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Neuroscience

Sagittal विमान गाढ़ापन चाल विश्लेषण में C57BL/6 चूहों MOG35 के अधीन-55 प्रेरित प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित Encephalomyelitis

Published: November 4, 2017 doi: 10.3791/56032
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1,3
1Pharmacology, Dalhousie University, 2Medical Neuroscience, Dalhousie University, 3Psychiatry, Dalhousie University
* These authors contributed equally

Summary

sagittal विमान में गाढ़ापन चाल विश्लेषण कैसे आंदोलन को अंजाम दिया है के बारे में अत्यधिक सटीक जानकारी पैदावार । हम इन तकनीकों के आवेदन का वर्णन करने के लिए स्व-प्रतिरक्षित-मध्यस्थता ग्रासलेल्या के अधीन चूहों के लिए चाल घाटे की पहचान. इन तरीकों को भी अंय माउस बिगड़ा गतिवान विशेषता मॉडलों के लिए चाल घाटे विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

sagittal विमान में गाढ़ापन चाल विश्लेषण अक्सर कई स्केलेरोसिस (एमएस) में मोटर घाटे की विशेषताएं किया गया है । हम इन तकनीकों के आवेदन के लिए एमएस, प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) के रूप में जाना के एक माउस मॉडल में चाल घाटे की पहचान का वर्णन । पक्षाघात और EAE के अधीन चूहों में मोटर घाटे आम तौर पर एक नैदानिक स्कोरिंग पैमाने का उपयोग कर आकलन कर रहे हैं. हालांकि, इस पैमाने केवल क्रमवार डेटा है कि मोटर घाटे की सटीक प्रकृति के बारे में कम जानकारी प्रदान करता है पैदावार । EAE रोग गंभीरता भी rotarod प्रदर्शन, जो सामांय मोटर समंवय का एक उपाय प्रदान करता है द्वारा मूल्यांकन किया गया है । इसके विपरीत, sagittal विमान में हिंद अंग के गाढ़ापन चाल विश्लेषण कैसे आंदोलन ख़राब है के बारे में अत्यधिक सटीक जानकारी उत्पंन करता है । इस प्रक्रिया को करने के लिए, चिंतनशील मार्करों हिंद अंग पर रखा जाता है संयुक्त आंदोलन का पता लगाने के लिए जबकि एक चूहा एक ट्रेडमिल पर चल रहा है । मोशन विश्लेषण सॉफ्टवेयर चलने के दौरान मार्करों के आंदोलन को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है । गाढ़ापन चाल मापदंडों तो परिणामी डेटा से प्राप्त कर रहे हैं । हम बताते है कि कैसे इन चाल मापदंडों EAE में कूल्हे, घुटने, और टखने के जोड़ों की बिगड़ी आंदोलनों का इस्तेमाल किया जा सकता है । इन तकनीकों को बेहतर रोग तंत्र को समझने और एमएस और अंय neurodegenerative विकारों कि गतिशीलता ख़राब के लिए संभावित उपचार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

चाल गतिवान प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया अंगों के दोहराव आंदोलनों की एक श्रृंखला है । चाल चरण चक्र है, जो दो चरणों में विभाजित कर रहे हैं शामिल है: रुख दौर है, जो है जब पैर जमीन पर पीछे की ओर बढ़ रहा है शरीर को आगे बढ़ाने के लिए; और स्विंग चरण है, जहां पैर जमीन बंद है और आगे बढ़ रहा है । चाल की गड़बड़ी कई neurodegenerative विकारों की पहचान विशेषताएं हैं, जैसे रीढ़ की हड्डी की चोट (विज्ञान), मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस), पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस), पार्किंसंस रोग (पीडी), और स्ट्रोक; इन विकारों के नैदानिक कुतर मॉडल अक्सर उनके संबंधित चाल ख़राबी दोहराऊंगा1। चूहों में गतिवान के बुनियादी नियंत्रण तंत्र का गहन अध्ययन किया गया है2,3. इसके अतिरिक्त, वहां कई मानव स्नायविक विकारों के माउस मॉडल है4। चूहों में चाल विश्लेषण इसलिए शारीरिक को संबद्ध किया जाना जाता है कि मोटर घाटे के कई पहलुओं को मापने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है । माउस मॉडल में चाल के अध्ययन neurodegenerative विकारों में हरकत घाटे के neuropathological अड्डों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, और संभावित उपचार की पहचान सक्षम करें ।

