Summary
Kinematische ganganalyse in het sagittale vlak levert zeer nauwkeurige informatie over hoe verkeer wordt uitgevoerd. We beschrijven de toepassing van deze technieken te identificeren gait tekorten voor muizen onderworpen aan auto-immuun-gemedieerde demyelinisatie. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om te karakteriseren gait tekorten voor andere Muismodellen met verminderde motoriek.
Abstract
Kinematische ganganalyse in het sagittale vlak is vaak gebruikt voor het karakteriseren van motorische tekorten bij multiple sclerose (MS). We beschrijven de toepassing van deze technieken te identificeren gait tekorten in een muismodel van MS, bekend als experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE). Verlamming en motor tekorten in muizen onderworpen aan EAE meestal geschat aan de hand van een klinische scoren schaal. Deze schaal geeft echter alleen ordinale dat de gegevens weinig informatie over de precieze aard van de motorische tekorten verschaft. EAE ziekte ernst is ook beoordeeld door rotarod prestaties, waarmee een maatregel van algemene motorische coördinatie. Kinematische ganganalyse van de hind-limb in het sagittale vlak genereert daarentegen zeer nauwkeurige informatie over hoe beweging geschaad is. Voor het uitvoeren van deze procedure, zijn reflecterende markeringen geplaatst op een hind-limb gezamenlijke beweging detecteren terwijl een muis is lopen op een loopband. De software van de analyse van de beweging wordt gebruikt voor het meten van de beweging van de markers tijdens het wandelen. Kinematische gait parameters zijn vervolgens afgeleid van de resulterende gegevens. Laten we zien hoe deze gait parameters te kwantificeren verminderde bewegingen van de gewrichten van het heup-, knie- en enkel in EAE kunnen worden gebruikt. Deze technieken kunnen worden gebruikt om beter te begrijpen van de ziekte mechanismen en identificeren van potentiële behandelingen voor MS en andere neurodegeneratieve aandoeningen die afbreuk doen aan de mobiliteit.
Introduction
Gait is een serie van repetitieve bewegingen van de ledematen gebruikt om de motoriek. Gait bestaat uit stap cycli, die zijn verdeeld in twee fasen: de fase van de houding, die is wanneer de voet naar achteren op de grond beweegt voor het voortbewegen van het lichaam naar voren; en de fase van de schommel, waar de voet uit de grond en bewegende vooruit is. Gait storingen zijn waarmerk kenmerken van vele neurodegeneratieve aandoeningen, zoals dwarslaesie (SCI), multiple sclerose (MS), Amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Parkinson (PD) en lijn; preklinische knaagdier modellen van deze aandoeningen recapituleren vaak hun respectieve gait waardeverminderingen1. De fundamentele controlemechanismen van voortbewegen in muizen zijn intensief bestudeerde2,3. Daarnaast zijn er Muismodellen van vele menselijke neurologische aandoeningen4. Ganganalyse in muizen is dan ook een aantrekkelijke aanpak voor het meten van meerdere aspecten van motorische tekorten die anatomische correlaten hebben gekend. De studie van gait in muismodellen kan inzicht verwerven in de neuropathologische grondslagen van motorische tekorten in neurodegeneratieve aandoeningen, en de identificatie van potentiële behandelingen inschakelen.
Sommige technieken die zijn gebruikt voor het meten van gait in knaagdieren omvatten visuele inspectie (bijvoorbeeld, de Basso muis schaal5 en open veld test6) en analyseren van de gang van de ventrale vliegtuig7. Meer recentelijk, methoden om te meten sagittale vlak kinematica van stuk bewegingen hebben opgedaan populariteit omdat ze meer informatie over de uitvoering van de beweging bieden en bijgevolg gevoeliger voor subtiele veranderingen in gang8, zijn 9 , 10 , 11. kinematische technieken ontwikkeld om te bestuderen stuk beweging in het sagittale vlak tijdens het lopen op een loopband9,12 zijn uitvoerig bestudeerd in het kader van SCI ALS, traumatische corticale letsels, beroerte, en De ziekte van Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Deze technieken hebben daarentegen beperkt gebruik in de studie van motorische tekorten voor Muismodellen van multiple sclerose17gezien.
Experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) is de meest gebruikte muismodel van MS18. De twee belangrijkste methoden van inducerende EAE is via actieve of passieve inoculatie. In actieve EAE, zijn muizen geïmmuniseerd met myeline antigenen, het veroorzaken van autoreactieve T cellen gemedieerde neuroinflammation en demyelinisatie in het ruggemerg en de kleine hersenen. Passieve EAE, aan de andere kant, is veroorzaakt door overdracht van autoreactieve T cellen van een muis met actieve EAE naar een naïeve muis19. Zoals elders beschreven, het verloop van de ziekte en de Neuropathologie worden beïnvloed door het centrale zenuwstelsel (CNS) antigeen en muis stam20,21,22,23,24 ,25. Controle muizen worden EAE experimenten geïnjecteerd met compleet Freund van adjuvans (CFA) zonder de myeline-antigeen. EAE wordt gekenmerkt door de oplopende verlamming die begint met staart zwakte en kan potentieel betrekking hebben op de voorpoten, wat resulteert in ataxie en verlamming20. We hebben onlangs gekenmerkt gait veranderingen in C57Bl/6 muizen onderworpen aan myeline Oligodendrocyt glycoproteïne 35-55 (MOG35-55)-geïnduceerde EAE. Deze studies hebben aangetoond ganganalyse te zijn superieur dan klassieke gedragsanalyse omdat afwijkingen van de normale enkel verkeer zijn sterk gecorreleerd met de mate van verlies van de witte stof in de lumbale ruggemerg van EAE muizen26. De sterkte van de correlatie tussen witte massa verlies en twee andere maatregelen op de traditionele gedrags (klinische scoren en rotarod) was daarentegen veel zwakkere26.
We beschrijven hier het gebruik van kinematische ganganalyse te detecteren verkeer tekorten in het sagittale vlak van EAE muizen lopen op een loopband. Vijf reflecterende markeringen werden geplaatst op een stuk te identificeren van verkeer van de heup-, knie- en enkel gewrichten in high-speed video-opnamen. De software van de analyse van de beweging werd gebruikt om kinematische gegevens over gezamenlijke excursies te extraheren. Het nut van deze technieken te kwantificeren verkeer tekorten voor het model35-55 MOG van EAE worden besproken. Deze technieken zijn ook van toepassing op de studie van gait tekorten in andere Muismodellen van neurodegeneratieve aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dit protocol is volgens de Canadese Raad betreffende richtsnoeren Animal Care en werd goedgekeurd door het Comité van Dalhousie University op laboratoriumdieren.
1. bouwen reflecterende Markeringen:
- met behulp van een hand-held perforator, het gewenste aantal kleine cirkels van een vel reflecterende papier punch. Elk dier moet 5 markeringen voor een enkele opname; twee grote en drie kleine markeringen.
- Met fijne schaar, een rechte snede uitbreiding van de omtrek naar het midden van de cirkel maken.
- Verwijder het papier steun van de markering te onthullen het zelfklevende oppervlak. Met behulp van fijne pincet, greep de markering stevig en krullen in zichzelf met behulp van uw vinger naar de vorm van een kegel. Om een kleine marker, krullen de cone strak. Als u wilt een grote marker, krullen de cone losjes.
- Met behulp van een hand-held lijmpistool, vul de binnenkant van de kegel-vormig markering met lijm terwijl het puntje van de kegel met een tang aangrijpend en houden van de horizontale liniaal naar een vlak stuk karton. De lijm wordt voorkomen dat de markering van instorten en buigen tijdens opname om te zorgen voor optimale weerkaatsing van het licht. Wanneer is de lijm drogen (ongeveer 10 min), de markering verwijderen uit het karton met een scalpel ( figuur 1A).
2. Het dier voorbereiden op opname
- verdoving de muis met Isofluraan gas (2.5%; 2 liter/min O 2) door het plaatsen van de muis in de kamer van een inductie. Zodra de muis bewusteloos is, plaats u het in een neus kegel die op een recirculatie water Verwarming Deken is geplaatst. Het doel van afstomping is te immobiliseren van de muis voor de plaatsing van de markering; de procedure is niet pijnlijk. Diepte van anesthesie hoeft daarom niet te worden beoordeeld.
- Een actuele oog smeermiddel van toepassing op beide ogen.
