Summary
Målet med denne protokollen er å vurdere effekten av pro - og anti - migratory faktorer på celle migrasjon i en tredimensjonal fibrin matrise.
Abstract
Foreløpig mest i vitro modeller av sårtilheling, som veletablerte scratch analyser, involverer studere celle migrasjon og såret nedleggelse på todimensjonale overflater. Fysiologiske miljøet som i vivo sårheling foregår er imidlertid tredimensjonale i stedet for todimensjonal. Det blir stadig klarere at cellen atferd varierer sterkt i todimensjonale og tredimensjonale terreng. Derfor er det behov for mer fysiologisk relevante i vitro modeller for å studere celle migrasjon atferd i såret nedleggelse. Metoden beskrevet her kan for studier av celle migrasjon i en tredimensjonal modell som bedre gjenspeiler fysiologiske forhold enn tidligere etablert todimensjonal scratch analyser. Formålet med denne modellen er å evaluere celle utvekst via undersøkelse av celle migrasjon fra en formet kropp i en fibrin matrise i nærvær av pro - eller anti - migratory faktorer. Bruker denne metoden, celle utvekst fra formet kroppen i en tredimensjonal matrise kan observeres og er lett kvantifiserbare over tid via brightfield mikroskopi og analyse av formet kroppen området. Effekten av pro-vandrende og/eller hemmende faktorer på celle migrasjon kan også vurderes i dette systemet. Denne metoden gir forskere med en enkel metode for å analysere celle migrasjon i tredimensjonale såret forbundet matriser i vitro, dermed øke relevansen av i vitro celle studier før bruk av dyr i vivo modeller.
Introduction
Sårheling er en kompleks prosess som resulterer i restaureringen av vev integritet etter skade. Denne prosessen er delt i fire overlappende stadier omfattes av hemostasen, betennelse, spredning og remodeling, som hver reguleres av en kompleks kombinasjon av løselig Stikkordene, celle-matrix interaksjoner og celle-celle kommunikasjon. 1 , 2 orkestreringen av disse stikkordene styrer en rekke mobilnettet svar i sårheling viktigere, inkludert celle migrasjon. 3 , 4 celle migrasjon er en svært dynamisk prosess avhengig både mobilnettet fenotyper og egenskapene biokjemiske og Biofysiske ekstracellulær matrix miljøet. 5 celler kontinuerlig undersøke ekstracellulær matrix miljøet gjennom integrin-mediert baner; Denne prosessen kan celler å kjenne en rekke matrix egenskaper inkludert topografi, stivhet og confinement. Todimensjonal (2D) analyse av celle migrasjon viser at overføringen er drevet av lamellipodia formasjon i forkant gjennom generasjon begrepsordbok filament bunter. Påfølgende dannelsen av fokal adhesjon i forkant, i kombinasjon med actomyosin drevet sammentrekning og retraksjon på etterfølgende kanten, kjører cellen frem. 6 tredimensjonale (3D) mobilnettet overføring er for øyeblikket ikke godt forstått, men studier viser at 3D-overføring er ganske annerledes enn den tidligere beskrevet mekanisme i 2D og er trolig drevet av alternative mekanismer. For eksempel, studier av Petrie et al. viste at avhengig av egenskapene til ECM, celler i 3D matriser kan veksle mellom lamellipodium og lobopodium drevet mekanismer for overføring. 7 celle migrasjon er en kritisk komponent i såret healing respons, 3D-modeller av celle migrasjon er avgjørende for å forstå fysiologiske responser på ulike stimuli under sårtilheling. Selv om cellen vandrende atferd på 2D flater har vist å variere fra migrasjon i 3D matriser, benytte nyeste i vitro modeller av celle migrasjon under såret helbredelsesprosessen, inkludert veletablerte scratch analysen, 2D monolayer kulturer. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 mer nylig utviklet analyser har benyttet en 3D matrix, men fortsatt kultur celler i en monolayer over matrise, dermed begrenser muligheten til å virkelig recapitulate three-dimensionality av cellen miljøet i vivo. 15
