Summary
Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van de factoren van de pro - en anti - migratory op cel migratie binnen een driedimensionale fibrine-matrix.
Abstract
Momenteel de meeste in vitro modellen van wondgenezing, zoals gevestigde kras testen, betrekken studeren cel migratie en wond sluiting op twee-dimensionale oppervlakken. De fysiologische omgeving in welke in vivo wond genezing plaatsvindt is echter driedimensionale in plaats van twee-dimensionale. Het wordt steeds duidelijker dat cel gedrag verschilt sterk in tweedimensionale vs. driedimensionale omgevingen; Daarom is er behoefte aan een meer fysiologisch relevante in vitro modellen voor het bestuderen van de cel migratie gedrag in de wond sluiting. De hierin beschreven methode zorgt voor de studie van de cel migratie in een driedimensionaal model dat beter fysiologische omstandigheden dan tevoren vastgelegde tweedimensionale kras testen weerspiegelt. Het doel van dit model is te evalueren cel uitgroei via het onderzoek van de cel migratie van een sferoïde lichaam ingebed in een matrix van fibrine in aanwezigheid van pro - of anti - migratory factoren. Met behulp van deze methode, cel uitvloeisel van het lichaam sferoïde in een drie-dimensionale matrix kan worden waargenomen en na verloop van tijd via helderveld microscopie en analyse van sferoïde lichaamszone gemakkelijk meetbaar is. Het effect van pro-trekkende en/of remmende factoren op cel migratie kan ook worden geëvalueerd in dit systeem. Deze methode biedt onderzoekers met een eenvoudige methode voor het analyseren van cel migratie in driedimensionale wond verbonden matrices in vitro, waardoor de relevantie van in vitro cel studies voorafgaand aan het gebruik van in vivo dier modellen.
Introduction
Wondgenezing is een complex proces dat leidt tot het herstel van weefsel integriteit na letsel. Dit proces is onderverdeeld in vier overlappende stadia omsloten door hemostase, ontsteking, proliferatie en remodeling, die elk geregeld zijn door een complexe combinatie van oplosbare signalen, cel-matrix interacties en cel-cel communicatie. 1 , 2 de orkestratie van deze signalen regelt een veelheid van cellulaire reacties in de wondgenezing en bovenal cel migratie. 3 , 4 cel migratie is een zeer dynamisch proces afhankelijk van zowel cellulaire fenotypes en de biochemische en biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix milieu. 5 cellen voortdurend sonde hun milieu van de extracellulaire matrix door middel van integrine-gemedieerde trajecten; Dit proces maakt cellen te voelen van een breed scala van matrix eigenschappen met inbegrip van de topografie, stijfheid en opsluiting. Tweedimensionale (2D) analyse van cel migratie blijkt dat migratie wordt gedreven door lamellipodia formatie op geavanceerde kennisgebieden door middel van de generatie van actine-filament-bundels. Latere vorming van focal verklevingen op geavanceerde kennisgebieden, in combinatie met actomyosine gedreven contractie en intrekking bij de afvallende flank, rijdt de cel uit. 6 de cellulaire migratie three-dimensional (3D) op dit moment niet goed wordt begrepen, recente studies tonen echter aan dat 3D migratie is beduidend anders dan de hierboven mechanisme in 2D beschreven en waarschijnlijk door alteratief mechanismen gedreven wordt. Bijvoorbeeld, recente studies door Petrie et al. aangetoond dat, afhankelijk van de eigenschappen van de ECM, cellen in 3D-matrices tussen lamellipodium en lobopodium gedreven mechanismen van migratie schakelen kunnen. 7 omdat cel migratie een essentieel onderdeel van de wond genezing reactie is, 3D-modellen van cel migratie zijn cruciaal voor het begrip van fysiologische reacties op verschillende stimuli tijdens de wondgenezing. Hoewel cel trekgedrag op 2D oppervlakken is aangetoond dat variëren sterk van migratie in 3D-matrices, meest recente in vitro modellen van cel migratie tijdens het genezingsproces, met inbegrip van de gevestigde kras assay, wond gebruiken 2D enkelgelaagde culturen. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 meer onlangs ontwikkelde testen hebben een 3D matrix gebruikt, maar nog steeds cultuur cellen in een enkelgelaagde op de top van de matrix, dus de beperking van de mogelijkheid om echt recapituleren de driedimensionaliteit van de cel milieu in vivo. 15