- Scheren de gewenste stuk met behulp van de elektrische tondeuse. Begin bij de enkel en uit te breiden tot de wervelkolom en de onderkant van de ribben; zorgen geen bont niet zoals dit marker hechting schaden zal.
Opmerking: Hier, de juiste stuk werd opgenomen; echter beide stuk inzetbaar. - Met behulp van een permanent marker, geven de locatie van de iliacale kuif en het heupgewricht. De iliacale kuif ligt net onder de onderkant van de ribben en is gemakkelijk voelbaar door het samenbrengen van de knieën onder de muis ' s lichaam.
Opmerking: Het heupgewricht kan worden gevonden door buigen en uitbreiding van het been om te zoeken naar het punt van de articulatie tussen het bekken en bovenbeen. - Met fijne pincet, pak het puntige einde van een kleine marker en dompel de base in snelwerkende lijm lijm, of een gelijkwaardig alternatief. Zet de aanwijzer op het puntje van het vierde cijfer ingedrukt in plaats voor 2-3 s tot de lijm droog is toegestaan. Plaats van de andere twee kleine markeringen op het metatarsofalangeale gewricht en enkel op dezelfde wijze ( figuur 1B).
- Plaats van grote markeringen op de iliacale kuif en het heupgewricht ( figuur 1B) op dezelfde wijze als de kleine markeringen.
- Verwijder de muis uit de neus en onmiddellijk overdracht aan de kamer van de opname met behulp van een kooi overdracht. Plaats de muis op de stationaire loopband en zorgen voor volledig herstel van anesthesie.
3. Opname Gait
- voorafgaande aan de opname van de muis ' s gang, neem een foto van een kalibratie-blok met bekende afmetingen op de loopband.
Opmerking: Hierdoor kunnen de pixels in de video wordt geconverteerd naar echte metingen. De camera moet ongeveer 120 cm vanaf de loopband worden geplaatst.- De camera op het niveau van dezelfde hoogte en positie als de loopband. Handhaven van dezelfde camerapositie voor de opnames na het beeld van de kalibratie.
- Zodra de muis is volledig hersteld van anesthesie, draai de loopband op een lage snelheid (5 cm/s) om te laten de muis beginnen lopen. Zorgen dat de loopband riem richting is zodanig dat de markeringen op de muis naar de camera zijn gerichte.
- Verhoging van de loopband snelheid geleidelijk tot 20 cm/s; dit is de ideale snelheid voor een consistente gait in meest gezonde muizen.
Opmerking: Hoewel het is ideaal om alle muizen lopen met dezelfde snelheid hebben, wellicht sommige niet consequent het bereiken van deze snelheid.- Als de muis niet kan lopen op 20 cm/s, verlaag de snelheid als dit nodig is en zorg ervoor dat u een nota van. Verlaag de snelheid van de loopband totdat consequente stap cycli worden bereikt.
Opmerking: De analyse van de gegevens van de latere kunt aanpassen voor verschillen in snelheden.
- Als de muis niet kan lopen op 20 cm/s, verlaag de snelheid als dit nodig is en zorg ervoor dat u een nota van. Verlaag de snelheid van de loopband totdat consequente stap cycli worden bereikt.
- Begin video opnames, zodra de muis gestaag loopt (d.w.z., wandelen in een consistente tempo, niet fokken of weven van links naar rechts). Blijven opnemen totdat 8 tot en met 12 opeenvolgende stap cycli zijn opgenomen. Voor elke video, record de snelheid van de loopband en de kant van de muis opgenomen.
- Als opname is voltooid, schakelt u de loopband en de muis terug naar haar kooi. Reinig de loopband grondig tussen opnamen zoals geuren achtergelaten door andere muizen van het gedrag van inkomende muizen veranderen kunnen. Om stress te verminderen en beschadiging van de huid, Verwijder niet de markers; toestaan dat de muizen om ze te verwijderen op hun eigen.
4. Analyse
- verwerken de video's met behulp van de software van de analyse van de motie.
Opmerking: In onze experimenten, gebruikten we aangepaste scripts ontworpen voor imaging en statistische software (Zie Tabel van materialen) die werden geschreven door Dr. Nicolas Stifani. De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van de software van de analyse van de geselecteerde beweging.- Haalt u de pixelcoördinaten van de markers van de video's en gebruikt de video kalibratie, transformeren de pixelwaarden in centimeters en berekenen van de gezamenlijke hoeken bij elk frame.
