Summary
Kinematik yürüyüş analizi sagittal düzlemde hareket nasıl yürütüleceğini konusunda son derece hassas bilgi verir. Biz yürüyüş açıkları otoimmün aracılı demiyelinizasyon tabi fareler için tanımlamak için bu tekniklerin uygulanması açıklanmaktadır. Bu yöntemler, yürüyüş açıkları Engelli hareket featuring diğer fare modelleri için karakterize etmek için de kullanılabilir.
Abstract
Sagittal düzlemde kinematik yürüyüş analizi, multipl skleroz (MS) motor açıkları karakterize etmek için sık sık kullanılmıştır. Biz yürüyüş açıkları, MS, deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) bilinen bir fare modeli tanımlamak için bu tekniklerin uygulanması açıklanmaktadır. EAE için tabi farelerde felç ve motor açıkları genellikle klinik bir puanlama ölçeği kullanarak değerlendirilir. Ancak, bu ölçekte yalnızca sıralı veri sunan motor açıkları hassas doğası hakkında az bilgi verir. EAE hastalık şiddeti genel motor koordinasyon, ölçütü sağlar rotarod performansı da değerlendirildi. Buna karşılık, kinematik yürüyüş analizi, arka bacak sagittal düzlemde hareket Engelli olduğu hakkında son derece hassas bilgileri oluşturur. Bu yordamı gerçekleştirmek için yansıtıcı işaretleri zor durumda iken bir fare koşu bandında yürüyüş eklem hareketi algılamak için hind yerleştirilir. Hareket analiz yazılımı yürüyüş sırasında veri işaretleyicilerini hareket ölçmek için kullanılır. Kinematik yürüyüş parametreleri sonra sonuç verilerden elde edilmiştir. Bu yürüyüş parametreler Engelli EAE kalça, diz ve ayak bileği eklem hareketlerinin ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tekniklerin daha iyi hastalık mekanizmaları anlamak ve MS ve hareketlilik zarar diğer nörodejeneratif hastalıklar için olası tedavileri belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
Yürüyüş tekrarlanan hareketleri ekstremitelerin hareket elde etmek için kullanılan bir dizi var. Yürüyüş iki safhaya ayrılır adım döngüleri oluşur: ayak geriye doğru yere vücut ileten; itmek için hareketli olan tutumunu faz ve ayak zemin ve hareketli ileriye nerede salıncak faz. Yürüyüş bozuklukları Medulla Spinalis Yaralanmalarında (SCI), multipl skleroz (MS), amyotrofik lateral skleroz (ALS), Parkinson hastalığı (PD) ve inme gibi birçok nörodejeneratif hastalıkların hallmark şekil are; Preklinik kemirgen modelleri bu bozuklukların sık sık onların anılan sıraya göre yürüyüş bozuklukları1özetlemek. Farelerde hareket temel kontrol mekanizmaları çalışılmış2,3olmuştur. Ayrıca, birçok insan nörolojik bozukluklar4fare modelleri vardır. Yürüyüş analizi farelerde bu nedenle birden fazla anatomik ilişkilendirir bilinen motor açıkları yönlerini ölçmek için çekici bir yaklaşımdır. Yürüyüş fare modellerinde çalışmanın nörodejeneratif hastalıklarda Lokomotor açıkları neuropathological üsleri içgörü sağlamak ve olası tedavileri tanımlaması etkinleştirin.
Yürüyüş Rodents ölçmek için kullanılan bazı teknikler görsel denetim (örneğin, Basso fare ölçek5 ve açık alan testi6) ve yürüyüş ventral uçak7analizini içerir. Hareket yürütme hakkında bilgi sağlar ve sonuç olarak daha ince değişiklikleri yürüyüş8, duyarlı olduğundan daha yakın zamanlarda, sagittal düzlem kinematik hindlimb hareketlerinin ölçmek için yöntemleri popülerlik kazanmıştır 9 , 10 , 11. kinematik Teknikleri hindlimb hareketi sagittal düzlemde bir koşu bandı9,12 tarihinde yürürken eğitim için geliştirilen adamları kapsamlı bir şekilde inceledik SCI, ALS, travmatik beyin yaralanmaları, inme, bağlamında ve Huntington hastalığı8,9,10,11,13,14,15,16. Buna ek olarak, bu teknikleri multipl skleroz17fare modelleri için sınırlı kullanım Lokomotor açıkları çalışmada gördük.
Deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) MS18en sık kullanılan fare modeldir. EAE inducing iki ana yöntem aktif ya da pasif aşılama yolu ile var. Etkin EAE içinde fareler miyelin antijenleri, neden autoreactive neuroinflammation T Hücre-aracılı ve spinal kord ve beyincik demiyelinizasyon ile aşı. Pasif EAE, öte yandan, autoreactive T hücreleri aktif EAE fareyle bir saf fare19' a geçiş yapan tarafından indüklenen. Başka bir yerde de açıklandığı gibi hastalık sahası ve nevropatoloji merkezi sinir sistemi (MSS) antijen tarafından etkilenmiştir ve fare süzün20,21,22,23,24 ,25. EAE deneylerde kontrol fare ile miyelin antijen olmadan tam Freund's adjuvan (CFA) enjekte edilir. EAE kuyruk zayıflık ile başlayan ve potansiyel olarak ön ayakları, içerebilir felç artan tarafından ataksi ve felç20dakikaya kaynaklanan karakterizedir. Son zamanlarda yürüyüş değişiklik miyelin oligodendrocyte glikoprotein 35-55 (MOG35-55) tabi C57Bl/6 farelerde nitelendirmiştir-EAE indüklenen. Bu çalışmalar sapmalar normal ayak bileği hareketinden çok beyaz madde kayıp lomber spinal kord EAE fareler26ile correlated çünkü klasik davranış analizi üstün olmak için yürüyüş analizi göstermiştir. Buna karşılık, beyaz madde kaybı ve diğer geleneksel davranış ve iki ölçümlerini (klinik puanlama rotarod) arasındaki korelasyon gücünü çok zayıf26oldu.
Biz burada bir koşu bandı üzerinde yürüme EAE farelerin sagittal düzlemde hareket açıkları tespit etmek için kinematik yürüyüş analizi nasıl kullanılacağını açıklar. Beş yansıtıcı işaretleyicileri hareket kalça, diz ve ayak bileği dururken, yüksek hızlı video kayıtları tanımlamak için bir hindlimb üzerine yerleştirildi. Hareket analiz yazılımı ortak geziler hakkında kinematik veri ayıklamak için kullanıldı. Belgili tanımlık yarar hareketi açıkları EAE MOG35-55 model ölçmek için bu tekniklerin ele alınmıştır. Bu teknikler de yürüyüş açıkları diğer fare modelleri nörodejeneratif hastalıkların incelenmesi için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iletişim kuralı uygun olarak hayvan bakım kuralları Kanada Konseyi ve laboratuvar hayvanlarının Dalhousie üniversite Komitesi tarafından kabul edildi.
1. yansıtıcı işaretleri oluşturmak:
- bir el delik yumruk kullanarak bir yansıtıcı kağıdın üzerinden küçük daire için istediğiniz sayıyı yumruk. Her hayvan 5 işaretleri için tek bir kayıt gerektirir; iki büyük ve üç küçük işaretleri.
- İyi makas kullanarak, çevre çemberin ortasına doğru uzanan bir düz kesim olun.
- Yapışkan yüzeyi ortaya çıkarmak için işaretçiyi yedekleme kağıdı çıkarın. İyi forseps kullanarak, işaretçiyi sıkıca kavrama ve içinde bir koni şekli oluşturmak için parmağınızı kullanarak kendi kendine curl. Küçük bir işareti yapmak için koni sıkıca kıvırın. Büyük bir işareti yapmak için koni gevşek curl.
- Bir el tutkal tabancası kullanarak, koni ucu Forseps ile sürükleyici süre yapıştırıcı ile koni şeklindeki işaretçiyi içini doldurmak ve işaretçiyi bir düz parça karton için uygun. Tutkal çöken ve ışığın en iyi yansıması emin olmak için kayıt sırasında bükme işaretçiyi engeller. Tutkal ne zaman (yaklaşık 10 dakika) kuru, karton bir neşter ( şekil 1A) ile işaretçiyi kaldırmak.
2. Hayvan kayıt için hazırlamak
- Anesthetize fare ile bir indüksiyon odasına fareyi yerleştirerek isoflurane gaz (% 2.5; 2 litre/dak O 2). Fare bilinçsiz olduğunda, bu dolaşım bir su ısıtıcı battaniye üstüne yerleştirilmiş bir burun konisi yerleştirin. Anesthetization amacı fare işaretçisi yerleşim için immobilize etmektir; prosedür ağrılı değildir. Bu nedenle, anestezi derinliği değerlendirilmesi gerekmez.