Het doel van de hier beschreven methode is om te studeren cel migratie in een fysiologisch relevante 3D-model, in plaats van op een 2D ondergrond, om een meer robuuste inzicht van migratie reacties die zijn gekoppeld aan de toegepaste prikkels. Deze methode zorgt voor de evaluatie van cel migratie binnen een 3D fibrine clot matrix in aanwezigheid van de factoren die activeren of remmen trajecten die is gekoppeld aan cel migratie. Een matrix van fibrine werd gekozen voor deze methode als gevolg van de kritische rol van fibrine in een vroeg stadium van de wondgenezing; volgende letsel, een fibrine clot wordt gevormd binnen wond omgevingen te vloeien bloedverlies en fungeert als een steiger voor de eerste cel infiltratie tijdens weefselherstel en remodeling. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 bovendien fibrine klinisch als een chirurgische sealant wordt gebruikt en de samenstelling van de mastieken is gebonden aan cel migratie en ultimate genezing van resultaten. Een eerdere studie door Cox et al. fibroblast migratie met fibrine stolsels bestaat uit verschillende fibrine en trombine concentraties met het oog op het optimaliseren van een fibrine-sealant onderzocht. Migratie van cellen uit fibrine stolsels op kunststof gerechten werd in deze studies gekwantificeerd. 20 hier presenteren we een methode waarmee de kwantificering van de migratie van de cellen binnen de 3D fibrine-omgeving. Terwijl de specifiek in dit protocol beschreven methode fibrine gebruikt, kan dit model eenvoudig worden aangepast voor het gebruik van alternatieve matrix materialen zoals gewenst, zoals collageen of andere 3D-matrices. Daarnaast presenteren wij het gebruik van de fibroblast spheroïden in deze test omdat fibroblast migratie in het bed van de wond van het allergrootste belang voor de synthese van de extracellulaire matrix en reparatie/remodelleren van weefsel is. Echter, tijdens de reparatie proces neutrofielen zijn het eerste celtype migreren naar het bed van de wond, gevolgd door macrofagen. Fibroblasten beginnen dan te infiltreren in de omgeving van de wond ongeveer 48 uur na de eerste schade, aan het begin van de proliferatieve fase van de wond genezingsproces. 19 deze test kan eenvoudig worden aangepast om op te nemen van neutrofiele granulocyten, macrofagen, of andere celtypes te evalueren hoe wijzigingen in fibrine clot structuur van invloed zijn op migratie van deze celtypes. 21
Ter uitvoering van deze bepaling, ten eerste, een sferoïde fibroblast gevormd met behulp van een wijziging van de technieken beschreven voor cultuur van de cel van de stam. 22 de fibroblast sferoïde wordt vervolgens omgezet in een 3D fibrine-matrix, waarna uitgroei kan worden gemakkelijk gecontroleerd en gekwantificeerd gedurende meerdere dagen. Dit protocol rekening wordt gehouden met de 3D van fysiologische systemen door inbedding 3D cel spheroïden binnen een matrix van fibrine, dus het vermijden van de beperkingen in relevantie teweeggebracht door het gebruik van een 2D groei oppervlak met een enkelgelaagde cel naar model trekgedrag, terwijl toch toe te staan voor de evaluatie van de werking van de cel in een zeer gecontroleerde in vitro -omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: cel en de bereiding van het reagens
Opmerking: alle cel en reagens voorbereiding dient te worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast ter voorkoming van verontreiniging van monsters.