Formålet med metoden beskrevet her er å studere celle migrasjon i en fysiologisk relevante 3D-modell, og ikke på 2D underlag, for å få en mer robust forståelse av migrasjon svar forbundet med anvendt stimuli. Denne metoden tillater for vurdering av celle migrasjon i en 3D fibrin blodpropp matrise i nærvær av faktorer som aktivere eller hemme trasé tilknyttet celle migrasjon. En fibrin matrise ble valgt for denne metoden på grunn av den viktige rolle fibrin spiller i de tidlige stadiene av sårheling; følgende skade, en fibrin blodpropp dannes i såret miljøer å demme blodtap og fungerer som et stillas for første celle infiltrasjon tissue reparasjon og ombygging. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 i tillegg fibrin brukes klinisk som en kirurgisk tetningsmasse og sammensetningen av Forseglinger har vært knyttet til celle migrasjon og ultimate healing resultater. En tidligere studie av Cox et al. undersøkt fibroblast overføring med fibrin clots består av varierende fibrin og trombin konsentrasjoner for å optimere en fibrin fugemasse. I disse studiene, ble migrering av celler av fibrin clots på plast retter kvantifisert. 20 Her presenterer vi en metode som gir mulighet for kvantifisering av migrering av celler i 3D fibrin miljøet. Mens metoden beskrevet i denne protokollen spesielt bruker fibrin, kan denne modellen enkelt endres for å bruke alternative matrix materialer som ønsket, for eksempel kollagen eller andre 3D matriser. I tillegg presenterer vi bruk av fibroblast spheroids i denne analysen fordi fibroblast overføring til såret sengen er av overordnet betydning for ekstracellulær matrix syntese og vev reparasjon/ombygging. Men under reparasjon er prosessen nøytrofile den første celle typen overføre til såret sengen, etterfulgt av makrofager. Fibroblaster da begynne å infiltrere såret miljøet ca 48 timer etter første skade, i begynnelsen av proliferativ fase av såret helbredelsesprosessen. 19 denne analysen kan enkelt endres for å inkludere nøytrofile og makrofager andre celletyper å vurdere hvordan endringer i fibrin blodpropp struktur påvirker migrering av disse celletyper. 21
For å implementere denne analysen, først, er en fibroblast-formet dannet ved hjelp av en endring av teknikkene tidligere for stamcelleforskningen kultur. 22 fibroblast-formet overføres senere til en 3D fibrin matrise, og resultatet deretter lett kan overvåkes og kvantifisert over flere dager. Denne protokollen tar hensyn 3D fysiologiske systemer ved å bygge inn 3D celle spheroids i en fibrin matrise, dermed unngår begrensningene i relevans forårsaket av en bruker en 2D vekst overflate med en celle monolayer modell vandrende virkemåten, mens gir for evalueringen av cellen atferd i kontrollerte i vitro omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: cellen og forberedelse av reagenser
Merk: alle cellen og reagens forberedelse skal utføres i en biologiske sikkerhetskabinett kabinett for å unngå forurens av prøvene.
- Varm filtrert Dulbecco ' s endret Eagle ' s Medium (DMEM), fosterets bovin serum (FBS), L-glutamin og penicillin/streptomycin i et 37 ° C vannbad.
- Forberede neonatal menneskelige dermal fibroblast (HDFn) media ved supplere varmet DMEM med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 1% L-glutamin.
- Tine ampuller med frosne HDFns og sentrifuger i 8 min 200 x g fjerne kryonisk bevaring medium. Resuspend celler i forberedt HDFn media på en tetthet av 1 x 10 6 celler/mL og frø i en T-75 kultur kolbe.
- Sted kolbe i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) for å tillate celle spredning.
- Store HDFn media på 4 ° C.
- Forberede pro - og anti - migratory reagenser som trengs.
2. Dag 3: Spheroid forberedelse
- utføre følgende i kultur hette å unngå forurens av prøvene.
