Summary
Ce protocole vise à évaluer l’effet des facteurs pro - et anti - migratory sur la migration cellulaire dans une matrice de fibrine en trois dimensions.
Abstract
Actuellement, la plupart in vitro des modèles de la cicatrisation, notamment des essais de gratter bien établies, impliquent l’étude cell migration plaie fermeture et sur une surface à deux dimensions. Cependant, l’environnement physiologique dans lequel in vivo de cicatrisation se déroule est en trois dimensions plutôt que deux dimensions. Il devient de plus en plus évident que le comportement cellulaire diffère grandement en deux dimensions par rapport à des environnements en trois dimensions ; par conséquent, il y a un besoin pour plus physiologiquement pertinents en vitro modèles pour l’étude des comportements de migration cellulaire dans la fermeture de la plaie. La méthode décrite ici permet l’étude de la migration cellulaire dans un modèle en trois dimensions qui reflète mieux les conditions physiologiques que tests gratter deux dimensions précédemment établies. Ce modèle vise à évaluer l’excroissance cellulaire par l’intermédiaire de l’examen de la migration cellulaire loin un sphéroïde de corps incorporé dans une matrice de fibrine en présence de facteurs de pro - ou anti - migratory. En utilisant cette méthode, excroissance cellulaire du corps sphéroïdes dans une matrice tridimensionnelle peut être observée et est facilement quantifiable au fil du temps via fond clair microscopie et analyse d’une partie du corps sphéroïde. L’effet de facteurs pro-migrateurs et/ou inhibitrices sur la migration cellulaire peut également être évaluée dans ce système. Cette méthode fournit aux chercheurs avec une méthode simple d’analyse de la migration cellulaire dans la plaie tridimensionnelle associée matrices in vitro, ce qui accroît la pertinence de in vitro cellule études avant l’utilisation d’in vivo de l’animal modèles.
Introduction
La cicatrisation est un processus complexe qui se traduit par la restauration de l’intégrité des tissus après une blessure. Cette démarche est subdivisée en quatre étapes qui se chevauchent par hémostase, inflammation, prolifération et le remodelage, qui font chacun l’objet par une combinaison complexe de signaux solubles, interactions cellule-matrice et les cellules communications. 1 , 2 l’orchestration de ces repères gère une multitude de réactions cellulaires dans la cicatrisation des plaies dont, surtout, la migration cellulaire. 3 , 4 la migration cellulaire est un processus très dynamique dépendant sur les propriétés biochimiques et biophysiques du milieu extracellulaire et les phénotypes cellulaires. 5 cellules sonder en permanence leur environnement de matrice extracellulaire par des voies induite par l’intégrine ; Ce processus permet aux cellules de détecter une large gamme de propriétés de la matrice dont la topographie, de rigidité et de confinement. Bidimensionnelle (2D) analyse de la migration cellulaire démontre que la migration est entraînée par formation de lamellipodia à la pointe grâce à la génération de faisceaux de filaments d’actine. Formation subséquente des adhérences focales à la fine pointe, en combinaison avec l’actomyosine piloté par la contraction et la rentrée sur le bord de fuite, pousse la cellule vers l’avant. 6 la migration cellulaire tridimensionnelle (3D) n’est actuellement pas bien comprise, cependant, des études récentes démontrent que la migration 3D est nettement différente de l’afore décrit le mécanisme en 2D et est probablement entraînée par des mécanismes altératif. Par exemple, des études récentes par Petrie et al. démontré que, en fonction des propriétés de l’ECM, cellules dans des matrices 3D peuvent basculer entre lamellipodium et lobopodium par les mécanismes de la migration. 7 migration cellulaire étant un élément essentiel de la réponse de cicatrisation, des modèles 3D de la migration cellulaire sont essentiels pour la compréhension des réponses physiologiques à divers stimuli pendant la cicatrisation. Bien que le comportement migrateur cellule sur une surface 2D s’est avéré varient considérablement d’un migration dans des matrices 3D, des modèles in vitro plus actuels de la migration cellulaire durant la processus, y compris le dosage zéro bien établi, de cicatrisation utilisent 2D cultures monocouches. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 tests développés plus récemment ont utilisé une matrice 3D, mais encore la culture des cellules dans une monocouche sur le dessus de la matrice, ce qui limite la possibilité de véritablement récapituler la tridimensionnalité de l’environnement de la cellule in vivo. 15