- Warm gefilterd Dulbecco ' s gewijzigd Eagle ' s Medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicilline/streptomycine in een waterbad 37 ° C.
- Voorbereiden neonatale menselijke dermale fibroblast (HDFn) media door haar aan te vullen opgewarmd DMEM met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 1% L-glutamine.
- Ontdooi een flesje van bevroren HDFns en centrifuge voor 8 min. op 200 x g te verwijderen cryopreservatie medium. Resuspendeer de cellen in de voorbereide HDFn media bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen/mL en zaad in een maatkolf van het cultuur T-75.
- Plaats de kolf in een incubator (37 ° C, 5% CO 2) dat de celproliferatie.
- Winkel HDFn media bij 4 ° C.
- Pro - en anti - migratory reagentia bereiden desgewenst.
2. Dag 3: Sferoïde voorbereiding
- de volgende uitvoeren in een cultuur kap ter voorkoming van verontreiniging van monsters.
- Wanneer cellen bereikt 80% confluentie, gecombineerd media en voeg 5 mL van 0,25% trypsine-EDTA. Winkel destillatiekolf in een incubator 37 ° C gedurende 5 minuten om volledig los van cellen van het oppervlak van de kolf te.
- 5 mL van verwarmde media Voeg aan de maatkolf om te neutraliseren de trypsine.
- In een microcentrifuge buis, meng 10 μL van Trypan Blue en 10 μL van de celsuspensie.
- Centrifuge de oorspronkelijke celsuspensie gedurende 8 minuten op 200 x g.
- Terwijl de celsuspensie worden gecentrifugeerd, 10 μL van de celsuspensie Trypan Blue toevoegen aan een hemocytometer en uitvoeren van een cel tellen.
- Na centrifugeren, gecombineerd media zonder het loskomen van de cel-pellet. Resuspendeer de pellet cel bij een concentratie van 1,25 x 10 5 cellen/mL.
- Voeg 5 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar de onderkant van een 10 cm petrischaal te handhaven een gehydrateerd klimaat tijdens sferoïde groei.
- Omkeren de deksel van de petrischaal. Voeg enkele druppels voor 20 μL van de celsuspensie op de binnenzijde van de deksel van de petrischaal.
- Snel het deksel weer omkeren en plaats deze terug aan de onderkant van de schotel, voorzichtig om niet te verjagen van de hangende druppels. Figuur 1 illustreert met succes gevormde hangende druppels.
- Zorgvuldig plaats de schotel in een 37 ° C incubator en toestaan spheroïden om te groeien in een hangende drop cultuur voor een periode van 72 h.
3. Dag 6: Het inbedden van spheroïden in 3D Matrix
- de volgende uitvoeren in een cultuur kap ter voorkoming van verontreiniging van monsters.
- Voor de vorming van eerste fibrine laag, maken een klonter-oplossing van voldoende volume toe te voegen 100 μl van clot oplossing per putje voor zoveel wells als nodig (1 sferoïde per putje). Stolsels bestaan uit 10% 10 X HEPES buffer door volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7.4), 2 mg/mL menselijk fibrinogeen en 0.1 U/mL menselijke Alfa trombine. Het resterende deel van de klonter volume bestaat uit ultrazuiver water.
- Toevoegen trombine laatst en snel toevoegen oplossing aan gewenste putjes in een 48-well plaat om te voorkomen dat stolsels actinemonomeren voorafgaand aan wordt toegevoegd aan putjes.
- Voorzichtig schudden/kraan goed plaat om ervoor te zorgen dat fibrine clot mengsel is de gehele coating goed, en plaats dan goed plaat in de incubator voor 1 h om de onderste clot laag te polymeriseren. Niet schud goed plaat hard genoeg voor het opwekken van de luchtbel vorming; gewoon rock plaat als nodig is totdat het geheel van de put is bekleed. Als grotere clot volumes worden gebruikt, deze stap niet noodzakelijk kan zijn.
- Spheroïden overbrengen in de laag fibrine.