- Her iki gözde bir topikal göz yağ uygulamak.
- Elektrik makası kullanarak istenen hindlimb tıraş. Ayak bileği başlar ve omurga ve kaburga altında genişletmek; hiçbir kürk yaptı bu marker yapışma zarar gibi olun.
Not: Burada, sağ hindlimb kaydedilmiştir; Ancak, her iki hindlimb-ebilmek var olmak kullanılmış. - Kalıcı bir kalem kullanarak iliyak arması ve Kalça eklemi konumunu gösterir. İliyak kret sadece kaburgaların alt ve diz altında fare araya getirerek kolayca hissedilir ' s beden.
Not: Kalça eklemi esneme ve leğen kemiği ile kalça kemiği arasındaki eklem noktasını bulmak için bacak uzanan bulunabilir. - Kullanma iyi forseps, sivri sonuna küçük bir işaretleyici kavramak ve hızlı yapıştırıcı tutkal Base'deki veya eşdeğer alternatif daldırma. Dördüncü basamak ucu üzerinde işaretçiyi yerleştirin ve kuru tutkal izin vermek 2-3 s için bir yerde tutun. Diğer iki küçük işaretleri metatarsofalanjiyal eklem ve ayak bileği üzerinde koyun aynı şekilde ( şekil 1B).
- Yer büyük işaretleri iliyak arması ve Kalça eklemi ( şekil 1B) aynı şekilde küçük işaretleyici olarak.
- Ve hemen bir transfer kafes kullanarak kayıt odasına transfer fare burun konisi çıkarın. Fareyi sabit koşu bandına yerleştirin ve anestezi tam kurtarma için sağlar.
3. Yürüyüş kayıt
- fare kayıt için
- önceden ' s yürüyüş, koşu bandı üzerinde bilinen boyutlu bir kalibrasyon blok resim bir.
Not: Bu gerçek ölçümleri için dönüştürmek için video piksel sağlayacaktır. Kameranın yaklaşık 120 cm koşu bandı üzerinden yer almalıdır.- Koşu bandı olarak konumunu aynı yükseklikte ve düzey kameraya. Kalibrasyon görüntü takip kayıtları için aynı kamera konumunu korumak.
- Fare tamamen anesteziden kurtarıldı kez yürüyüş başlar fare izin vermek a alçak hız (5 cm/s) için koşu bandı açmak. Öyle ki fare işaretçileri doğru kamera karşı karşıya koşu bandı kemeri yön olduğundan emin olun.
- Artış koşu hızı yavaş yavaş 20 cm/s; Bu en sağlıklı farelerde tutarlı bir yürüyüş için ideal hızıdır.
Not: tüm fareler aynı hızda yürüyüş ideal olsa da, bazı tutarlı bir şekilde bu hız ulaşmak mümkün olabilir.- Fare 20 cm/s, yürümeyi kaydedemediği
- gereken hız azaltmak ve bu not etmeyi unutmayın. Tutarlı adım döngüleri elde kadar koşu hızını azaltmak.
Not: Daha sonra veri analiz hız farklılıkları için ayarlayabilirsiniz.
- gereken hız azaltmak ve bu not etmeyi unutmayın. Tutarlı adım döngüleri elde kadar koşu hızını azaltmak.
- Fare sürekli yürüyen bir kez video kayıt başlangıç (Yani, tutarlı bir tempoda yürüyüş, değil yetiştirme veya yan yana dokuma). 8-12 ardışık adım döngüleri kaydetmiş olduğunuz kadar kayıt devam etmek. Kaydedilen her video için kayıt hızı, koşu bandı ve fare yan. Kayıt tamamlandığında,
- treadmill kapalı ve fareyi onun kafes dönmek. Diğer fareler tarafından geride kokuları gelen fareler davranışını değiştirebilir olarak koşu bandı iyice arasında kayıtlar temiz. Stresi azaltmak ve deri hasar için veri işaretleyicilerini çıkarmayın; Onları kendi başlarına kaldırmak fareler izin.
4. Analiz
- hareket analiz yazılımı kullanarak video işlemek.