- Het begin en einde van elke cyclus van de stap, waardoor het verkrijgen van informatie over stap duur en lengte identificeren.
- De stap cyclus duur 200 genormaliseerde frames, zodanig dat swing en houding zijn vertegenwoordigd door 100 frames, respectievelijk normaliseren.
- Kinematische parameters voor data-analyse met behulp van spreadsheet-software met behulp van de genormaliseerde frames, berekenen (Zie Tabel van materialen).
- Te stellen de gemiddelde hoek van een bepaald gewricht, neem het gemiddelde van alle hoeken een genormaliseerde kader als:
Opmerking: hier x vertegenwoordigt de waarde van de hoek bij een gegeven genormaliseerde frame, en n vertegenwoordigt de genormaliseerde framenummer. - Om het bereik van de beweging van een bepaald gewricht voor een bepaalde muis, aftrekken de kleinste hoek tussen de grootste hoek in een set genormaliseerde frames als volgt:
Waaier van motie = hoek maximale - hoek minimale.
Opmerking: Hoek hier maximale en minimale hoek zijn de grootste en kleinste hoeken bereikt binnen de genormaliseerde stap cyclus, respectievelijk. - Om RMS verschil, aftrekken eerst de gemiddelde hoek van elk experimentele tijd-punt van de opname van de basislijn. Vervolgens vierkant van elk verschil, neem het gemiddelde van alle kwadraat waarden en het gemiddelde van de vierkantswortel. De vergelijking is als volgt:
Opmerking: hier
de gemiddelde hoek aangeeft vanaf de basislijn opnemen; y de gemiddelde hoek aangeeft vanaf elke experimentele tijd-punt; n en vertegenwoordigt het aantal genormaliseerde frames. Root mean kwadraat (RMS) verschil is een meting gebruikt ter beoordeling van de afwijking in gait van basislijnregistratie.
- Te stellen de gemiddelde hoek van een bepaald gewricht, neem het gemiddelde van alle hoeken een genormaliseerde kader als:
- Wetenschappelijke grafieken en statistieken software gebruiken om te analyseren en presenteren van de gegevens (Zie Tabel of Materials).
de gemiddelde hoek aangeeft vanaf de basislijn opnemen; y de gemiddelde hoek aangeeft vanaf elke experimentele tijd-punt; n en vertegenwoordigt het aantal genormaliseerde frames. Root mean kwadraat (RMS) verschil is een meting gebruikt ter beoordeling van de afwijking in gait van basislijnregistratie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 is een schematische voorstelling van de gebruikte voor kinematische ganganalyse procedure. Eerste, reflecterende markeringen zijn gemaakt en geplaatst op een muis op 5 anatomische punten. Gait is vervolgens opgenomen, terwijl de muis is lopen op een loopband. De software van de analyse van de beweging wordt gebruikt voor het uitpakken kinematische gegevens voor een latere anayse.
Figuur 2A -C vertegenwoordigen de cyclus van de stap van een controle CFA-muis voor de heup-, knie- en enkel gezamenlijke hoeken opgenomen in drie opeenvolgende opnamesessies regelafstand één week ertussen. De overlap tussen de golfvormen toont minimale afwijking in de cycli van de stap van sessies 1-3. Figuur 2D -F vertegenwoordigen de cyclus van de stap van een tweede controle CFA-muis die meer wandelen variabiliteit van opname sessies 1-3 weergegeven. Hoewel de stap cycli worden verschoven langs de y-as, blijft in de vorm van de golfvormen overeenstemming tussen de opnamen. Dit niveau van variabiliteit is typisch voor muis wandelen.
Figuur 3A -C vertegenwoordigen de cyclus van de stap van een muis met EAE opgenomen op drie opeenvolgende opnamesessies. Er zijn minimale wijzigingen in gang van de eerste naar de tweede opnamesessie, maar door de derde sessie, gait is ingrijpend veranderd op alle drie gewrichten. Voor de heup, heeft een aanzienlijke afvlakking gedurende de cyclus stap plaatsgevonden, met vermelding van een aanzienlijk verlies van beweging. De knie is meer gebogen en minder goed in staat uit te breiden en het dier lichaam ondersteunen gewicht geworden. Bewegingen in het enkelgewricht waren ook wezenlijk worden gewijzigd. Dorsaalflexie van de voet en plantaire flexie zijn vertraagd tijdens het swing (witte panel) en houding (groene panel) fasen, respectievelijk. Deze tekorten zijn indicatief van spierzwakte bij deze joint als het dier is geschaad in de mogelijkheid om zowel het verhogen van de voet tijdens de fase van de schommel en voortbewegen van het lichaam naar voren tijdens de fase van de houding.