- Verwijderen de put plaat en de petrischaal met spheroïden in de opknoping cultuur uit de incubator neerzetten en spheroïden onder een microscoop te onderzoeken. Vervolgens zet de schotel in de cultuur kap.
- Zorgvuldig het omkeren van de deksel van de petrischaal toegang naar de opknoping drop culturen.
- Met behulp van een naald van de 21 G verbonden met een spuit van 1 mL, zorgvuldig transfer een druppel uit het omgekeerde deksel in het midden van elk goed, zorg niet om het doorprikken van de gepolymeriseerde fibrine laag coating van de bodem van de put. Om effectief de daling, Trek langzaam de daling in de naald. Stoppen met het trekken van de zuiger terug zodra de gehele daling binnen de naald; luchtbellen, die effectieve sferoïde overdracht of latere imaging verstoren kunnen terug te trekken de daling te ver kan introduceren.
- Onderzoeken van de goed plaat onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de spheroïden correct in alle gewenste putten hebben overgedragen.
- Voor de vorming van tweede fibrine laag, maken een andere clot oplossing met behulp van de dezelfde voorbereiding zoals hierboven voor de oprichting van de eerste laag fibrine (stap 3.2). Zorgvuldig Pipetteer 100 μl op elke daling sferoïde-bevattende en onderzoeken onder een Microscoop opnieuw om ervoor te zorgen dat de spheroïden nog steeds intact zijn en zijn niet geduwd aan de randen van de putten.
- De goed plaat aan de incubator terug en laat de tweede laag te polymeriseren voor 1 h.
4. Dag 6: Toevoeging van Pro-trekkende of remmende factoren
- warme HDFn media tot 37 ° C.
- De volgende stappen uitvoeren in een kap om verontreiniging te voorkomen.
- Media voorbereiden op elke groep met inbegrip van de juiste concentraties van pro/anti-migratory agenten moeten worden geëvalueerd.
- Verwijderen van de goed plaat uit de incubator en plaats in de kap van een cultuur.
- Voeg toe 500 μL van standaard media aan elk putje van de controlegroep sferoïde, 500 μL van remmende media aan elk putje van de migratie-geremd sferoïde groep en 500 μL van pro-trekkende media aan elk putje van de groep migratie-enhanced sferoïde.
- De goed plaat terug te keren naar de incubator.
- Verandering media elke 48 h.
5. Dagen 6-9: evaluatie van de migratie van de cel en proliferatie
- afbeelding spheroïden met helderveld microscopie onmiddellijk na toevoeging van media (0 h) en vervolgens elke 24 h voor 72 h. Optioneel: op elk tijdstip, een z-stack beeld te nemen om te bepalen of migratie plaatsvindt in vliegtuigen buiten het primaire gebied van focus. In onze ervaring dit niet het geval; het is echter nuttig om ervoor te zorgen dit is het geval in elk experiment.
- Gebruik ImageJ cel uitgroei in elk putje bepalen door het analyseren van de procentuele toename van de ruimte voor elke sferoïde door het traceren van de rand van een cel voor elke sferoïde op elke opeenvolgende tijdstip en met behulp van de " maatregel " functie voor het verkrijgen van het gebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sferoïde cultuur kan worden gebruikt om met succes het evalueren van het effect van pro- en anti-trekvogels agenten op fibroblast migratie in vitro
3D fibroblast spheroïden kunnen worden gevormd via opknoping drop cultuur over een periode van 72 h (Figuur 1). Na de periode van de cultuur, spheroïden worden ingebed binnen de klonter matrix en beeld met behulp van helderveld microscopie (Figuur 2). Het eerste gebied van de spheroïden (afgebeeld in de figuur als het gebied dat wordt begrensd door de witte randen) waren vastbesloten met behulp van ImageJ en gebruikt als referentiepunt om te bepalen van de mate van latere cel uitvloeisel van de sferoïde instanties. Eerste gemiddelde oppervlakte metingen voor de spheroïden werden bepaald als 4.3 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 voor het besturingselement spheroïden, 4.4 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 voor de pro-trekkende spheroïden, en 4.5 x 104 7,7 x 10 ±3 μm2 voor de anti-migrerende spheroïden. Media met de factoren van de pro - of anti - migratory toevoegde aan de sferoïde-bevattende stolsels en cel uitvloeisel uit het eerste sferoïde lichaam was het beeld van elke 24 h, met de laatste beelden genomen van 72 uur nadat de oorspronkelijke media was toegevoegd (Figuur 3).