- Når celler når 80% confluency, Sug opp media og legge 5 mL av 0,25% Trypsin-EDTA. Store kolbe i en 37 ° C inkubator for 5 min fullstendig fjerne celler fra kolbe overflaten.
- Legge til 5 mL av varmet media kolbe å nøytralisere trypsin.
- i et microcentrifuge rør, bland 10 μL Trypan blå og 10 μL celle suspensjon.
- Sentrifuger opprinnelige cellen suspensjon i 8 min på 200 x g.
- Mens celle suspensjon er blir sentrifugeres, tilsett 10 μL av Trypan blå celle suspensjon en hemocytometer og utføre en celletall.
- Etter sentrifugering, Sug opp media uten dislodging celle pellets. Resuspend celle pellet i en konsentrasjon på 1,25 x 10 5 celler/mL.
- Legge til 5 mL steril fosfat bufret saltoppløsning (PBS) til bunnen av en 10 cm Petriskål kan opprettholde et hydrert miljø under spheroid vekst.
- Inverter lokket av Petriskål. Legge til flere 20 μL dråper celle suspensjon på overflatebehandling av Petriskål lokket.
- Raskt Inverter lokket igjen og legg den tilbake på bunnen av fatet, pass på ikke å løsne den hengende dråper. figur 1 illustrerer ble dannet hengende dråper.
- Nøye plasser rett i en 37 ° C inkubator og tillate spheroids å vokse i en hengende slippe kultur for en periode på 72 h.
3. Dag 6: Innebygging Spheroids i 3D Matrix
- utføre følgende i kultur hette å unngå forurens av prøvene.
- For dannelsen av første fibrin laget, lage en blodpropp løsning av tilstrekkelig volum til 100 μL blodpropp løsning per brønn så mange brønner som kreves (1 spheroid per brønn). Clots består av 10% 10 X HEPES buffer av volum (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7.4), 2 mg/mL menneskelig fibrinogen og 0,1 U/mL menneskelige alpha trombin. Resten av blodpropp volumet består av ultrapure vann.
- Add trombin sist og raskt må du legge løsningen ønsket brønner i en 48-vel plate for å hindre clots polymerizing før legges til brønner.
- Forsiktig risting/trykk godt plate for å sikre at fibrin blodpropp blanding er belegg hele godt, og plasser godt plate i inkubator 1t tillate blodpropp botnlaget til danner. Ikke rist godt plate hardt nok til å skape boble; bare rock plate nødvendig til helheten av brønnen er belagt. Hvis større blodpropp volumer, dette trinnet ikke være nødvendig.
- Overføre spheroids til fibrin laget.
- Fjern brønnen plate og Petriskål som inneholder spheroids i hengende slippe kultur settefiskanlegg og undersøke spheroids under et mikroskop. Plasser fatet i kultur panseret.
- Nøye Inverter lokket av Petriskål tillate tilgang til hengende slippe kulturer.
- Bruker en 21 G nål knyttet til en 1 mL sprøyte, nøye overføre en dråpe fra invertert lokket inn i midten av hver godt, ta vare ikke for å punktere polymerized fibrin laget belegg bunnen av brønnen. For å effektivt overføre drop, sakte dra slipp inn nålen. Stoppe dra stempelet ut så fort hele drop er inni nålen; dra slipp tilbake langt kan introdusere luftbobler, som kan forstyrre effektiv spheroid overføring eller etterfølgende imaging.
- Undersøke godt platen under et mikroskop for å sikre at spheroids er riktig overført i alle ønskede brønner.
- For dannelsen av andre fibrin laget, opprette en annen blodpropp løsning bruker samme forberedelse som ovenfor for etableringen av det første fibrin laget (trinn 3.2). Nøye Pipetter 100 μL på hver spheroid inneholder slipp og undersøke under et mikroskop igjen for å sikre at spheroids er fortsatt intakt og har ikke blitt skjøvet til kantene av brønnene.
- Gå tilbake vel platen til inkubatoren og la det andre laget til danner for 1 h.
4. Dag 6: Tillegg av Pro-vandrende eller hemmende faktorer
- varm HDFn media til 37 ° C.