De volgende gegevens in Figuur 4 waren van Fiander et al. gepubliceerd (2017) 26 met toestemming. De gegevens zijn geanalyseerd met behulp van one-way herhaalde maatregelen ANOVA met Holm-Sidak meerdere vergelijkingen test om te vergelijken alle tijdstippen tot en met basislijn26. De gemiddelde hoek (figuur 4A en 4 figuur d), bereik van de beweging (figuur 4B en figuur 4E) en RMS verschil (figuur 4C en figuur 4F) werden berekend op elk tijdstip te kwantificeren gait tekorten (n = 8 per groep). In het huidige EAE experiment was het begin van klinische scores DPI 14, dat na de tweede week van de opname is. CFA-muizen toonde geen verandering in de gemiddelde knie hoek (figuur 4A) of knie RMS verschil (figuur 4C), maar een kleine toename van de knie bereik van de beweging vertonen [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], op zowel DPI 16 en 30 ten opzichte van de basislijn ( Figuur 4B). Deze kleine verandering kan pijn als gevolg van de CFA-injectie weerspiegelen. In tegenstelling tot de CFA-dieren, waren er grote veranderingen bij de knie gezamenlijke voor EAE dieren voor de gemiddelde hoek [F(6,7) 11.08, p = < 0,0001] (Figuur 4 d), bereik van de beweging [F(6,7) 14.42, p = < 0,0001] (figuur 4E) en RMS verschil (figuur 4F). De gemiddelde hoek was aanzienlijk verminderd, die aangeeft dat de muizen EAE had hun knieën meer gebogen tijdens het wandelen. Dit kan worden indicatie van spierzwakte, zoals de dieren niet in staat om uit te breiden hun gewrichten van de knie waren ter ondersteuning van hun lichaamsgewicht. Het bereik van de beweging ook werd verlaagd, weer waarschijnlijk te wijten aan een onvermogen van de dieren uit te breiden van het kniegewricht. De aanzienlijke stijging van de knie RMS verschil geeft aan dat de bewegingen van het kniegewricht in EAE muizen wezenlijk verschillend van hun opname basislijn waren.
De gegevens in Figuur 5 werden geanalyseerd met behulp van one-way herhaalde maatregelen ANOVA met de Holm-Sidak meerdere vergelijkingen test die gait parameterwaarden op klinische scores van 0,5 vergeleken - 3,5 die gedetecteerd bij een klinische score van 0. Correlationeel analyse was ook uitgevoerd met behulp van Spearman rho (ρ). De gemiddelde knie hoek (figuur 5A), het bereik van de beweging (figuur 5B), en RMS verschil (figuur 5C) werden sterk gecorreleerd met klinische scores (p < 0,001). Deze correlaties tussen gezamenlijke bewegingen en klassieke klinische scoren staven de geldigheid van kinematische ganganalyse motor tekorten voor muizen EAE beoordelen. Knie bereik van beweging (figuur 5A) en RMS verschil (figuur 5C) werden aanzienlijk verlaagd beginnen bij een klinische score van 2.0 (p< 0,05). Deze bevindingen stellen voor dat verminderde knie bewegingen niet aan de motorische tekorten gedetecteerd door klinische scores lager dan 2.0 bijdragen. Echter de gemiddelde hoek van de knie (figuur 5B) werd verlaagd beginnen bij een klinische score van 1.0 (p< 0,05). Dit suggereert dat voor beweging van de knie, gemiddelde hoek het meest gevoelig voor de drie maatregelen.