कुछ तकनीकों कि कुतर में चाल को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है दृश्य निरीक्षण (जैसे, Basso माउस स्केल5 और ओपन फील्ड टेस्ट6) और ventral विमान7से चाल का विश्लेषण शामिल हैं । हाल ही में, तरीकों hindlimb आंदोलनों के sagittal विमान कीनेमेटीक्स को मापने के लिए लोकप्रियता प्राप्त की है क्योंकि वे आंदोलन के निष्पादन के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने और फलस्वरूप चाल में सूक्ष्म परिवर्तन के लिए और अधिक संवेदनशील है8, 9 , 10 , 11. गाढ़ापन तकनीक sagittal विमान में hindlimb आंदोलन का अध्ययन करने के लिए विकसित करते हुए एक ट्रेडमिल पर चलने9,12 बड़े पैमाने पर विज्ञान के संदर्भ में अध्ययन किया गया है, एस, दर्दनाक cortical चोटों, स्ट्रोक, और हटिंगटन का रोग8,9,10,11,13,14,15,16। इसके विपरीत, इन तकनीकों कई स्केलेरोसिस17के माउस मॉडल के लिए हरकत घाटे के अध्ययन में सीमित उपयोग को देखा है ।

प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) MS18का सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला माउस मॉडल है । EAE उत्प्रेरण के दो मुख्य तरीके सक्रिय या निष्क्रिय टीका के माध्यम से है । एक्टिव EAE में चूहों को myelin एंटीजन के साथ प्रतिरक्षित जाता है, जिससे स्पाइनल टी सेल की मध्यस्थता neuroinflammation और ग्रासलेल्या रीढ़ की हड्डी में सेरिबैलम है । निष्क्रिय EAE, दूसरी ओर, सक्रिय EAE के साथ एक माउस से एक भोली माउस19के लिए प्रतिक्रियात्मक टी कोशिकाओं को स्थानांतरित द्वारा प्रेरित है । कहीं वर्णित के रूप में, रोग पाठ्यक्रम और neuropathology केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) प्रतिजन और माउस तनाव से प्रभावित कर रहे हैं20,21,22,23,24 ,25. EAE प्रयोगों में, नियंत्रण चूहों myelin प्रतिजन के बिना पूरा Freund के सहायक () के साथ इंजेक्ट कर रहे हैं । EAE पक्षाघात है कि पूंछ कमजोरी के साथ शुरू होता है और संभावित forelimbs शामिल कर सकते है आरोही द्वारा विशेषता है, गतिभंग और पक्षाघात में जिसके परिणामस्वरूप20। हम हाल ही में C57Bl/6 myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन 35-55 (मोग35-55)-प्रेरित EAE के अधीन चूहों में चाल परिवर्तन विशेषता है । ये अध्ययन चाल विश्लेषण से पता चला है शास्त्रीय व्यवहार विश्लेषण से बेहतर है क्योंकि सामांय टखने आंदोलन से विचलन अत्यधिक EAE चूहों की काठ का रीढ़ की हड्डी में सफेद बात नुकसान की डिग्री के साथ संबंधित है26। इसके विपरीत, सफेद बात नुकसान और दो अंय पारंपरिक व्यवहार उपायों (नैदानिक स्कोरिंग और rotarod) के बीच संबंध की ताकत बहुत कमजोर था26।

हम यहां गाढ़ापन चाल विश्लेषण का उपयोग करने के लिए EAE एक ट्रेडमिल पर चलने चूहों के sagittal विमान में आंदोलन घाटे का पता लगाने का वर्णन । उच्च गति वीडियो रिकॉर्डिंग में हिप, घुटने, और टखने जोड़ों के आंदोलन की पहचान करने के लिए एक hindlimb पर पांच चिंतनशील मार्करों रखा गया था । मोशन विश्लेषण सॉफ्टवेयर संयुक्त भ्रमण के बारे में गाढ़ापन डेटा निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन तकनीकों की उपयोगिता EAE के मोग35-55 मॉडल के लिए आंदोलन घाटे यों तो चर्चा कर रहे हैं । इन तकनीकों को भी neurodegenerative विकारों के अंय माउस मॉडलों में चाल घाटे के अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यह प्रोटोकॉल पशु देखभाल दिशानिर्देश पर कनाडाई परिषद के अनुसार है और इसे प्रयोगशाला पशुओं पर डलहौजी विश्वविद्यालय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

< p class = "jove_title" > 1. निर्माण चिंतनशील मार्करों:

  1. एक हाथ से आयोजित छेद पंच का उपयोग कर, चिंतनशील कागज के एक पत्रक से छोटे हलकों के वांछित संख्या पंच । प्रत्येक जानवर एक एकल रिकॉर्डिंग के लिए 5 मार्कर की आवश्यकता है; दो बड़े और तीन छोटे मार्करों.
    2. ठीक कैंची का उपयोग कर
  2. , एक सीधे सर्कल के केंद्र के लिए परिधि से विस्तार कटौती करते हैं ।
  3. चिपकने वाला सतह प्रकट करने के लिए मार्कर के कागज समर्थन को हटा दें । ठीक संदंश का प्रयोग, मजबूती से मार्कर पकड़ और खुद पर कर्ल एक शंकु आकार बनाने के लिए अपनी उंगली का उपयोग कर । एक छोटा सा मार्कर बनाने के लिए, शंकु कसकर कर्ल । एक बड़ा मार्कर बनाने के लिए, शंकु ढीला कर्ल ।
  4. एक हाथ से आयोजित गोंद बंदूक का उपयोग कर, गोंद के साथ शंकु के आकार का मार्कर के अंदर भरने जबकि संदंश के साथ शंकु की नोक मनोरंजक और कार्डबोर्ड के एक फ्लैट टुकड़ा करने के लिए मार्कर का पालन करें । गोंद टूट और प्रकाश की इष्टतम प्रतिबिंब सुनिश्चित करने के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान झुकने से मार्कर को रोकने जाएगा । जब गोंद शुष्क (लगभग 10 मिनट) है, तो एक स्केलपेल (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ) के साथ कार्डबोर्ड से मार्कर निकालें ।
< p class = "jove_title" > 2. रिकॉर्डिंग के लिए पशु तैयार करें