Na voltooiing van het experiment, was sferoïde groei na verloop van tijd geanalyseerd met behulp van ImageJ voor het berekenen van de veranderingen in sferoïde gebied voor elk monster. Zoals blijkt uit Figuur 3, werd de buitenste rand van de cel cluster op elk tijdstip gebruikt om te bepalen van de tijd-specifieke mate van cel uitgroei. Wij verwachten dat de out-of-focus spots afgebeeld in Figuur 3 cel puin, en we dat niet in onze kwantificering tellen. Full-size afbeeldingen tonen een duidelijke, continue celrand opkomende van het sferoïde lichaam; het is deze grens die is opgespoord bij het bepalen van de uitgroei. Cel uitgroei werd gekwantificeerd door het normaliseren van de cel uitgroei gebied ten opzichte van de oorspronkelijke sferoïde lichaamszone op t = 0 h, en vervolgens uit te drukken de groei als een percentage van de oorspronkelijke sferoïde. Kwantificering van de uitgroei van de cel in de periode van 72 h blijkt dat spheroïden blootgesteld aan een pro-trekkende agent een aanzienlijk hogere mate van migratie van de oorspronkelijke sferoïde lichaam in vergelijking met spheroïden blootgesteld vertonen aan een migratie-remmende agent en controle spheroïden blootgesteld aan standaard media (p < 0.0001, Figuur 4). Omgekeerd, spheroïden blootgesteld aan een anti-trekkende agent aanzienlijk verminderde mate van migratie van de oorspronkelijke sferoïde lichaam in vergelijking met controle van de spheroïden tentoongesteld (p < 0.0001).
Ter vergelijking, hebben wij een voorbeeld van een kras assay (Figuur 5) verstrekt. Deze test werd uitgevoerd door het zaaien van fibroblasten op 500.000 cellen/cm2 in 24 goed-platen bedekt met 2 mg/mL fibrinogeen. Fibroblasten mochten 's nachts groeien. Het goed oppervlak werd vervolgens gekrast met een pipet tip en cel migratie naar het kladgebied was het beeld van meer dan 24 uur. Zoals blijkt uit representatieve beelden gepresenteerd in Figuur 5A, zijn er beperkingen aan deze bepaling; krassen zijn niet zeer reproduceerbaar en in sommige gevallen de grenzen zijn niet duidelijk afgebakend. De algemene trends van de migratie in het bijzijn van pro - en anti - migratory factoren zijn echter hetzelfde als de aanwezigen in de 3D sferoïde assay, ondanks de eerder genoemde variabiliteit en de verschillen in vormen van migratie. Opgemerkt moet worden dat migratie tarieven sneller in de 2D kras assay zijn, in vergelijking met de 3D sferoïde assay. Sluiting was snelste in aanwezigheid van de pro-trekkende agent en alle monsters gekweekt in aanwezigheid van de pro-trekkende agent werden volledig gesloten binnen de 24u.