- Utfører følgende i hette å hindre forurensning.
- Forberede medier for hver gruppe inkludert passende konsentrasjoner av pro/anti-migratory agenter evalueres.
- Fjerne godt platen fra inkubator og sted i kultur hette.
- Legge til 500 μL målestokk media hver brønn av spheroid kontrollgruppen, 500 μL hemmende media hver brønn av gruppen overføring-hemmet formet og 500 μL pro-vandrende media hver brønn av gruppen migrasjon forbedret spheroid.
- Tilbake vel platen til inkubator.
- Endre media hver 48 h.
5. Dager 6-9: evaluering av celle migrasjon og spredning
- bilde spheroids bruker brightfield mikroskopi umiddelbart etter tillegg av media (0 h) og deretter hver 24 timer for 72 h. Valgfritt: på hvert punkt, ta en z-stack bilde for å avgjøre om overføringen er oppstått i fly utenfor primær-området fokus. Vår erfaring skjer dette ikke; men det er nyttig å sikre dette er tilfelle i hvert eksperiment.
- Bruk ImageJ å bestemme cellen utvekst i hver brønn ved å analysere prosent økning i området for hver spheroid ved sporing cellekantlinjen for hver spheroid på hver påfølgende tidspunkt og bruke den " mål " funksjonen å få området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spheroid kultur kan benyttes for å kunne evaluere effekten av pro og anti-migratory på fibroblast overføring i vitro
3D fibroblast spheroids kan dannes via hengende slipp kultur løpet av 72 h (figur 1). Etter kultur perioden, spheroids er innebygd i blodpropp matrix og fotografert bruker brightfield mikroskopi (figur 2). Første spheroids (avbildet i figuren som områder som er avgrenset av de hvite kantlinjene) var bestemt bruker ImageJ og brukes som et referansepunkt for å fastslå graden av påfølgende celle utvekst av spheroid likene. Første gjennomsnittstørrelse målene for spheroids var bestemt på å være 4,3 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 for kontrollen spheroids, 4.4 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 for pro-vandrende spheroids og 4.5 x 104 ± 7.7 x 103 μm2 for anti-migratory spheroids. Mediet som inneholder pro - eller anti - migratory faktorer ble lagt til det spheroid inneholder clots, og cellen utvekst fra første formet kroppen ble avbildet hver 24 h, med siste bilder tatt 72 h etter det opprinnelige mediet ble lagt (Figur 3).
Ved ferdigstillelse av eksperimentet, ble formet vekst over tid analysert bruke ImageJ for å beregne endringene i formet område for hvert utvalg. Som vist i Figur 3, ble den ytterste kanten av cellen klyngen på hvert tidspunkt brukt til å bestemme hvilken tid-spesifikke celle utvekst. Vi forventer at ut-av-fokus flekker vist i Figur 3 celle rusk, og vi teller ikke dette i vår kvantifisering. Full størrelse bilder viser en klar og vedvarende cellekantlinje fremvoksende fra formet kroppen; Det er denne grensen som spores når resultatet. Cellen utvekst ble kvantifisert ved normalisering celle utvekst området i forhold til opprinnelige formet kroppen området t = 0 h, og deretter uttrykke veksten som en prosent av det opprinnelige spheroid-området. Kvantifisering av cellen resultatet i 72 h perioden avslører at spheroids utsatt for en pro-vandrende agent viser en betydelig økt grad av migrasjon fra opprinnelige formet kroppen i forhold til spheroids utsatt for en overføring-hemmende agent og kontroll spheroids utsatt for målestokk media (p < 0.0001, Figur 4). Derimot spheroids utsatt for en anti-migratory agent utstilt betydelig redusert grad av migrasjon fra opprinnelige formet kroppen sammenlignet med kontroll spheroids (p < 0,0001).