  1. Anesthetize isoflurane गैस के साथ माउस (२.५%; 2 लीटर/मिन ओ 2 ) एक प्रेरण कक्ष में माउस रखकर । एक बार माउस बेहोश है, यह एक नाक एक reसंचारित पानी हीटिंग कंबल के शीर्ष पर तैनात शंकु में जगह है । anesthetization का उद्देश्य मार्कर प्लेसमेंट के लिए माउस को स्थिर करना है; प्रक्रिया दर्दनाक नहीं है । इसलिए, संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने की आवश्यकता नहीं है ।
  2. दोनों आंखों के लिए एक सामयिक नेत्र स्नेहक लागू करें ।
  3. इलेक्ट्रिक कतरनी का उपयोग कर वांछित hindlimb दाढ़ी । टखने में शुरू और रीढ़ और पसलियों के नीचे करने के लिए विस्तार; कोई फर यह मार्कर आसंजन ख़राब हो जाएगा के रूप में छोड़ दिया है सुनिश्चित करें.
    नोट: यहां, सही hindlimb दर्ज किया गया था; हालांकि, या तो hindlimb उपयोग किया जा सकता है ।
  4. एक स्थाई मार्कर का उपयोग कर, श्रोणि शिखा और कूल्हे के संयुक्त के स्थान का संकेत है । श्रोणि शिखा अभी पसलियों के नीचे से नीचे है और घुटनों को माउस के नीचे एक साथ लाकर आसानी से साफ कर रही है & #39; s body.
    नोट: संयुक्त कूल्हे ठोके द्वारा पाया जा सकता है और पैर का विस्तार करने के लिए श्रोणि और फीमर के बीच अभिव्यक्ति बिंदु मिल ।
  5. ठीक संदंश का उपयोग कर, एक छोटे मार्कर के बिंदु अंत समझ और तेजी से अभिनय चिपकने वाला गोंद, या एक समकक्ष विकल्प में आधार डुबकी । चौथे अंक की नोक पर मार्कर प्लेस और 2-3 एस के लिए जगह में पकड़ के लिए गोंद सूखी अनुमति देते हैं । metatarsophalangeal संयुक्त और टखने पर एक ही तरीके से अन्य दो छोटे मार्करों प्लेस (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ).
  6. जगह पर बड़े मार्कर श्रोणि शिखा और हिप ज्वाइंट (< मजबूत वर्ग = "xfig" > फिगर 1b ) पर छोटे मार्कर के रूप में एक ही तरीके से.
  7. नाक शंकु से माउस निकालें और तुरंत एक स्थानांतरण पिंजरे का उपयोग कर रिकॉर्डिंग कमरे में स्थानांतरित । स्थिर ट्रेडमिल पर माउस प्लेस और संज्ञाहरण से पूर्ण वसूली के लिए अनुमति देते हैं ।
< p class = "jove_title" > 3. चाल रिकॉर्डिंग