Figuur 1 : Menselijke dermale fibroblasten in een hangende drop cultuur. Cellen zitten in een hangende drop cultuur gedurende 72 uur voor het opwekken van sferoïde vorming. Een top (A) en (B) zijaanzicht van de opknoping drop cultuur worden gepresenteerd. (C) Schematische voorstelling afgebeeld zijaanzicht van sferoïde vorming in een daling van de hangende. De zwarte lijn geeft de bovenkant van de plaat, het roze gebied vertegenwoordigt de media en de paarse bollen vertegenwoordigen de cellen binnen de sferoïde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Sferoïde uiterlijk na eerste insluiten in fibrine matrix (t = 0 h na toevoeging van media) beeld met behulp van helderveld microscopie bij 10 X vergroting. (A, D) Controle sferoïde; (B, E) Sferoïde blootgesteld aan anti-trekkende agent in de media; (C, F) Sferoïde blootgesteld aan pro-trekkende agent in de media. Afbeeldingen worden weergegeven met (D-F) en zonder (A-C) witte lijnen die de grenzen gebruikt om te bepalen van uitgroei gebied aangeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Sferoïde uiterlijk na 72 h beeld met behulp van helderveld microscopie bij 10 X vergroting. (A, D) Controle sferoïde; (B, E) Sferoïde blootgesteld aan anti-trekkende agent in de media; (C, F) Sferoïde blootgesteld aan pro-trekkende agent in de media. Afbeeldingen worden weergegeven met (D-F) en zonder (A-C) witte lijnen die de grenzen gebruikt om te bepalen van uitgroei gebied aangeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Sferoïde groei meer dan 72 h. Pro-trekkende en anti-trekvogels agenten in media staan aanzienlijk beïnvloedenFibroblast migratie en proliferatie in 3D omgevingen. N = 3/groep; * vertegenwoordigt p < 0,0001. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Vergelijking met standaard 2D kras assay. (A) representatieve beelden van cel migratie in een standaard kras assay gedurende 24 uur. Fibroblasten waren gegroeid in media geconditioneerd met pro - of anti - migratory factoren en verschillen in kras sluiting na verloop van tijd werden gekwantificeerd. (B) percentage sluiting na verloop van tijd voor fibroblasten gegroeid in control, pro-trekkende, of anti-trekkende media. Weliswaar zijn er verschillen in modi van migratie in deze 2D assay vs. de 3D sferoïde assay aanwezig, de algemene trends van de migratie consistent blijven. N = 3/groep; * vertegenwoordigt p < 0.05. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol maakt het mogelijk voor het onderzoek van de cel migratie in de wondgenezing ECMs door middel van een 3D-model in vitro verbonden . Een cruciale stap in de goede uitvoering van de procedure is de goede ontwikkeling van de fibroblast spheroïden; cel concentratie tijdens voorbereiding is geoptimaliseerd voor het geven van een beginconcentratie van 2.500 cellen/drop, waardoor spheroïden aan formulier betrouwbaar over een incubatietijd van 72 uur. Als een onvoldoende aantal cellen worden gebruikt, wordt spheroïden niet effectief kunnen samenvoegen en kunnen breken uit elkaar op wordt overgedragen en ingebed in de lagen van fibrine. Als verschillende soorten cellen worden gebruikt, wellicht de eerste cel concentratieen/of sferoïde rijping van tijd worden aangepast met het oog op een consistente, stabiele sferoïde vorming. Celtypes die zich langzamer dan fibroblasten verspreiden, een veel hogere concentratie van de oorspronkelijke cel mogelijk om goede sferoïde vorming binnen de 72 uur tijd. Cellen mogen niet blijven in een hangende drop cultuur langer dan 72 uur als gevolg van het onvermogen om te veranderen van de media op de spheroïden in de cultuur. Verschillen in grootte van de oorspronkelijke sferoïde worden verwacht als gevolg van de inherente biologische variabiliteit; Wij pakken deze variabiliteit door sferoïde formatie te beginnen met een substantieel aantal cellen tot een minimum beperken van grootte verschillen zo veel mogelijk te normaliseren groei na verloop van tijd om vergelijking mogelijk te maken.