Not: bizim deneylerde kullandık görüntüleme ve istatistiksel yazılım için tasarlanmış özel komut dosyalarını Dr. Nicolas Stifani tarafından yazılmış (Tablo malzemeleri görmek) bu. Aşağıdaki adımlar seçili hareket analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.- İşaretleri piksel koordinatlarını hulâsa--dan video ve Kalibrasyon video kullanarak, santimetre için piksel değerlerini dönüştürmek ve her karede ortak açıları hesaplamak.
- Başlangıcı ve böylece adım süresi ve uzunluğu hakkında bilgi edinme her adım döngüsünün sonuna tanımlamak.
- Öyle ki salıncak ve duruş 100 kare, sırasıyla temsil edilir adım döngüsü süresi 200 normalleştirilmiş çerçevelere normalleştirmek.
- Normalleştirilmiş çerçeveleri kullanarak hesaplama elektronik tablo yazılımı kullanarak veri analizi için kinematik parametreleri (bkz. Tablo malzeme).
Belirli bir ortak ortalama açısı kurmak, normalleştirilmiş çerçevesi içinde bütün açıları ortalamasını almak için
- :
Not: burada x, açı değerini temsil eden bir normalleştirilmiş verilen çerçeve ve n normalleştirilmiş çerçeve numarası temsil eder. - İçin belirli bir fare, belirli bir eklemin hareket aralığını kurmak için çıkarma normalleştirilmiş çerçeve kümesinde en büyük açıdan en küçük açı aşağıdaki gibi:
Hareket aralığını açı maksimum - açı minimum =.
Not: Burada en fazla açı ve açı en az olan normalleştirilmiş adım döngüsü içinde sırasıyla elde en büyük ve en küçük açılar. - RMS farkı belirtmek için ilk satır taban çizgisi kayıt ortalama açıdan deneysel her zaman noktasının çıkarma. Ardından, her fark Meydanı, tüm kareleri alınmış değerler ve karekök ortalama ortalamasını alır. Denklemi aşağıdaki gibidir:
Not: burada
ortalama açı kayıt; satır taban çizgisinden temsil eder. y deneysel her zaman noktasından ortalama açıyı ifade eder; n ve normalleştirilmiş kare sayısını temsil eder. Kök demek karesi alınmış (RMS) farkı olarak yürüyüş--dan temel recordings sapma değerlendirmek için kullanılan bir ölçü birimi.
- :
- Bilimsel grafik ve istatistik yazılım analiz ve (bkz: Malzemeler tablo) veri sunmak için kullanın.
ortalama açı kayıt; satır taban çizgisinden temsil eder. y deneysel her zaman noktasından ortalama açıyı ifade eder; n ve normalleştirilmiş kare sayısını temsil eder. Kök demek karesi alınmış (RMS) farkı olarak yürüyüş--dan temel recordings sapma değerlendirmek için kullanılan bir ölçü birimi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 kinematik yürüyüş analizi için kullanılan yordam, şematik bir gösterimidir. İlk, yansıtıcı işaretleri yaptı ve bir fare 5 anatomik noktalara yerleştirilmiş. Fareyi bir koşu bandı üzerinde yürüyor iken yürüyüş sonra kaydedilir. Hareket analiz yazılımı daha sonraki analiz için kinematik veri ayıklamak için kullanılır.
Şekil 2A -c kontrol CFA fare adım döngüsünde için bir hafta arayla aralıklı üç ardışık kayıt oturumları kaydedilen kalça, diz ve ayak bileği eklem açı temsil. Dalga biçimleri arasında örtüşme Sessions 1-3 adım döngüleri en az sapma gösterir. Şekil 2B -F kayıt oturumları 1-3 dan büyük yürüyen değişkenlik görüntülenen ikinci bir denetim CFA fare adım döngüsünü temsil eder. Adım döngüleri y ekseni kaydırılır rağmen dalga biçimleri şeklinde kayıtlar arasında tutarlı kalır. Fare yürüyüş için tipik değişkenlik bu düzeyidir.
Şekil 3A -c temsil adım döngüsünde bir fare üç ardışık kayıt oturumları üzerinde kaydedilen EAE ile. Orada ilk yürüyüş minimal değişiklikler ikinci kayıt oturumu, ama üçüncü oturum, yürüyüş derinden değişmiş üç eklem olmuştur. Kalça için önemli bir adım döngüsünde üzerinde düzleştirme, hareketinin önemli bir kayıp gösteren oluştu. Diz daha bükük ve daha az güçlü-e doğru uzatmak ve hayvanın vücut destek ağırlık haline gelmiştir. Ayak bileği eklemi, hareketleri aynı zamanda önemli ölçüde değiştirilmiş. Ayak dorsiflexion ve plantar fleksiyon swing (beyaz Masası) ve tutum (yeşil paneli) aşamaları, sırasında sırasıyla gecikiyor. Bu açıkları hayvan onun yetenek hem onun ayak salıncak aşamasında yükseltmek ve duruş aşamasında vücut İleri itmek için Engelli gibi bu eklem, kas güçsüzlüğü, işaret etmektedir.