  1. पहले माउस को रिकॉर्ड करना & #39; s चाल, ट्रेडमिल पर ज्ञात आयामों के साथ एक अंशांकन ब्लॉक की एक तस्वीर ले लो ।
    नोट: यह वीडियो में पिक्सल वास्तविक माप में परिवर्तित करने की अनुमति देगा । कैमरा ट्रेडमिल से लगभग १२० सेमी रखा जाना चाहिए ।
    1. एक ही ऊंचाई और ट्रेडमिल के रूप में स्तर पर कैमरे की स्थिति । अंशांकन छवि के बाद रिकॉर्डिंग के लिए एक ही कैमरा स्थिति बनाए रखें.
  2. एक बार माउस को पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है, एक कम गति के लिए ट्रेडमिल बारी (5 सेमी/ सुनिश्चित करें कि ट्रेडमिल बेल्ट दिशा ऐसी है कि माउस पर मार्करों कैमरे की ओर का सामना कर रहे हैं ।
  3. ट्रेडमिल की गति को बढ़ाने के लिए 20 सेमी/s; यह सबसे स्वस्थ चूहों में एक सुसंगत चाल के लिए आदर्श गति है ।
    नोट: हालांकि यह सभी चूहों एक ही गति से चलने के लिए आदर्श है, कुछ लगातार इस गति तक पहुँचने में असमर्थ हो सकता है.
    1. अगर माउस 20 सेमी/एस पर चलने में असमर्थ है, के रूप में आवश्यक गति को कम करने और इस का एक नोट बनाने के लिए सुनिश्चित करें । लगातार कदम चक्र हासिल कर रहे हैं जब तक ट्रेडमिल की गति को कम.
      नोट: बाद में डेटा विश्लेषण गति में अंतर के लिए समायोजित कर सकते हैं ।
  4. वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू एक बार माउस तेजी से चल रहा है ( यानी , एक सुसंगत गति से चलने, पीछे या पक्ष की ओर बुनाई नहीं) । जारी रखें रिकॉर्डिंग तक 8 से 12 लगातार कदम चक्र दर्ज किया गया है । हर वीडियो के लिए, ट्रेडमिल और माउस के पक्ष की गति रिकॉर्ड ।
  5. एक बार रिकॉर्डिंग पूरा हो गया है, ट्रेडमिल बंद करें और अपने पिंजरे में माउस वापस । अंय चूहों द्वारा पीछे छोड़ दिया scents के रूप में रिकॉर्डिंग के बीच अच्छी तरह से साफ ट्रेडमिल आने वाले चूहों के व्यवहार को बदल सकते हैं । तनाव और त्वचा के नुकसान को कम करने के लिए मार्करों को दूर नहीं; चूहों को उनके दम पर हटाने की अनुमति दें ।
< p class = "jove_title" > 4. विश्लेषण

  1. प्रक्रिया वीडियो मोशन विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.
    नोट: हमारे प्रयोगों में, हम कस्टम इमेजिंग और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर के लिए डिजाइन लिपियों का इस्तेमाल किया (सामग्री के तालिका देखें) कि डॉ निकोलस Stifani द्वारा लिखे गए थे । चयनित मोशन विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके निंन चरणों का पालन किया जाता है ।
    1. पिक्सेल वीडियो से मार्करों के निर्देशांक निकालें, और अंशांकन वीडियो का उपयोग कर, सेंटीमीटर के लिए पिक्सेल मूल्यों को बदलने और प्रत्येक फ्रेम पर संयुक्त कोण की गणना.
    2. प्रत्येक चरण चक्र के आरंभ और अंत को पहचानें, जिससे चरण अवधि और लंबाई के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सके.
    3. चरण चक्र अवधि २०० सामान्यीकृत फ्रेम करने के लिए सामान्य, इस तरह कि स्विंग और रुख १०० फ्रेम, क्रमशः द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.
  2. सामान्यीकृत फ़्रेम का उपयोग करते हुए, स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण के लिए गाढ़ापन पैरामीटर्स की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें).
    1. एक विशेष संयुक्त के औसत कोण स्थापित करने के लिए, के रूप में एक सामान्यीकृत फ्रेम के भीतर सभी कोणों का मतलब ले लो:
      < img src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56032/56032eq1v4.jpg"/>
      नोट: यहां x किसी दिए गए सामान्यीकृत पर कोण मान का प्रतिनिधित्व करता है फ़्रेम, और n सामान्यीकृत फ़्रेम संख्या का प्रतिनिधित्व करता है ।
    2. दिया माउस के लिए एक विशेष संयुक्त की गति की सीमा स्थापित करने के लिए, इस प्रकार के रूप में सामान्यीकृत फ्रेम का एक सेट में सबसे बड़ा कोण से सबसे छोटा कोण घटाना:
      रेंज ऑफ मोशन = कोण जास्तीत -कोण कमीतकमी .
      नोट: यहां कोण अधिकतम और कोण ंयूनतम सबसे बड़ा और सबसे छोटा कोण सामान्यीकृत कदम चक्र के भीतर हासिल कर रहे हैं, क्रमशः ।
    3. RMS अंतर स्थापित करने के लिए, पहले आधारभूत रिकॉर्डिंग से प्रत्येक प्रयोगात्मक समय-बिंदु का औसत कोण घटाना. अगले, वर्ग प्रत्येक अंतर, सभी वर्गीय मूल्यों और वर्ग जड़ मतलब का मतलब ले लो । समीकरण इस प्रकार है:
      < img src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56032/56032eq3v4.jpg"/>
      नोट: यहां < img src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56032/56032eq4.jpg"/> आधारभूत रिकॉर्डिंग से औसत कोण का प्रतिनिधित्व करता है; y प्रत्येक प्रयोगात्मक समय-बिंदु से औसत कोण का प्रतिनिधित्व करता है; एन और सामान्यीकृत फ्रेम की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । रूट माध्य चुकता (RMS) अंतर आधारभूत रिकॉर्डिंग से चाल में विचलन का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया माप है ।
  3. का उपयोग वैज्ञानिक रेखांकन और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का विश्लेषण करने के लिए और डेटा प्रस्तुत ( सामग्री की मेज देखें) ।