Le but de la méthode décrite ici est d’étudier la migration cellulaire dans un modèle 3D physiologiquement pertinent, plutôt que sur une surface 2D, afin d’acquérir une compréhension plus robuste de réponses de migration associés avec les stimuli appliqués. Cette méthode permet l’évaluation de la migration cellulaire dans une matrice de caillot de fibrine 3D en présence de facteurs qui activer ou inhiber les voies associés à la migration cellulaire. Une matrice de fibrine a été choisie pour cette méthode en raison du rôle critique fibrine joue dans les premiers stades de la cicatrisation des plaies ; après une blessure, un caillot de fibrine est formée dans les environnements de la plaie pour enrayer la perte de sang et sert comme un échafaudage pour l’infiltration de la cellule initiale au cours de la réparation des tissus et le remodelage. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 en outre, fibrine est utilisé en clinique comme mastic chirurgical et la composition de l’étanchéité a été liée à la migration cellulaire et ultimate résultats de guérison. Une étude antérieure par Cox et al. a étudié la migration des fibroblastes avec caillots de fibrine composés de fibrine variable et des concentrations de thrombine pour optimiser une fibrine. Dans ces études, la migration des cellules hors les caillots de fibrine sur la vaisselle en plastique a été quantifiée. 20 nous présentons ici une méthode qui permet à la quantification de la migration des cellules dans l’environnement 3D de fibrine. Tandis que la méthode décrite dans le présent protocole spécifiquement utilise fibrine, ce modèle peut facilement être modifié pour utiliser des matériaux à matrice alternative comme vous le souhaitez, comme le collagène ou d’autres matrices 3D. En outre, nous présentons l’utilisation des sphéroïdes de fibroblastes dans ce test parce que la migration des fibroblastes dans le lit de la plaie est d’une importance primordiale à la synthèse de la matrice extracellulaire et réparation/remodelage des tissus. Cependant, au cours de la réparation processus neutrophiles sont le premier type de cellule à migrer dans le lit de la plaie, suivi par les macrophages. Fibroblastes commencent alors à s’infiltrer dans l’environnement de la plaie environ 48 heures après la lésion initiale, au début de la phase proliférative de la processus de cicatrisation. 19 ce dosage peut être facilement modifié pour inclure les neutrophiles, les macrophages ou autres types de cellules afin d’évaluer l’incidence des altérations de structure de caillot de fibrine sur migration de ces types de cellules. 21
Pour implémenter ce dosage, tout d’abord, un sphéroïde de fibroblastes se forme à l’aide d’une modification des techniques décrites précédemment pour la culture de cellules souches. 22 la sphéroïde de fibroblastes est transférée par la suite dans une matrice de fibrine 3D et excroissance ensuite facilement surveiller et quantifié sur plusieurs jours. Ce protocole prend en compte la 3D des systèmes physiologiques en incorporant des sphéroïdes cellule 3D au sein d’une matrice de fibrine, évitant ainsi les limitations en pertinence provoquée par un en utilisant une surface de croissance 2D avec une monocouche de cellules au comportement migratoire de modèle, tandis que en permettant l’évaluation du comportement des cellules dans un milieu hautement contrôlé en vitro .
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Protocol
1. jour 1 : cellule et préparation du réactif
Remarque : toutes les préparations cellulaires et réactif doivent être effectuée sous une hotte pour prévenir la contamination des échantillons de sécurité biologique.