Til sammenligning har vi gitt et eksempel på en ripe analysen (figur 5). Denne analysen ble utført av seeding fibroblaster på 500.000 celler/cm2 på 24 godt-platene belagt med 2 mg/mL fibrinogen. Fibroblaster var lov til å vokse over natten. Vel overflaten var deretter riper med Pipetter tips, og celle migrasjon i kladdeområdet ble avbildet over 24 timer. Som vist i representant bilder presentert i figur 5et, finnes begrensinger for denne analysen; riper er ikke veldig reproduserbare og i noen tilfeller grensene er ikke klart avgrenset. Men er det generelle migrasjon trender i nærvær av pro - og anti - migratory faktorer de samme som i 3D-formet analysen, til tross for den nevnte variasjonen og forskjellene i moduser av migrasjon. Det bør bemerkes at overføring priser er raskere i 2D scratch analysen, sammenlignet med 3D-formet analysen. Nedleggelsen ble raskest i nærvær av pro-vandrende agent alle prøver kultivert i nærvær av pro-vandrende agent var helt lukket innen 24 timer.
Figur 1 : Menneskelig dermal fibroblaster i en hengende slippe kultur. Celler er igjen i en hengende slippe kultur 72 h å indusere formet formasjon. En toppen (A) og (B) sideutsikt hengende slippe kultur presenteres. (C) skjematisk viser sideutsikt formet formasjon i en hengende dråpe. Den svarte linjen beskriver toppen av platen, rosa sfæren representerer media og lilla kulene representerer cellene i formet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Spheroid opptreden etter første innebygging i fibrin matrix (t = 0 h etter medier) avbildet med brightfield mikroskopi på 10 X forstørrelse. (A, D) Kontroll-formet; (B, E) Spheroid utsatt for anti-migratory agent i media. (C, F) Spheroid utsatt for pro-vandrende agent i media. Bilder vises med (D-F) og uten (-vekselstrøm) hvite linjer som angir kantlinjer brukes til å bestemme resultatet området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Spheroid utseende etter 72 h fotografert med brightfield mikroskopi på 10 X forstørrelse. (A, D) Kontroll-formet; (B, E) Spheroid utsatt for anti-migratory agent i media. (C, F) Spheroid utsatt for pro-vandrende agent i media. Bilder vises med (D-F) og uten (-vekselstrøm) hvite linjer som angir kantlinjer brukes til å bestemme resultatet området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Spheroid vekst over 72 h. Pro-vandrende og anti-migratory agenter i media vises betydelig innvirkningFibroblast overføring og spredning i 3D-miljøer. N = 3/gruppe. * representerer p < 0,0001. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Sammenligning til standard 2D scratch analysen. (A) representant bilder av celle migrasjon i en standard scratch analysen over 24 timer. Fibroblaster var vokst i media klimaanlegg, pro - eller anti - migratory faktorer, og forskjeller i scratch nedleggelse kvantifisert over tid. (B) nedleggelsen prosent over tid for fibroblaster vokst kontroll, pro-vandrende, eller anti-vandrende media. Men det er forskjeller i moduser av migrasjon i denne 2D analysen vs 3D-formet analysen, forblir generelle migrasjon trender konsekvent. N = 3/gruppe. * representerer p < 0,05. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir undersøkelse av celle migrasjon i sårheling forbundet ECMs gjennom en i vitro 3D modell. Et avgjørende skritt i riktig utførelse av prosedyren er riktig utvikling av fibroblast spheroids; cellen konsentrasjon under forberedelse var optimalisert for å gi en innledende konsentrasjon av 2500 celler/slipp, slik at spheroids skjemaet pålitelig over en inkubasjonsperiode 72 h. Hvis et tilstrekkelig antall celler, spheroids kan ikke samlet effektivt og kan bryte fra hverandre ble overført og innebygd i fibrin lagene. Hvis det brukes forskjellige celletyper, må første celle konsentrasjon og/eller spheroid modning tid justeres for å få konsekvente, stabile formet formasjon. For celletyper som sprer saktere enn fibroblaster, være en mye høyere første celle konsentrasjon nødvendig for å sikre riktig formet formasjon innen 72-timers tidsfristen. Celler bør ikke værende i en hengende slippe kultur mer enn 72 h på grunn av manglende evne til å endre media på spheroids i kultur. Forskjeller i første spheroid størrelse er forventet på grunn av iboende biologisk variasjon; vi ta denne variasjonen av starter formet formasjon med en konsekvent antall celler å minimere størrelse forskjeller som mulig og normalisere over tid å tillate data sammenligninger.