Şekil 4 ' de aşağıdaki veri Fiander ve ark. yayınlanacaktır (2017) 26 iznine sahip. Verileri satır taban çizgisi26bütün zaman puan karşılaştırmak için tek yönlü tekrarlanan ölçüler ANOVA Holm-Sidak ile kullanarak birden çok karşılaştırmalar test analiz edildi. Ortalama açı (şekil 4A ve şekil 4 d), çeşitli hareket (şekil 4B ve şekil 4E) ve RMS fark (şekil 4 c ve şekil 4F) her zaman-yürüyüş ölçmek için noktada hesaplanan açıkları (n = 8 grup başına). Mevcut EAE deneyde DPI 14, kayıt ikinci hafta sonra klinik puanları başlangıcı oldu. CFA fareler ortalama diz açısı (şekil 4A) veya diz RMS fark (şekil 4 c) herhangi bir değişiklik gösterdi ama hareket aralığını diz küçük bir artış sergilemek [F(2,7) 5.871, p = 0.0083 =], DPI 16 ve 30 temel ( göre Rakam 4B). Bu küçük değişiklik CFA enjeksiyon kaynaklanan ağrı yansıtabilir. CFA hayvanların aksine büyük değişiklikler vardı diz EAE hayvanlar için ortalama açı için ortak [F(6,7) 11.08, p = < 0,0001] (şekil 4 d), hareket aralığı [F(6,7) 14.42, p = < 0,0001] (şekil 4E) ve RMS fark (şekil 4F). Ortalama açı EAE fareler daha yürüyüş sırasında fleksiyondayken diz olduğunu gösteren önemli ölçüde azaldı. Hayvanlar kendi vücut ağırlığı desteklemek için kendi diz eklemleri genişletmek mümkün olduğu gibi bu kas zayıflığı, göstergesi olabilir. Hareket aralığı da azalma, tekrar diz eklemi genişletmek için hayvanların bir yetersizlik nedeniyle muhtemelen. Diz RMS fark önemli artış EAE farelerde diz eklemi hareketlerini kendi temel kaydından önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir.
Şekil 5 verilerde tek yönlü tekrarlanan ANOVA Holm-Sidak ile 3.5 o 0 klinik bir skora tespit yürüyüş parametre değerleri, 0,5 - klinik puanları karşılaştırıldığında birden fazla karşılaştırma testi yöntemlerle analiz edildi. Bağlantılı analiz Spearman rho (ρ) kullanarak da gerçekleştirildi. Ortalama diz açısı (şekil 5A), çeşitli hareket (şekil 5B) ve RMS fark (şekil 5C) şiddetle klinik skorları ile ilişkili (p < 0,001). Eklem hareketleri ve klasik klinik puanlama arasındaki bu ilişkiler EAE fareler için motor açıkları değerlendirmek için kinematik yürüyüş analizi geçerliliğini kanıtlamak. Diz çeşitli hareket (şekil 5A) ve RMS fark (şekil 5C) önemli ölçüde azalmıştır 2.0 klinik bir skora başlayan (p< 0,05). Bu bulgular Engelli diz hareketleri için motor açıkları klinik puanları 2.0 alt tarafından algılanan katılmazlar öneririz. Ancak, diz ortalama açı (şekil 5B) 1.0 klinik bir skora başlayan azalma (p< 0,05). Bu diz hareket için ortalama açı üç önlemlerin en hassas olduğunu göstermektedir.