- Chaud filtré Dulbecco ' s Modified Eagle ' s moyen (DMEM), sérum fœtal (SVF), L-glutamine et la pénicilline/streptomycine dans un bain-marie à 37 ° C.
- Médias néonatale fibroblastes dermiques humains (HDFn) Prepare par complétant réchauffement DMEM avec 10 % FBS, pénicilline/streptomycine de 1 % et 1 % L-glutamine.
- Décongeler un flacon de gelée HDFns et centrifuger pendant 8 min à 200 x g à éliminer le milieu de la cryoconservation. Remettre en suspension des cellules dans des milieux de HDFn préparés à une densité de 1 x 10 6 cellules/mL et graines dans un flacon de culture de T-75.
- Ballon de Place dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO 2) pour permettre la prolifération cellulaire.
- Store HDFn médias à 4 ° C.
- Préparer les pro - et anti - migratory réactifs si nécessaire.
2. Jour 3 : Préparation de sphéroïde
- effectuez les opérations suivantes dans une hotte de culture pour éviter la contamination des échantillons de.
- Lorsque les cellules atteignent 80 % confluence, aspirer les médias et ajouter 5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA. Fiole de magasin dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min détacher complètement les cellules de la surface de la fiole.
- Ajouter 5 mL de médias réchauffée dans le ballon pour neutraliser la trypsine.
- Dans un tube de microcentrifuge, mélanger 10 μL de bleu Trypan et 10 μl de la suspension cellulaire.
- Centrifuger la suspension cellulaire original pendant 8 min à 200 x g.
- Tandis que la suspension cellulaire est être centrifugée, ajouter 10 μL de la suspension cellulaire bleu Trypan à un hémocytomètre et effectuer un comptage cellulaire.
- Après centrifugation, aspirer les médias sans déloger le culot cellulaire. Resuspendre le culot de cellules à une concentration de 1,25 x 10 5 cellules/mL.
- Ajouter 5 mL de sérum physiologique stérile tamponnée au phosphate (PBS) au fond d’une boîte de Pétri pour maintenir un environnement hydraté durant la croissance de sphéroïde de 10 cm.
- Inverser le couvercle de la boîte de Pétri. Ajouter quelques 20 μL gouttes de la suspension de cellules sur la surface intérieure du couvercle de la boîte de Pétri.
- Rapidement inverser le couvercle à nouveau et remettez-la sur le fond du plat, en veillant à ne pas déloger les gouttes de pendaison. la figure 1 illustre les gouttes suspendues correctement formé.
- Soigneusement placer la capsule dans un incubateur à 37 ° C et laisser les sphéroïdes à grandir dans un accrochage déposer culture pendant une période de 72 h.
3. Jour 6 : Intégrer les sphéroïdes dans matrice 3D
- effectuez les opérations suivantes dans une hotte de culture pour éviter la contamination des échantillons de.
- Pour la formation de la première couche de fibrine, créez une solution de caillot d’un volume suffisant d’ajouter 100 μL de solution caillot / puits puits autant que nécessaire (1 sphéroïde / puits). Les caillots sont composés de 10 % 10 X HEPES tampons par volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), fibrinogène humain 2 mg/mL et thrombine alpha humain de 0,1 U/mL. Le reste du volume caillot se compose de l’eau ultrapure.
- Ajouter la thrombine dernière et rapidement ajouter solution aux puits désirées dans une plaque de 48 puits afin d’empêcher la polymérisation avant d’être ajouté aux puits de caillots.
- Doucement agiter/robinet plaque puits pour s’assurer que mélange de caillot de fibrine est enduit tout le bien et puis placez la plaque bien dans l’incubateur pendant 1 h permettre à la couche inférieure de caillot à polymériser. Ne secouez pas la plaque bien assez dur pour induire la formation de bulles ; plaque de roche simplement que nécessaire jusqu'à ce que l’intégralité du puits est enduite. Si de plus grands volumes de caillot sont utilisées, cette étape n’est peut-être pas nécessaire.