Figuur 1 : Schematische voor kinematische gait opname met muizen. Zodra de reflecterende markeringen worden aangebracht, worden deze geplaatst op de iliacale crest, heup, enkel, metatarsofalangeale gewricht en het puntje van het vierde cijfer. Gait is opgenomen door een high-speed camera terwijl de muis is lopen op een loopband. De software van de analyse van de beweging wordt gebruikt voor het uitpakken gait parameters voor latere analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Voorbeeld van stap cyclus golfvormen in twee controle muizen die CFA ontvangen
De witte en groene achtergronden vertegenwoordigen de swing en houding fase, respectievelijk. Voor muis-1 overlappen de heup (A), knie (B) en (C) enkel stap cyclus golfvormen elkaar over 3 opeenvolgende opnamesessies regelafstand één week ertussen. Voor muis 2 cyclus de heup (D), knie (E) en (F) enkel stap golfvormen afwijken lichtjes van elkaar als gevolg van de inherente variabiliteit in wandelen gedrag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Stap cyclus golfvormen in muizen met EAE. De witte en groene achtergronden vertegenwoordigen swing en houding fase, respectievelijk voor drie opeenvolgende opnamesessies regelafstand een week uit elkaar. Door de 3rd opnamesessie, de heup (A), knie (B) en enkel zijn (C) golfvormen sterk veranderd als gevolg van progressie van de ziekte EAE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Gemiddelde hoek, bereik van de beweging, en de root mean squared worden gebruikt om te analyseren kinematische. Gemiddelde hoek, bereik van de beweging, en RMS verschillen werden berekend te kwantificeren motor tekorten in EAE muizen. De gemiddelde knie hoek (A), bereik van de beweging (B), en RMS (C) voor de CFA-muizen relatief constant gebleven. Muizen met EAE toonde bijzondere waardevermindering heeft ondergaan knie gemiddelde hoek (D), bereik van de beweging (E), en RMS (F). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking; p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0.001, verschil van dag post immunisatie (DPI) -2; # p < 0,05, verschil van piek tekort. Herdruk van referentie 26 met toestemming van de oorspronkelijke uitgevers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Gemiddelde knie hoek, bereik van beweging en RMS verschil correleren met klinische score
Correlatie analyse werd uitgevoerd tussen drie kinematische maatregelen van bewegingen van de knie en klinische scores te vergelijken van de twee methoden. De gemiddelde knie hoek (A), het bereik van de beweging (B), en RMS verschil (C) waren sterk gecorreleerd met klinische scores. De knie bereik van beweging en RMS verschil daalde begin op een klinische score van 2.0, terwijl de gemiddelde knie hoek eerder werd teruggebracht tot een klinische score voor 1.0. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking; p< 0,05 verschil met klinische score 0.0. Voor Spearman rho (ρ), *** p< 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij muizen met EAE, twee veelgebruikte methoden voor het meten van motorische tekorten zijn klinische scoren en latentie vallen van een rotarod27,28. Deze technieken hebben verschillende beperkingen. Hoewel handig en gebruikte, wordt klinische scoren beperkt door de opbrengst alleen ordinaal niveau gegevens, wat betekent dat de omvang van de verschillen tussen klinische scores zijn niet bekend. Klinische scoren lijdt ook niet in staat om nauwkeurige informatie over de aard van de motorische tekorten. Detest rotarod verbetert op sommige beperkingen van klinische scoren, maar alleen maatregelen van algemene motorische coördinatie en specifieke aspecten van het lopen niet meet.
Ter vergelijking: kinematische ganganalyse biedt gevoelige maatregelen over specifieke aspecten van voortbewegen, met inbegrip van het bereik van beweging en gemiddelde hoeken in diverse gewrichten. Subtiele tekorten in heup en knie gezamenlijke bewegingen voor MOG35-55 EAE muizen hebben geconstateerd bij DPI9, ongeveer 5-9 dagen vóór het begin van de klinische symptomen of rotarod tekorten26. Deze tekorten blijven bestaan ondanks een volledige verlossing van de klinische symptomen en werden waargenomen in de afwezigheid van rotarod tekorten26. Belangrijker, verminderde enkel bewegingen zoals afgemeten aan RMS verschil gecorreleerd zeer goed met de witte stof verlies in het ruggenmerg26.