Resim 1 : Fare ile kayıt kinematik yürüyüş için şematik. Yansıtıcı işaretleri yapıldıktan sonra bunlar iliyak arması, Kalça eklemi, ayak bileği, metatarsofalanjiyal eklem ve dördüncü basamak ucuna yerleştirilir. Fareyi bir koşu bandı üzerinde yürüyor iken yürüyüş bir yüksek hızlı kamera tarafından kaydedilir. Hareket analiz yazılımı daha sonraki analiz için yürüyüş parametreleri ayıklamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Adım döngüsü Waveform CFA alınan iki denetim farelerde örneği
Beyaz ve yeşil arka salıncak ve duruş aşama sırasıyla temsil eder. 1 fare için kalça(a), (B) diz ve ayak bileği (C) adım döngüsü dalga biçimleri bir hafta arayla aralıklı 3 üst üste kayıt oturumları arasında birbirinin. 2 fare için kalça (D), (E) diz ve ayak bileği (F) adım dalga biçimleri deviate biraz birbirinden davranış yürüme doğasında değişkenlik nedeniyle döngüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Adım döngüsü dalga biçimleri ile EAE farelerde. Beyaz ve yeşil arka salıncak ve duruş faz, sırasıyla, bir hafta arayla aralıklı üç ardışık kayıt oturumları için temsil eder. 3rd kayıt oturumu, kalça(a), (B) diz ve ayak bileği tarafından (C) dalga biçimleri EAE hastalık ilerlemesi nedeniyle büyük ölçüde değişir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Ortalama açısı, çeşitli hareket ve kök ortalama kare kinematik verileri çözümlemek için kullanılır. Ortalama açı, çeşitli hareket ve RMS farklılıklar EAE farelerde motor açıkları ölçmek için hesaplanan. Ortalama diz açısı(a), çeşitli hareket (B) ve (C) RMS CFA fareler için nispeten sabit kaldı. EAE ile fareler Engelli diz ortalama açı (D), çeşitli hareket (E) ve (F) RMS gösterdi. Verileri ortalama ± standart sapma ifade edilir; p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001, fark gün sonrası aşılama (DPI) -2; # p < 0,05, en yüksek açığı fark. Başvuru 26 özgün yayıncılardan izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Ortalama diz açısı, çeşitli hareket ve RMS fark aralarındaki ilişkileri belirlemektir ile klinik skoru
Korelasyon analizi diz hareketleri üç kinematik ölçü ve iki yöntem karşılaştırmak için klinik puanları arasında gerçekleştirildi. Ortalama diz açısı(a), çeşitli hareket (B) ve (C) RMS fark şiddetle klinik skorları ile ilişkili. Ortalama diz açısı daha önce 1.0 klinik bir puanı düşürüldü iken diz çeşitli hareket ve RMS fark 2.0, klinik bir puan başında azalmıştır. Verileri ortalama ± standart sapma ifade edilir; p< klinik 0,05 fark Puan edinildi 0.0. Spearman rho (ρ), için *** p< 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farelerde EAE ile motor açıkları ölçme iki en yaygın yöntemleri klinik puanlama ve gecikme süresi bir rotarod27,28düşmek. Bu teknikler bazı sınırlamaları vardır. Her ne kadar rahat ve yaygın olarak kullanılan, klinik puanlama klinik puanları arasındaki farklar büyüklüğü değil, bilinen anlamı yalnızca sıralı düzeyinde veri verimli tarafından sınırlıdır. Klinik puanlama da motor açıkları yapısı hakkında kesin bilgi sağlamak duramayacak uğrar. Rotarod test klinik puanlama, bazı sınırlamalar artırır ama sadece genel motor koordinasyon ölçer ve yürüyüş belirli yönlerini ölçmek değil.
Buna karşılık, kinematik yürüyüş analizi hassas ölçü hareket, hareket ve ortalama açılar çeşitli eklemleri de aralığı da dahil olmak üzere belirli yönleri hakkında sağlar. Kalça ve diz eklem hareketleri MOG35-55 EAE fareler için ince açıkları, DPI9, yaklaşık 5-9 gün önce klinik belirtiler veya rotarod açıkları26başlangıcı tespit edildi. Bu açıkları klinik belirtiler tam bir iyileşme rağmen kalıcı ve rotarod açıkları26yokluğunda gözlendi. Önemlisi, son derece iyi omurilik26beyaz madde kaybı ile ilişkili RMS fark tarafından ölçülen ayak bileği hareketleri bozulmuş.