- Transfert des sphéroïdes à la couche de fibrine.
Plaque
- enlever le puits et la boîte de Pétri contenant des sphéroïdes à la pendaison abandonner la culture de l’incubateur et examinez les sphéroïdes sous un microscope. Puis placez le plat sur le capot de la culture.
- Inverser soigneusement le couvercle de la boîte de Pétri pour permettre l’accès à la pendaison drop cultures.
- à l’aide d’une aiguille de 21 G attachée à une seringue de 1 mL, transvaser avec soin une goutte du couvercle inversé dans le centre de chaque bien, en prenant soin de ne pas pour percer la couche de fibrine polymérisée revêtement du fond du puits. Pour transférer efficacement la chute, tirez lentement sur la chute dans l’aiguille. Arrêter de tirer le piston arrière dès que la chute de l’ensemble est à l’intérieur de l’aiguille ; tirant la baisse trop loin peut introduire des bulles d’air, qui peuvent perturber le transfert efficace de sphéroïde ou imagerie ultérieure.
- Examiner la plaque bien sous microscope pour s’assurer que les sphéroïdes ont correctement transférées dans des puits tout désirées.
- Pour la formation de la deuxième couche de fibrine, créez une autre solution de caillot à l’aide de la même préparation que ci-dessus pour la création de la première couche de fibrine (étape 3.2). Soigneusement distribuer 100 μL sur chaque goutte contenant du sphéroïde et examiner sous un microscope pour vérifier que les sphéroïdes sont toujours intacts et n’ont pas été poussés jusqu’aux bords des puits.
- Retourner la plaque bien dans l’incubateur et autoriser la deuxième couche polymériser pendant 1 h.
4. Jour 6 : Ajout de Pro-migrateurs ou de facteurs inhibiteurs
- médias HDFn chaud à 37 ° C.
- Effectuez les opérations suivantes dans une cagoule pour éviter la contamination.
- Préparer les milieux pour chaque groupe, y compris les concentrations appropriées d’agents pro/anti-migratory à évaluer.
- Enlever la plaque bien de l’incubateur et le placer dans une hotte de culture.
- Ajouter 500 μl de support standard dans chaque puits du groupe témoin sphéroïde, 500 μL d’inhibiteur médias dans chaque puits du groupe inhibées par migration sphéroïde et 500 μL des médias pro-migrateurs dans chaque puits du groupe migration améliorée sphéroïde.
- Remettez la plaque bien dans l’incubateur.
- Médias de changement chaque 48 h.
5. Jours 6-9 : évaluation de la Migration cellulaire et la prolifération
- Image sphéroïdes microscope à fond clair immédiatement après l’ajout de médias (0 h) et ensuite toutes les 24 h pendant 72 h. facultatif : à chaque point dans le temps, prendre une image de z-pile afin de déterminer si migration se produit dans des plans à l’extérieur le principal domaine d’activité. Dans notre expérience, cela ne fonctionne pas ; Toutefois, il est utile de s’assurer que c’est le cas dans chaque expérience.
- Utilisation ImageJ pour déterminer l’excroissance cellulaire dans chaque puits en analysant les pourcentages d’augmentation dans la zone pour chaque ellipsoïde en traçant la bordure de cellule pour chaque ellipsoïde à chaque point de temps successifs et en utilisant la " mesure " fonction pour obtenir le domaine.