Verschillende methodologische punten verdienen specifieke vermelding: 1) nauwkeurige en consistente plaatsing van de gezamenlijke markers is van cruciaal belang - het heupgewricht en iliacale crest moeten zorgvuldig worden geïdentificeerd door hartklopping; 2) het is noodzakelijk om opnames van 8-12 stap cycli. Deze stap cycli gemiddeld produceert een representatieve gemiddelde stap-cyclus die verder kan worden geanalyseerd; 3) optimale verlichtingsvoorwaarden moeten worden vastgesteld om ervoor te zorgen dat de markeringen duidelijk zichtbaar in de opnames zijn. Als markeringen niet goed belicht worden, kan dit maken met het digitaliseren van de video's een moeizaam proces, zoals veel beweging analyse programma's niet in staat om bij te houden van de markers zullen, waardoor handmatige tracking.
Een extra beperking van deze techniek is dat het is arbeidsintensief. Bijvoorbeeld, als u wilt vastleggen en analyseren van gegevens uit een groep van 10 muizen, schatten we dat het totale proces duurt ongeveer 7.0-9.0 uur (h). Maken van 50 markeringen (5 per muis) neemt ongeveer 2,0 h. kan opname muis gedrag wandelen gebeuren hetzij alleen of in een paar. Alleen werkt, duurt het ongeveer 25 min per muis, terwijl het werken in een paar duurt ongeveer 10 min per muis; Daarom, opname van 10 muizen kan duren van 1,5 h (paar) 4.0 h (solo). Tot slot, gegevensanalyse en grafieken nemen ongeveer 3,5 uur. Hoewel deze techniek arbeidsintensief is, zijn wij van mening dat de potentiële inzicht in de ziekte mechanismen aangeboden door kinematische ganganalyse rechtvaardigt deze investering. Na goede gedrags correlaten van ziekte pathologie is nuttig omdat seriële metingen kunnen afkomstig zijn uit een levende muis niet-gebeurt. Gezien de in de omgeving van perfecte correlatie tussen enkel kinematica en lumbale ruggemerg witte stof verlies26, deze methode kan worden gebruikt om na te gaan van het tijdelijke profiel van demyelinisatie en remyelination in EAE muizen in de loop van een experiment, waardoor herstel worden beoordeeld.
Ganganalyse wordt bemoeilijkt door ernstige verlamming die verkeer van de hindlimbs beperkt. Echter, zelfs ernstig verlamd muizen (klinische score > 3.0) zijn vaak in staat om de ambulate tot op zekere hoogte. In deze gevallen, de voorpoten worden gebruikt voor het trekken van het dier naar voren, en enige stuk beweging optreedt die kan worden gemeten door kinematische ganganalyse. Zelfs in deze ernstige gevallen is het nog steeds mogelijk voor het meten van herstel van stuk functie na verloop van tijd. Slechts in zeer ernstige gevallen (20% van de dieren met klinische scores > 3.5 op piek ziekte, DPI 16-23) wij niet in staat geweest om nuttige opnames van stuk verkeer. Deze dieren weer echter meestal een stuk functie door DPI 30, waardoor zinvolle opnames kunnen worden verkregen op dat tijdstip.
Een toekomstige toepassing van deze techniek is kinematische gegevens koppelen met gelijktijdige Electromyografische opnames van het stuk tijdens de motoriek. Deze techniek in muismodellen van ALS en SCI gebeurd is en kan worden gebruikt voor het verhelderen van de relatie tussen spieractiviteit, innervatie arm, en gang. Deze techniek kan ook gepaard gaan met meer modellen van MS en demyelinisatie die meer discrete gait tekorten produceren kan, met inbegrip van focal EAE modellen-29,30 of cuprizone-geïnduceerde demyelinisatie31gericht.
De technieken die wij hebben beschreven voor de meting van gezamenlijke bewegingen in muizen EAE kunnen ook worden toegepast op andere aandoeningen die afbreuk doen aan de gang. Duidelijke veranderingen in gang hebben gemeld voor Muismodellen van PD, SCI en ALS lijn8,9,10,11,13,14. Bijvoorbeeld, worden knaagdier modellen van PD gekenmerkt door verminderde paslengte en snelheid, wat resulteert in verhoogde cadans te handhaven wandelen snelheid32. Kinematische ganganalyse biedt derhalve krachtige gedrags hulpmiddelen verhelderen ziekte mechanismen en identificeren van potentiële behandelingen met behulp van deze modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij niets hebben te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen erkennen Sid Chedrawe voor zijn technische bijstand met filmen. Dit werk werd gesteund door de financiering van het MS Society of Canada (EGID 2983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