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Representative Results

चित्रा 1 गाढ़ापन चाल विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है. सबसे पहले, चिंतनशील मार्करों बना रहे हैं और 5 संरचनात्मक अंक पर एक माउस पर रखा. चाल तो दर्ज की है, जबकि माउस एक ट्रेडमिल पर चल रहा है । मोशन विश्लेषण सॉफ्टवेयर बाद विश्लेषण के लिए गाढ़ापन डेटा निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

चित्र 2a -C कूल्हे, घुटने, और टखने संयुक्त कोण के लिए एक नियंत्रण के कदम चक्र का प्रतिनिधित्व लगातार तीन रिकॉर्डिंग सत्र में दर्ज एक सप्ताह के अलावा जगह । waveforms के बीच ओवरलैप सत्र 1-3 से कदम चक्र में न्यूनतम विचलन से पता चलता है. चित्र 2d -F रिकॉर्डिंग सत्र 1-3 से अधिक घूमना परिवर्तनशीलता प्रदर्शित एक दूसरे नियंत्रण के कदम चक्र का प्रतिनिधित्व करते हैं । कदम चक्र y-अक्ष के साथ स्थानांतरित कर रहे हैं, waveforms के आकार रिकॉर्डिंग के बीच संगत रहता है. परिवर्तनशीलता का यह स्तर माउस चलने के लिए विशिष्ट है ।

चित्र 3 ए -C EAE के साथ एक माउस के चरण चक्र का प्रतिनिधित्व लगातार तीन रिकॉर्डिंग सत्र पर दर्ज की गई । वहां पहली से दूसरी रिकॉर्डिंग सत्र के लिए चाल में कम परिवर्तन कर रहे हैं, लेकिन तीसरे सत्र से, चाल को सभी तीन जोड़ों में पाया गया है । कूल्हे के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम चक्र पर सपाट हुआ है, आंदोलन का एक बड़ा नुकसान का संकेत है । घुटने और अधिक फ्लेक्स और कम करने के लिए विस्तार और पशुओं के शरीर के वजन का समर्थन करने में सक्षम हो गया है । टखने संयुक्त आंदोलनों में भी काफी बदल रहे थे । पैर dorsiflexion और तल फ्लेक्स स्विंग (सफेद पैनल) और रुख (ग्रीन पैनल) चरणों, क्रमशः के दौरान देरी हो रही है । ये घाटे इस संयुक्त में मांसपेशियों की कमजोरी का संकेत कर रहे है के रूप में पशु दोनों स्विंग चरण के दौरान अपने पैर उठाने की क्षमता में ख़राब है, और आगे बढ़ाने के रुख चरण के दौरान शरीर ।

चित्रा 4 में प्रस्तुत निम्न डेटा Fiander एट अल से पुनर्प्रकाशित किया गया. (२०१७) 26 अनुमति के साथ । डेटा एक तरह से दोहराया उपायों होल्म-Sidak एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ ANOVA का उपयोग करने के लिए आधारभूत26के लिए सभी समय अंक की तुलना का विश्लेषण किया गया । औसत कोण (चित्र 4a और चित्रा 4d), गति की रेंज (चित्रा 4B और चित्रा 4E) और RMS अंतर (फिगर 4c और चित्रा 4F) प्रत्येक समय बिंदु पर गणना की गई चाल यों तो घाटे (n = 8 प्रति समूह) । वर्तमान EAE प्रयोग में, नैदानिक स्कोर की शुरुआत 14 डीपीआई था, जो रिकॉर्डिंग के दूसरे सप्ताह के बाद है । एक-एक कर के औसत घुटने के कोण (चित्रा 4a) या घुटने RMS अंतर (चित्रा 4c) में कोई परिवर्तन नहीं दिखाया, लेकिन गति के घुटने सीमा में एक छोटे से वृद्धि प्रदर्शन किया [एफ 2, 7) = ५.८७१, पी = ०.००८३], दोनों डीपीआई पर 16 और 30 आधार रेखा के सापेक्ष ( चित्रा 4B). इस छोटे से परिवर्तन के इंजेक्शन से उत्पन्न दर्द को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । इस EAE पशुओं के लिए औसत कोण के लिए संयुक्त घुटने में बड़े बदलाव थे [एफ 6 (), 7) = ११.०८, प & #60; ०.०००१] (चित्रा 4d), गति की सीमा [F (6, 7) = १४.४२, p & #60; ०.०००१] (figure 4E) and RMS अंतर (चित्र 4F). औसत कोण काफी कम था, यह दर्शाता है कि EAE चूहों उनके घुटनों अधिक चलने के दौरान फ्लेक्स था । यह मांसपेशियों की कमजोरी का संकेत हो सकता है, के रूप में जानवरों को अपने घुटने के जोड़ों का विस्तार करने के लिए अपने शरीर के वजन का समर्थन करने में असमर्थ थे । गति की सीमा में भी कमी आई थी, फिर से पशुओं की अक्षमता के कारण की संभावना को घुटने संयुक्त विस्तार । घुटने RMS अंतर में उल्लेखनीय वृद्धि इंगित करता है कि EAE चूहों में संयुक्त घुटने के आंदोलनों उनकी आधारभूत रिकॉर्डिंग से काफी अलग थे.