Birkaç metodolojik Puan özel anma hak: 1) ortak işaretleri doğru ve tutarlı yerleşimini çok önemli - çarpıntı; Kalça eklemi ve iliyak taç dikkatli bir şekilde tanımlanması gerekir 2) 8-12 adım geçer kayıtları elde etmek gereklidir. Bu adım döngüleri ortalama daha fazla analiz edilebilir bir temsilcisi ortalama adım döngüsünde üretir; 3) en iyi ışık koşulları veri işaretleyicilerini kayıtları açıkça görünür olmasını sağlamak için oluşturulmuş olmalıdır. İşaretleyicileri düzgün aydınlatılmış değil, bu birçok hareket analiz programı el ile izleme gerektiren işaretleri izlemek mümkün olacak gibi zahmetli bir süreç videoları digitizing yapabilirsiniz.
Bu teknik bir ek sınırlama, emek yoğun olmasıdır. Örneğin, kayıt ve 10 fareler bir grup verileri çözümlemek için yaklaşık 7.0-9.0 saat (h) toplam işlem sürer tahmin. 50 işaretleri (5-fare) alır 2.0 h. yapma davranışı yürüyüş kayıt fare veya bağımsız bir çift olarak yapılabilir. Bir çift çalışma fare başına yaklaşık 10 dakika sürer iken tek başına çalışıyor, bu fare, başına yaklaşık 25 min alır; Bu nedenle, 10 fareler kayıt 1,5 saat (çifti) 4.0 h (solo) alabilir. Son olarak, veri analizi ve grafik yaklaşık 3,5 h al. Bu teknik emek yoğun olmakla birlikte, hastalık mekanizmaların kinematik yürüyüş analizi tarafından sunulan potansiyel anlayışlar bu yatırım haklı hissediyorum. Seri ölçümler bir canlı fare--dan non-invaziv alınabilir gibi hastalık patoloji iyi davranış ilişkilendirir sahip yararlıdır. Ayak bileği kinematik ve Lomber spinal kord beyaz madde kaybı26arasında çevre mükemmel ilişki göz önüne alındığında, bu yöntem bir deney boyunca geçici profil demiyelinizasyon ve remyelination EAE farelerde tespit için kullanılabilir izin Kurtarma değerlendirilmelidir.
Yürüyüş analizi hindlimbs hareketini sınırlayan şiddetli felç tarafından karmaşıktır. Ancak, hatta ciddi felçli fareler (klinik skoru > 3.0) çoğu kez bir ölçüde ambulate mümkün. Bu gibi durumlarda, ön ayakları hayvan öne çekmek için kullanılır ve hangi kinematik yürüyüş analizi tarafından ölçülebilir hindlimb hareket oluşur. Şiddetli durumlarda bile, hala zaman içinde kurtarma hindlimb işlevinin ölçmek mümkündür. Sadece çok şiddetli vakalarda (klinik puanları ile hayvanların % 20 > 3.5 en yüksek hastalık, DPI 16-23) biz hindlimb hareketinin yararlı kayıtları elde etmek mümkün olmuştur. Yine de, bu hayvanlar genellikle DPI 30, o zaman noktada elde edilecek anlamlı kayıtları sağlayan bazı hindlimb işleviyle yeniden.
Bu tekniğin bir geleceğin uygulama kinematik veri hindlimb aynı anda electromyographic kayıtları ile hareket sırasında kaplin. Bu teknik ALS ve SCI fare modellerinde yapılmıştır ve kas aktivitesi, innervasyon ve yürüyüş ilişkisi aydınlatmak için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda daha ile birleştiğinde hedef MS ve odak EAE modelleri29,30 veya cuprizone kaynaklı demiyelinizasyon31de dahil olmak üzere daha fazla ayrı yürüyüş açıkları üretebilir demiyelinizasyon modelleri.
EAE farelerde eklem hareketleri ölçümü için tarif var teknikleri de yürüyüş zarar diğer bozukluklar için uygulanabilir. Yürüyüş farklı değişiklikler PD, SCI, ALS ve kontur8,9,10,11,13,14fare modeller için rapor edilmiştir. Örneğin, PD kemirgen modelleri azaltılmış adım uzunluğu ve hız, yürüme hızı32korumak için yükseltilmiş ahenk içinde kaynaklanan karakterizedir. Kinematik yürüyüş analizi bu nedenle hastalık mekanizmaları aydınlatmak ve potansiyel tedaviler bu modelleri kullanarak tanımlamak için güçlü davranış araçlar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar ifşa birşey yok bildirin.
Acknowledgments
Sid Chedrawe filme ile onun teknik yardım için kabul etmek istiyoruz. Bu eser MS Society of Canada (EGID 2983) fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
