها بواسطة علامات سريرية أقل من 2.0. ومع ذلك، انخفض بزاوية الركبة متوسط (الشكل 5B) بدءاً من نقاط سريرية من 1.0 (ف< 0.05). هذا يوحي بأن زاوية متوسط لحركة الركبة، وهي الأكثر حساسية للتدابير الثلاثة.
الشكل 1 : التخطيطي للحركية مشيه تسجيل مع الفئران. مجرد علامات عاكسة، يتم وضعها على الحرقفي والورك والكاحل، ميتاتارسوفالانجيل المشتركة وغيض من الرقم الرابع. مشيه يتم تسجيلها بكاميرا عالية السرعة بينما الماوس يسير في حلقة مفرغة. الحركة تحليل البرمجيات المستخدمة لاستخراج المعلمات مشيه للتحليل اللاحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مثال للموجي خطوة بدوره في مراقبة اثنين من الفئران التي تلقت فرنكات الجماعة المالية الأفريقية
خلفيات بيضاء وخضراء تمثل مرحلة سوينغ وموقف، على التوالي. للماوس 1، الورك (A) والركبة (ب)، والطول الموجي دورة خطوة الكاحل (ج) تتداخل مع بعضها البعض عبر 3 دورات متتالية تسجيل متباعدة أسبوع واحد عن بعضها البعض. للماوس 2، الورك (د) والركبة (E)، والخطوة الكاحل (F) دورة الطول الموجي انحرفت قليلاً من بعضها البعض بسبب التغير المتأصلة في المشي السلوك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الطول الموجي دورة خطوة في الفئران مع ع. خلفيات بيضاء وخضراء تمثل مرحلة سوينغ وموقف، على التوالي، لثلاث دورات متتالية تسجيل متباعدة وبصرف النظر في أسبوع. الدورةالثالثة تسجيل 3، الورك (A) والركبة (ب)، والكاحل يتم تغيير الطول الموجي (ج) إلى حد كبير بسبب تطور المرض ع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تستخدم زاوية متوسط، مجموعة من الحركة، ويعني الجذر التربيع لتحليل البيانات الحركية- وحسبت متوسط زاوية، مجموعة من الحركة، والاختلافات RMS لقياس العجز الحركي في الفئران إي. زاوية الركبة متوسط (A)، مجموعة من الحركة (ب)، وجمهورية مالوكو الجنوبية (ج) للفئران فرنكات الجماعة المالية الأفريقية ظلت ثابتة نسبيا. وأظهرت الفئران مع EAE زاوية الركبة ضعف متوسط (د)، مجموعة من الحركة (E)، وجمهورية مالوكو الجنوبية (F). يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± الانحراف المعياري؛ ف< 0.05، * * ف< 0.01، * * * ف< 0.001، والفرق من يوم وظيفة التحصين (DPI)-2؛ ف # < 0.05، والفرق من عجز بلغ الذروة. طبع من مرجع 26 بإذن من الناشرين الأصلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . زاوية الركبة متوسط، مجموعة من الحركة والفرق RMS ترتبط بنقاط سريرية
وأجرى تحليل الارتباط بين ثلاثة تدابير الحركية لحركات الركبة وعشرات السريرية للمقارنة بين هاتين الطريقتين. زاوية الركبة متوسط (A)، مجموعة من الحركة (ب)، وجمهورية مالوكو الجنوبية الفرق (ج) كانت ارتباطاً وثيقا بالنتائج السريرية. مجموعة الركبة من الحركة والفرق جمهورية مالوكو الجنوبية انخفضت بدءاً من نقاط سريرية من 2.0، بينما تم تخفيض زاوية الركبة متوسط في وقت سابق إلى نقاط سريرية من 1.0. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± الانحراف المعياري؛ ف< نقاط الفرق 0.05 من السريرية 0.0. سبيرمان رو (ρ)، * * * ف< 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الفئران مع ع، هي التهديف السريرية الطريقتين الأكثر شيوعاً لقياس العجز الحركي وتقع الكمون من27،روتارود28. هذه التقنيات على قيود عدة. سجل السريرية محدودة على الرغم من ملاءمة والمستخدمة على نطاق واسع، التي تسفر عن بيانات المستوى الترتيبي فقط، مما يعني أن حجم الخلافات بين عشرات السريرية غير معروفة. التهديف السريرية تعاني أيضا من كونه غير قادر على توفير معلومات دقيقة عن الطبيعة العجز الحركي. اختبار روتارود يحسن على بعض القيود للتهديف السريرية، ولكن فقط تدابير التنسيق الحركي العام ولا يقيس جوانب محددة من المشي.
وعلى سبيل المقارنة، يوفر تحليل مشيه الحركية تدابير تراعي حول جوانب محددة من الحركة، بما في ذلك مجموعة زوايا الحركة والمتوسط في مختلف مفاصل. وقد اكتشفت العجز خفية في تحركات مشتركة في الورك والركبة لموج35-55 EAE الفئران في DPI9، 5-9 أيام تقريبا قبل ظهور الأعراض السريرية أو العجز روتارود26. هذه العجوزات استمرت رغم مغفرة كاملة لعلامات سريرية، ولوحظت في غياب العجز روتارود26. الأهم من ذلك، ضعف حركة الكاحل كما تقاس بالفرق RMS ارتباطاً جيدا للغاية مع فقدان الموضوع الأبيض في الحبل الشوكي26.