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Representative Results
Culture de l’ellipsoïde peut être utilisée pour évaluer correctement l’effet d’agents pro et anti-migrateurs sur la migration des fibroblastes in vitro
Sphéroïdes de fibroblastes 3D peuvent être formés par chute de culture en suspension sur une période de 72 h (Figure 1). Après la période de culture, sphéroïdes sont intégrés au sein de la matrice de caillot et imagés microscope à fond clair (Figure 2). Les premiers secteurs des sphéroïdes (représentés dans la figure comme les zones délimitées par des frontières blancs) ont été déterminées à l’aide de ImageJ et utilisée comme point de référence pour déterminer le degré d’excroissance cellulaire ultérieures sur les cadavres de sphéroïde. Des mesures de superficie moyenne initiale pour les sphéroïdes étaient déterminés à 4,3 x 104 μm2 ± 1,1 × 104 μm2 pour les sphéroïdes contrôle, 4,4 x 104 μm2 ± 1,1 × 104 μm2 pour la pro-migrateurs sphéroïdes et 4,5 x 104 ± 7,7 x 103 μm2 pour l’anti-migrateurs sphéroïdes. Médias contenant des pro - ou anti - migratory facteurs a été ajouté à la formation de caillots contenant du sphéroïde, et excroissance cellulaire du corps initial sphéroïde a été photographié toutes les 24 h, avec des images finales prises 72 h après l’ajout du support d’origine (Figure 3).
À l’issue de l’expérience, croissance de sphéroïde au fil du temps a été analysée à l’aide de ImageJ pour calculer les changements dans la région de sphéroïde pour chaque échantillon. Tel qu’illustré à la Figure 3, le bord extrême de l’amas de cellules à chaque point dans le temps a été utilisé pour déterminer le degré précis de conséquence de cellules. Nous attendons que les taches d’out-of-focus illustrés à la Figure 3 sont des débris cellulaires, et nous ne comptons pas cela dans notre quantification. Images en taille réelle montrent une bordure de cellule claire et continue qui sortent d’un corps sphéroïde ; C’est cette frontière qui est tracée lors de la détermination de l’excroissance. L’excroissance cellulaire a été quantifiée en normalisant la zone de l’excroissance cellulaire par rapport à la zone de corps sphéroïde initial à t = 0 h et puis en exprimant la croissance en pourcentage de la zone d’origine sphéroïde. Quantification de l’excroissance de la cellule au cours de la période de 72 h révèle que sphéroïdes exposés à un agent pro-migrateurs montrent un degré sensiblement accru de migration loin du corps de sphéroïde original par rapport aux sphéroïdes exposés à un agent de migration-inhibiteur et sphéroïdes de contrôle exposés aux médias standard (p < 0,0001, Figure 4). À l’inverse, sphéroïdes exposés à un agent anti-migrateur montrent une baisse significative degré de migration loin du corps original de sphéroïde comparativement pour contrôler les sphéroïdes (p < 0,0001).
À titre de comparaison, nous avons fourni un exemple d’un dosage zéro (Figure 5). Ce test a été réalisé par ensemencement des fibroblastes à 500 000 cellules/cm2 sur 24 puits-plaques recouvertes de fibrinogène de 2 mg/mL. Fibroblastes étaient autorisés à se développer pendant la nuit. La surface du bien est puis l’a gratté avec un embout de la pipette, et la migration cellulaire dans le plan de montage a été photographiée pendant 24 heures. Comme indiqué dans les images représentatives présentés dans la Figure 5A, il y a des limites à ce test ; rayures ne sont pas très reproductibles et dans certains cas, les limites ne sont pas clairement délimitées. Toutefois, les tendances globales de la migration en présence de facteurs de pro - et anti - migratory sont les mêmes que ceux qui sont présents dans l’analyse 3D sphéroïde, malgré la variabilité susmentionnée et les différences dans les modes de migration. Il est à noter que les taux de migration sont plus rapides dans l’essai de gratter 2D, comparé au test 3D sphéroïde. La fermeture a été le plus rapide en présence de l’agent pro-migrateurs et tous les échantillons cultivés en présence de l’agent pro-migrateurs étaient complètement fermées sous 24h.