De voornaamste uitdaging voor de uitvoering van deze methode is de overdracht van spheroïden van een hangende cultuur vallen de klonter-matrix. Dit protocol maakt gebruik van een naald en spuit op de sferoïde-bevattende druppel uit de deksel van de omgekeerde petrischaal gecombineerd, maar andere methoden, zoals het gebruik van pincet of micropipetten verbonden aan het schoongemaakte tips, kunnen ook worden toegepast om effectief de spheroïden van opknoping van de daling aan matrijs. Spheroïden kunnen op betrouwbare wijze worden overgedragen door de plunjer van de injectiespuit te trekken terug iets voordat u overdraagt de druppel, en door ervoor te zorgen dat de droplet wordt opgesteld in de naald langzaam zodat gasbellen worden niet ingevoerd in de druppel. De plunjer van de injectiespuit moet alleen worden teruggetrokken net genoeg om de hele druppel in de naald; terug te trekken zal om het even welk verder ook introduceren bubbels en interfereren met de betrouwbare overdracht van de spheroïden in de putjes van de plaat goed. Gespecialiseerde opknoping drop cultuur platen kunnen ook gebruikt worden ter vereenvoudiging van de sferoïde cultuur, maar zijn een minder kosten efficiënt middel doen dan gewoon met behulp van een standaard schotel.
Tijdens wond genezing in vivo, produceren fibroblasten die het wond gebied binnenvallen uitgebreide serine proteasen die in de aantasting van de matrijs van het fibrine resulteren. Deze cellen synthetiseren vervolgens nieuwe extracellulaire matrix, voornamelijk bestaat uit collageen, om te herstellen van het beschadigde weefsel. 23 dit mechanisme van migratie zorgt voor gecontroleerde invasie die niet is vastgelegd door onze methode en vertegenwoordigt een beperking van het systeem. Ook opgemerkt moet worden dat de fibroblasten gebruikt bij deze methode zal afscheiden proteasen die na verloop van tijd het fibrine netwerk degraderen zou; Daarom, als op lange termijn (> 72 uur) migratie studies gewenst zijn, protease-remmers, zoals aprotinin, moeten worden toegevoegd aan de cel-cultuur-media.
Ondanks deze beperkingen biedt deze methode een eenvoudige, kosteneffectieve en reproduceerbare methode om te studeren 3D cel migratie in vitro. Terwijl een meer fysiologisch relevante omgeving dan gebruikte 2D modellen, analyse van de groei in het 3D-model hierin beschreven de ongecompliceerd analyse geboden door 2D modellen onderhoudt. Spheroïden zijn gemakkelijk te visualiseren met behulp van eenvoudige helderveld of fase microscopie en, indien gewenst, deze methode kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik in fluorescentie microscopie door fluorescently labeling celmembranen en matrix-proteïnen. Dit protocol maakte gebruik van neonatale menselijke dermale fibroblasten vanwege de rol van de fibroblast migratie in weefsel reparatie/remodelleren. Indien gewenst, kunnen neutrofiele granulocyten, macrofagen, keratinocyten of andere celtypes worden gebruikt in deze test om te beoordelen van de invloed van wijzigingen in fibrine clot structuur op migratie van andere celtypes die betrokken zijn bij wondgenezing. Het 3D materiaal kan ook worden gewijzigd indien nodig; afhankelijk van de gewenste toepassing, mogen collageen of andere 3D matrix-materialen worden gebruikt in plaats van een matrix van fibrine teneinde een fysiologisch relevante model. Een nuttig model voor het bestuderen van de langerlopende cel migratie in de omgeving van een wond-achtige kon worden verkregen met dit protocol, met behulp van keratinocyten en collageen in plaats van fibroblasten en fibrine. De beschreven methoden ook meer flexibiliteit en kosteneffectiviteit in cel migratie toestaan en wond genezing studies door de uitvoering van een model fysiologisch relevante in vitro in plaats van het vereisen onmiddellijke in vivo werk aanleiding van klassieke tweedimensionale in vitro studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering voor dit werk werd verstrekt door de American Heart Association (16SDG29870005) en de North Carolina State University Research en innovatie zaad financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S.
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