चित्रा 5 में डेटा होल्म-Sidak एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ ANOVA एक तरह से दोहराया उपायों का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है कि तुलना 0 के एक नैदानिक स्कोर पर पाया उन लोगों के लिए ०.५-३.५ के नैदानिक स्कोरों पर कदम पैरामीटर मान. स्पीमरन rho (दर्षाया) का उपयोग करते हुए सहसंबंध विश्लेषण भी किया गया । औसत घुटने का कोण (चित्रा 5), गति की सीमा (चित्रा 5B), और RMS अंतर (चित्रा 5C) दृढ़ता से नैदानिक स्कोर (p & #60; ०.००१) के साथ संबंधित थे. संयुक्त आंदोलनों और शास्त्रीय नैदानिक स्कोरिंग के बीच इन सहसंबंधों EAE चूहों के लिए मोटर घाटे का आकलन करने के लिए गाढ़ापन चाल विश्लेषण की वैधता हस्तगत । घुटने की रेंज (चित्रा 5) और RMS अंतर (चित्रा 5C) २.० (पी& #60; ०.०५) के एक नैदानिक स्कोर पर शुरुआत काफी कम थे. इन निष्कर्षों का सुझाव है कि ख़राब घुटने आंदोलनों मोटर नैदानिक स्कोर से कम २.० से पता चला घाटे में योगदान नहीं है । हालांकि, घुटने औसत कोण (चित्रा 5B) १.० (पी& #60; ०.०५) के एक नैदानिक स्कोर पर शुरुआत में कमी आई थी । यह पता चलता है कि घुटने के आंदोलन के लिए, औसत कोण तीन उपायों के सबसे संवेदनशील है ।

Figure 1
चित्र 1 : गाढ़ापन चाल के लिए योजनाबद्ध चूहों के साथ रिकॉर्डिंग. एक बार चिंतनशील मार्करों बना रहे हैं, वे श्रोणि शिखा, हिप संयुक्त, टखने, metatarsophalangeal संयुक्त, और चौथे अंक की नोक पर रखा जाता है । चाल एक उच्च गति कैमरे द्वारा दर्ज की गई है, जबकि माउस एक ट्रेडमिल पर चल रहा है । मोशन विश्लेषण सॉफ्टवेयर बाद विश्लेषण के लिए चाल मापदंडों निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : दो नियंत्रण चूहों में कदम चक्र waveforms के उदाहरण है कि प्राप्त
सफेद और हरे रंग की पृष्ठभूमि क्रमशः स्विंग और रुख चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । माउस 1 के लिए, कूल्हे (एक), घुटने (ख), और टखने (सी) कदम चक्र waveforms के अलग एक सप्ताह में अंतरिक्ष में 3 लगातार रिकॉर्डिंग सत्र भर में एक दूसरे को ओवरलैप. माउस 2 के लिए, हिप (डी), घुटने (ई), और टखने (एफ) कदम चक्र waveforms व्यवहार चलने में निहित परिवर्तनशीलता के कारण एक दूसरे से थोड़ा विचलित. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : EAE के साथ चूहों में कदम चक्र waveforms. सफेद और हरे रंग की पृष्ठभूमि स्विंग और रुख चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः, लगातार तीन रिकॉर्डिंग सत्र के लिए एक सप्ताह के अलावा स्थान । 3rd रिकॉर्डिंग सत्र से, हिप (एक), घुटने (ख), और टखने (ग) waveforms काफी EAE रोग प्रगति के कारण बदल रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : औसत कोण, गति की सीमा है, और वर्ग मतलब चुकता गाढ़ापन डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है । औसत कोण, गति की सीमा है, और RMS मतभेद EAE चूहों में मोटर घाटे को बढ़ाता है की गणना की गई । औसत घुटने कोण (एक), गति की सीमा (ख), और आरएमएस (ग) के लिए RMS चूहे अपेक्षाकृत स्थिर रहे । EAE के साथ चूहों ख़राब घुटने औसत कोण (घ), गति की रेंज (ई), और RMS (F) दिखाया. डेटा अर्थ ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; * p& #60; ०.०५, * * p& #60; ०.०१, * * * p& #60; ०.००१, दिन पद प्रतिरक्षण से अंतर (DPI)-2; # p & #60; ०.०५, पीक घाटे से अंतर । मूल प्रकाशकों से अनुमति के साथ संदर्भ 26 से पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . औसत घुटने कोण, गति और RMS अंतर की रेंज नैदानिक स्कोर के साथ सहसंबंधी बनाना
सहसंबंध विश्लेषण दो तरीकों की तुलना करने के लिए घुटने आंदोलनों और नैदानिक स्कोर के तीन गाढ़ापन उपायों के बीच किया गया था । औसत घुटने कोण (A), गति की श्रेणी (B), और RMS अंतर (C) दृढ़ता से नैदानिक स्कोर के साथ संबंधित थे । गति और RMS अंतर के घुटने सीमा २.० के एक नैदानिक स्कोर पर शुरुआत में कमी आई, जबकि औसत घुटने कोण १.० के एक नैदानिक स्कोर करने के लिए पहले कम हो गया था । डेटा अर्थ ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; * प& #60; नैदानिक स्कोर ०.० से ०.०५ अंतर । For स्पीमरन rho (दर्षाया), * * * प& #60; ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