Figure 1 : Des fibroblastes dermiques humains dans un accrochage drop culture. Les cellules sont laissés dans un accrochage abandonner la culture pendant 72 h à induire la formation de sphéroïde. Un haut (A) et (B) vue latérale de la pendaison baisse de culture sont présentés. (C) schéma illustrant la vue de côté de formation sphéroïde dans une goutte de suspension. La ligne noire représente le haut de la plaque, la sphère rose représente les médias et les sphères violettes représentent les cellules dans l’ellipsoïde. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Aspect de sphéroïde après incorporation initiale dans la matrice de fibrine (t = 0 h après addition des médias) image microscope à fond clair à un grossissement de 10 X. (A, D) Sphéroïde de contrôle ; (B, E) Sphéroïde exposé à un agent anti-migrateur dans les médias ; (C, F) Sphéroïde exposé à l’agent pro-migrateurs dans les médias. Images sont affichées avec (D-F) et sans (A-C) blanc lignes qui indiquent les frontières utilisées pour déterminer la zone de l’excroissance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Apparition de sphéroïde après 72 h imagée microscope à fond clair à un grossissement de 10 X. (A, D) Sphéroïde de contrôle ; (B, E) Sphéroïde exposé à un agent anti-migrateur dans les médias ; (C, F) Sphéroïde exposé à l’agent pro-migrateurs dans les médias. Images sont affichées avec (D-F) et sans (A-C) blanc lignes qui indiquent les frontières utilisées pour déterminer la zone de l’excroissance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Croissance de sphéroïde plus de 72 h. Les agents Pro-migrateurs et anti-migrateurs dans les médias ne semblent pas un impact significatif surmigration des fibroblastes et la prolifération dans des environnements 3D. N = 3/groupe ; * représente p < 0,0001. Barres d’erreur représentent des écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Comparaison d’essai normalisé de gratter 2D. (A) des images représentatives de la migration cellulaire lors d’un test standard de gratter pendant 24 heures. Les fibroblastes ont été cultivées dans un milieu conditionné avec pro - ou anti - migratory facteurs et différences de fermeture scratch ont été quantifiées au fil du temps. (B) fermeture pourcentage au fil du temps pour les fibroblastes cultivés en contrôle, pro-migrateurs, ou les médias anti-migrateurs. Bien qu’il y a des différences dans les modes de migration présente dans ce test 2D vs le test 3D sphéroïde, tendances de la migration globale restent cohérentes. N = 3/groupe ; * représente p < 0,05. Barres d’erreur représentent des écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole permet l’examen de la migration cellulaire dans la cicatrisation des plaies entraînées SEGDA via un modèle 3D in vitro . Une étape cruciale dans la bonne exécution de la procédure est le bon développement des sphéroïdes de fibroblastes ; la concentration cellulaire au cours de la préparation a été optimisée pour donner une concentration initiale de 2 500 cellules/drop, permettant des sphéroïdes à forme fiable sur une période d’incubation de 72 h. Si un nombre suffisant de cellules est utilisé, les sphéroïdes peuvent s’agrègent pas efficacement et peuvent se défassent à être transféré et incorporées dans les couches de la fibrine. Si différents types de cellules sont utilisées, la concentration cellulaire initial et/ou sphéroïde temps de maturation peut-être être ajustés afin d’obtenir la formation sphéroïde cohérentes et stables. Pour les types de cellules qui prolifèrent plus lentement que les fibroblastes, une concentration beaucoup plus élevée de cellule initiale peut être nécessaire pour assurer la formation sphéroïde correcte dans le délai de 72 heures. Les cellules ne doivent pas rester dans un accrochage déposer plus de 72 heures en raison de l’impossibilité de changer les médias sur les sphéroïdes tandis que dans la culture de la culture. Différences dans la taille initiale de sphéroïde sont attendus en raison de la variabilité biologique inhérente ; Nous abordons cette variabilité par formation sphéroïde en commençant par un nombre constant de cellules afin de minimiser autant que possible des différences de taille et en normalisant la croissance au fil du temps afin de permettre des comparaisons des données.