النقاط المنهجية عدة تستحق إشارة خاصة: 1) موضع دقيقة ومتسقة من علامات مشتركة حاسمة--يجب تحديد الورك والحرقفي بعناية بخفقان؛ 2) من الضروري الحصول على تسجيلات من دورات الخطوة 8-12. حساب متوسط هذه الدورات خطوة تنتج دورة خطوة متوسط تمثيلية التي يمكن مواصلة تحليلها؛ 3) يجب أن تنشأ ظروف الإضاءة الأمثل التأكد من وجود العلامات واضحة للعيان في التسجيلات. إذا لم يتم مضيئة علامات بشكل صحيح، هذا يمكن أن يجعل رقمنة أشرطة الفيديو عملية شاقة كما العديد من برامج تحليل الحركة لن تتمكن من تعقب العلامات، مما يستلزم تتبع الخط.
قيد إضافي واحد لهذه التقنية أنها كثيفة العمالة. على سبيل المثال، لتسجيل وتحليل البيانات من مجموعة من الفئران 10، فإننا نقدر تستغرق العملية الإجمالية حوالي ساعة 7.0-9.0 (ح). مما يجعل علامات 50 (5 للماوس) يأخذ حوالي 2.0 h. يمكن أن يتم تسجيل الماوس يمشي السلوك أما وحدها أو بزوج. تعمل وحدها، يستغرق حوالي 25 دقيقة لكل الماوس، بينما تعمل في زوج يستغرق حوالي 10 دقيقة لكل الماوس; ولذلك، تسجيل 10 الفئران قد يستغرق من 1.5 ح (الزوج) إلى ح 4.0 (سولو). وأخيراً، تحليل البيانات والرسوم البيانية تأخذ حوالي 3.5 ح. على الرغم من أن هذا الأسلوب هو العمل المكثف، ونرى أن رؤى المحتملة في آليات المرض التي يقدمها تحليل مشيه الحركية يبرر هذا الاستثمار. قد يرتبط السلوكية الجيدة لعلم الأمراض مرض مفيد كما يمكن أخذ القياسات المسلسل من الفأر يعيش غير إينفاسيفيلي. نظراً لارتباط الكمال القريب بين الكينماتيكا الكاحل والحبل الشوكي القطني الأبيض مسألة فقدان26، يجوز استخدام هذا الأسلوب للتأكد من التشكيل الجانبي الزمانية ديمييلينيشن وريميلينيشن في الفئران ع على مدى التجربة، مما يسمح الاسترداد تقييمها.
تحليل مشيه معقد بالشلل الحاد الذي يقيد حركة هيندليمبس. ومع ذلك، حتى شدة الشلل الفئران (نقاط سريرية > 3.0) غالباً ما تكون قادرة على أمبولاتي إلى حد ما. وفي هذه الحالات، واﻷمامية تستخدم لسحب الحيوان إلى الأمام، ويحدث بعض الحركة اللكتات الذي يمكن أن يقاس بتحليل مشيه الحركية. حتى في هذه الحالات الشديدة، لا يزال من الممكن قياس استعادة وظيفة اللكتات على مر الزمن. إلا في الحالات الشديدة جداً (20% حيوانات مع النتائج السريرية > 3.5 في ذروة المرض، 16-23 نقطة في البوصة) كانت أننا غير قادر على الحصول على تسجيلات مفيدة للحركة اللكتات. ومع ذلك، استعادة هذه الحيوانات عادة بعض الدالة اللكتات من 30 نقطة في البوصة، السماح للتسجيلات ذات مغزى الحصول عليها في ذلك الوقت.
تطبيق هذا الأسلوب مستقبلا هو اقتران البيانات الحركية مع تسجيلات اليكتروميوجرافيك المتزامن اللكتات أثناء الحركة. هذا الأسلوب قد أنجز في نماذج الماوس من المرض والخيال ويمكن استخدامها لتوضيح العلاقة بين نشاط العضلات وتعصيب ومشية. هذا الأسلوب يمكن أيضا أن يقترن أكثر استهدفت نماذج من مرض التصلب العصبي المتعدد وديمييلينيشن التي قد تنتج أكثر مشيه منفصلة العجز، بما في ذلك نماذج ع التنسيق29،30 أو ديمييلينيشن التي يسببها كوبريزوني31.
يمكن أيضا تطبيق التقنيات التي وصفناها لقياس الحركات المشتركة في الفئران ع إلى اضطرابات أخرى تضر بمشية. وأبلغ تغييرات متميزة في مشيه لنماذج الماوس PD والخيال، والمرض، والسكتة الدماغية8،،من910،11،،من1314. على سبيل المثال، نماذج القوارض من PD تتميز بطول برايد المخفضة والسرعة، أسفر عن وتيرة مرتفعة للمحافظة على سرعة المشي32. ولذلك يوفر تحليل مشيه الحركية القوية أدوات السلوكية لتوضيح آليات المرض وتحديد العلاج المحتملة باستخدام هذه النماذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم أي شيء كشف.
Acknowledgments
نود أن نعترف شدراوي Sid لمساعدته التقنية مع التصوير. وكان هذا العمل مدعومة بتمويل من جمعية مرض التصلب العصبي المتعدد من كندا (EGID 2983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