Primære utfordringen til gjennomføringen av denne metoden er overføring av spheroids fra en hengende slipp kultur til blodpropp matrix. Denne protokollen bruker en sprøytespiss inneholder spheroid inneholder slippverktøyet fra invertert Petriskål lokket, men andre metoder, for eksempel bruk av pinsett eller Mikropipetter knyttet til trimmet tips, kan også brukes til å effektivt forflytning den spheroids fra hengende slippe til matrise. Spheroids kan overføres sikkert ved å dra stempelet til sprøyten tilbake litt før du overfører slippverktøyet, og ved å sikre at slippverktøyet utarbeidet inn nålen sakte slik at gassboblene ikke er innført i slippverktøyet. Sprøytestempelet bør bare trekkes tilbake akkurat nok til å bringe hele slippverktøyet inn nålen; trekke tilbake vil noen ytterligere også introdusere bobler og forstyrre pålitelig overføring av spheroids i brønnene av godt plate. Spesialiserte hengende slippe kultur plater kan også brukes for å forenkle spheroid kulturen, men er en mindre bekostning effektiv måte å gjøre det enn å bruke en standard rett.
Under sårheling i vivo, produserer fibroblaster som invaderer området såret omfattende serine proteaser som fibrin matrix degradering. Disse cellene syntetisere senere nye ekstracellulær matrix, hovedsakelig består av kollagen, for å reparere skadet vev. 23 denne mekanismen av migrasjon tillater kontrollert invasjonen som ikke er fanget opp av vår metode og representerer en begrensning av systemet. Det bør også bemerkes at fibroblaster benyttet i denne metoden vil skiller proteaser som vil over tid redusere fibrin nettverket; Derfor, hvis langsiktige (> 72 timer) overføring studier er ønskelig, proteasehemmere, som aprotinin, bør legges til celle kultur media.
Til tross for disse begrensningene gir denne metoden en enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar metode i å studere 3D celle migrasjon i vitro. Mens gir et mer fysiologisk relevante miljø enn vanlige 2D modeller, vekst analyse i 3D-modellen beskrevet her opprettholder likefrem analyse av 2D-modeller. Spheroids er lett å visualisere bruker enkle brightfield eller fase mikroskopi og, hvis ønskelig, denne metoden kan enkelt endres for bruk i fluorescens mikroskopi ved fluorescently merking cellemembraner og matrix proteiner. Denne protokollen gjort bruk av neonatal menneskelig dermal fibroblaster på grunn av rollen for fibroblast vev reparasjon/ombygging. Eventuelt nøytrofile, makrofager, keratinocytter eller andre celletyper kan brukes i denne analysen til å vurdere hvordan endringer i fibrin blodpropp struktur påvirker migrering av andre celletyper som er involvert i sårtilheling. 3D materialet kan også endres etter behov. avhengig av ønsket program, kollagen eller andre 3D matrix materialer kan brukes i stedet for en fibrin matrise for å gi en fysiologisk relevante modell. En nyttig modell for studerer langsiktige celle migrasjon i et sår-lignende miljø kan oppnås med denne protokollen ved hjelp av keratinocytter og kollagen stedet fibroblaster og fibrin. Metodene beskrives også tillate større fleksibilitet og kostnadseffektivitet i celle migrasjon og sår helbredelse studier gjennom implementeringen av en fysiologisk relevante i vitro modell i stedet krever umiddelbar i vivo arbeid følgende klassiske todimensjonal i vitro studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Finansiering for dette arbeidet ble gitt gjennom American Heart Association (16SDG29870005) og North Carolina State University Research og innovasjon såkorn finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S.
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