Le défi principal pour la mise en œuvre de cette méthode est le transfert des sphéroïdes d’une pendaison déposez la culture dans la matrice du caillot. Ce protocole utilise une seringue et une aiguille pour aspirer la gouttelette contenant du sphéroïde du couvercle de la boîte de Pétri inversé, mais d’autres méthodes, telles que l’utilisation de pinces ou de micropipettes attachés à pointes taillées, peuvent également être appliquées pour transférer efficacement le sphéroïdes de traîner la goutte à la matrice. Sphéroïdes peuvent être transférés de façon fiable en tirant sur le piston de la seringue dos légèrement avant de transférer la goutte et en veillant à ce que la goutte est aspirée dans l’aiguille lentement afin que les bulles de gaz ne sont pas introduits dans la goutte. Le piston de la seringue doit seulement être tiré vers l’arrière juste assez pour intégrer la goutte toute l’aiguille ; tirant vers l’arrière tout encore va également introduire des bulles et interférer avec le transfert fiable des sphéroïdes dans les puits de la plaque bien. Spécialisé suspension drop culture plaques peuvent également être utilisés afin de simplifier la culture sphéroïde, mais sont un moins coût efficace les moyens de le faire que d’utiliser simplement un plat standard.
Au cours de la cicatrisation en vivo, les fibroblastes qui envahissent la région de la plaie produisent des sérines protéases qui entraînent dégradation de matrice de fibrine. Ces cellules synthétisent par la suite la nouvelle matrice extracellulaire, composée principalement de collagène, afin de réparer les tissus endommagés. 23 ce mécanisme de migration permet invasion contrôlée, qui n’est pas capturée par notre méthode et représente une limitation du système. Il convient également de noter que les fibroblastes utilisés dans cette méthode seront sécrètent des protéases qui auraient, au fil du temps, dégradent le réseau de fibrine ; par conséquent, si à long terme (> 72 heures) des études de migration sont souhaitées, inhibiteurs de la protéase, tels que l’aprotinine, devraient figurer dans les milieux de culture cellulaire.
Malgré ces limites, cette méthode fournit une méthode simple, rentable et reproductible permettant d’étudier les 3D cell migration in vitro. Offrir un environnement plus physiologiquement pertinent que les modèles 2D couramment utilisés, analyse de la croissance dans le modèle 3D décrit ci-après conservant l’analyse franche fourni par les modèles 2D. Sphéroïdes sont faciles à visualiser le microscope simple phase ou fond clair et, si vous le souhaitez, cette méthode peut facilement être modifiée pour une utilisation en microscopie de fluorescence par marquage fluorescent des membranes cellulaires et les protéines de la matrice. Ce protocole utilise des fibroblastes dermiques humains néonatales en raison du rôle de la migration des fibroblastes en tissu réparation/rénovation. Si vous le souhaitez, neutrophiles, les macrophages, les kératinocytes ou autres types de cellules pourraient être utilisés dans ce test pour évaluer comment des altérations dans la structure de caillot de fibrine affectent la migration des autres types de cellules impliquées dans la cicatrisation des plaies. Le matériel 3D peut-être également être modifié au besoin ; Selon l’application désirée, collagène ou autres matériaux de matrice 3D peut être utilisé en remplacement d’une matrice de fibrine afin de fournir un modèle physiologiquement pertinent. Un modèle utile pour l’étude de la migration cellulaire à plus long terme dans un environnement de type plaie pourrait être obtenu avec ce protocole en utilisant les kératinocytes et de collagène au lieu de fibroblastes et de fibrine. Les méthodes décrites aussi permettent plus de souplesse et de rentabilité dans la migration cellulaire et enroulé de guérison des études par le biais de la mise en œuvre d’un modèle physiologiquement pertinents en vitro plutôt que nécessitant un travail immédiat en vivo suite classique bidimensionnelle in vitro les études.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Financement de ce travail a été fourni par le biais de l’American Heart Association (16SDG29870005) et la North Carolina State University Research et le financement de démarrage de l’Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
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