EAE के साथ चूहों में, मोटर घाटे को मापने के दो सबसे आम तरीकों नैदानिक स्कोरिंग और एक rotarod27,28से विलंबता गिर रहे हैं । इन तकनीकों में कई सीमाएं हैं । हालांकि सुविधाजनक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, नैदानिक स्कोरिंग केवल क्रमवार स्तर डेटा उपज द्वारा सीमित है, जिसका अर्थ है कि नैदानिक स्कोर के बीच मतभेदों के परिमाण ज्ञात नहीं हैं । नैदानिक स्कोरिंग भी मोटर घाटे की प्रकृति के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करने में असमर्थ होने से ग्रस्त है । rotarod परीक्षण नैदानिक स्कोरिंग की कुछ सीमाओं पर सुधार, लेकिन केवल सामान्य मोटर समन्वय के उपाय और चलने के विशिष्ट पहलुओं को मापने नहीं है.

तुलना करके, गाढ़ापन चाल विश्लेषण विभिन्न जोड़ों पर गति और औसत कोण की सीमा सहित गतिवान के विशिष्ट पहलुओं के बारे में संवेदनशील उपाय प्रदान करता है. मोग35-55 EAE चूहों के लिए कूल्हे और घुटने के संयुक्त आंदोलनों में सूक्ष्म घाटे DPI9, नैदानिक लक्षण या rotarod घाटे की शुरुआत से पहले लगभग 5-9 दिनों में पता लगाया गया है26. इन घाटे नैदानिक लक्षण की एक पूरी छूट के बावजूद कायम है और rotarod घाटे के अभाव में मनाया गया था26। महत्वपूर्ण बात, के रूप में RMS अंतर से मापा बिगड़ा टखने आंदोलनों रीढ़ की हड्डी में सफेद बात नुकसान के साथ बहुत अच्छी तरह से संबंधित26।

कई methodological अंक विशिष्ट उल्लेख के लायक: 1) संयुक्त मार्करों के सटीक और लगातार नियुक्ति महत्वपूर्ण है-हिप संयुक्त और श्रोणि शिखा ध्यान से घबराहट द्वारा की पहचान की जानी चाहिए; 2) यह 8-12 कदम चक्र से रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । इन कदम चक्रों औसत एक प्रतिनिधि औसतन कदम चक्र है कि आगे का विश्लेषण किया जा सकता है पैदा करता है; 3) इष्टतम प्रकाश व्यवस्था की स्थिति मार्करों रिकॉर्डिंग में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए । यदि मार्कर ठीक से प्रबुद्ध नहीं कर रहे हैं, इस वीडियो एक श्रमसाध्य प्रक्रिया के रूप में कई प्रस्ताव विश्लेषण कार्यक्रमों मार्करों, महसूस मैनुअल ट्रैकिंग ट्रैक करने में असमर्थ हो जाएगा डिजिटलीकरण कर सकते हैं ।

इस तकनीक का एक अतिरिक्त सीमा है कि यह गहन श्रम है । उदाहरण के लिए, रिकॉर्ड और 10 चूहों के एक समूह से डेटा का विश्लेषण करने के लिए, हम कुल प्रक्रिया लगभग 7.0-9.0 घंटे (h) लेता है अनुमान है । बनाने ५० मार्करों (5 प्रति माउस) के बारे में २.० h. recording माउस चलने व्यवहार या तो अकेले या एक जोड़ी में किया जा सकता है । अकेले काम, यह माउस प्रति 25 मिनट के बारे में लेता है, जबकि एक जोड़ी में काम माउस प्रति 10 मिनट के आसपास लेता है; इसलिए, रिकॉर्डिंग 10 चूहों १.५ ज (जोड़ी) से ४.० h (एकल) के लिए ले सकता है । अंत में, डेटा विश्लेषण और रेखांकन लगभग ३.५ एच ले । हालांकि इस तकनीक गहन श्रम है, हमें लगता है कि रोग गाढ़ापन चाल विश्लेषण द्वारा की पेशकश की प्रणाली में संभावित अंतर्दृष्टि इस निवेश को सही ठहराते हैं । रोग विकृति के अच्छे व्यवहार को संबद्ध होने के रूप में धारावाहिक माप एक जीवित माउस गैर इनवेसिव से लिया जा सकता है के रूप में उपयोगी है । टखने कीनेमेटीक्स और काठ का रीढ़ की हड्डी सफेद बात नुकसान के बीच सही संबंध को देखते हुए26, इस विधि के एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर EAE चूहों में ग्रासलेल्या और remyelination के लौकिक प्रोफ़ाइल का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, की अनुमति वसूली का आकलन किया जाए ।

चाल विश्लेषण hindlimbs के आंदोलन को प्रतिबंधित करता है कि गंभीर पक्षाघात से जटिल है । हालांकि, यहां तक कि गंभीर रूप से पंगु चूहों (नैदानिक स्कोर & #62; ३.०) अक्सर कुछ हद तक ambulate करने में सक्षम हैं । इन मामलों में, forelimbs जानवर आगे खींचने के लिए उपयोग किया जाता है, और कुछ hindlimb आंदोलन होता है जो गाढ़ापन चाल विश्लेषण द्वारा मापा जा सकता है । यहां तक कि इन गंभीर मामलों में, यह अभी भी समय के साथ hindlimb समारोह की वसूली को मापने के लिए संभव है । केवल बहुत गंभीर मामलों में (नैदानिक स्कोर के साथ जानवरों का 20% & #62; पीक रोग, डीपीआई 16-23 पर ३.५) हम hindlimb आंदोलन की उपयोगी रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में असमर्थ रहा है । फिर भी, इन जानवरों आमतौर पर 30 डीपीआई द्वारा कुछ hindlimb समारोह पाने, सार्थक रिकॉर्डिंग उस समय बिंदु पर प्राप्त किया जा करने की अनुमति ।

इस तकनीक का एक भविष्य आवेदन गतिवान के दौरान hindlimb के एक साथ electromyographic रिकॉर्डिंग के साथ गाढ़ापन डेटा युग्मन है । इस तकनीक एस और विज्ञान के माउस मॉडलों में किया गया है और मांसपेशियों की गतिविधि, इन्नेर्वतिओन, और चाल के बीच संबंध स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तकनीक को भी एमएस और ग्रासलेल्या के अधिक लक्षित मॉडल है कि अधिक असतत चाल घाटे का उत्पादन कर सकते है के साथ युग्मित हो सकता है, फोकल EAE मॉडल29,30 या cuprizone-प्रेरित ग्रासलेल्या31सहित ।

तकनीक हम EAE चूहों में संयुक्त आंदोलनों की माप के लिए वर्णित है भी अंय विकारों कि चाल ख़राब करने के लिए लागू किया जा सकता है । चाल में विशिष्ट परिवर्तन पीडी, विज्ञान, एस, और स्ट्रोक8,9,10,11,13,14के माउस मॉडलों के लिए सूचित किया गया है । उदाहरण के लिए, पीडी के कुतर मॉडल कम छलाँग लंबाई और वेग की विशेषता है, ऊंचा ताल में जिसके परिणामस्वरूप गति को बनाए रखने के लिए३२। गाढ़ापन चाल विश्लेषण इसलिए स्पष्ट रोग तंत्र के लिए शक्तिशाली व्यवहार उपकरण प्रदान करता है और संभावित इन मॉडलों का उपयोग कर उपचार की पहचान ।

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Disclosures

लेखकों ने एलान किया कि उनका खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम फिल्माने के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए सिड Chedrawe स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम कनाडा के एमएस सोसायटी (EGID २९८३) से धन द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon Nikon D750 Used to film the video
Reflective tape B&L Engineering MKR-Tape-2
Fine scissors Fine Science Tools 15023-10
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Glue gun Craftsmart E231647
scalpel handle #4 Roboz R5-9884
Scalpel Blade No.10 Feather 2020-12
C57BL/6 mice Charles River Laboratories
Anesthetic machine EZ Anesthesia EZ-AF9000 Auto Flow System
Recirculating water heating blanket Androit HTP-1500
topical eye lubricant Refresh DIN00210889
Shaver Oster 78997-010
High speed camera Fastec Fastec IL3-100
High power light Smith Victor Corporation Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts)
Light Stand Promaster LS1
Treadmill Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne
Microsoft Excel 2016 Microsoft Version 2016
KinemaJ Nicolas Stifani This is a script generated for use with ImageJ
KinemaR Nicolas Stifani This is a script generated for use with Rstudio
Vicon Motus Vicon Motus Version 9.00
GraphPad Prism GraphPad Version 6.00

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References

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तंत्रिका अंक १२९ कीनेमेटीक्स चाल प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis माउस एकाधिक स्केलेरोसिस मोटर घाटे
Sagittal विमान गाढ़ापन चाल विश्लेषण में C57BL/6 चूहों MOG35 के अधीन-55 प्रेरित प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित Encephalomyelitis
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