Summary
Målet med detta protokoll är att utvärdera effekten av pro - och anti - migratory faktorer på cellmigration inom en tredimensionell fibrin matris.
Abstract
För närvarande, de flesta i vitro modeller av sårläkning, såsom väletablerade scratch analyser, inbegriper studera cell migration och såret stängning på tvådimensionella ytor. Fysiologiska miljön i vilken in-vivo sårläkning sker är dock tredimensionella i stället för tvådimensionella. Det blir allt tydligare att cellen skiljer sig kraftigt i tvådimensionella vs. tredimensionella miljöer; Därför finns det ett behov för mer fysiologiskt relevanta in vitro- modeller för att studera cell migration beteenden i sårslutning. Den metod som beskrivs häri möjliggör studiet av cellmigration i en tredimensionell modell som bättre speglar fysiologiska förhållanden än tidigare etablerade tvådimensionell scratch analyser. Syftet med denna modell är att utvärdera cell utväxt via undersökning av cellmigration från en sfäroid kroppen inbäddad i en fibrin matris i närvaro av pro - eller anti - migratory faktorer. Med den här metoden cell utväxt från sfäroid kroppen i en tredimensionell matris kan observeras och är lätt kvantifierbara över tid via brightfield mikroskopi och analys av sfäroid organ område. Effekten av pro-flyttande eller hämmande faktorer på cellmigration kan också utvärderas i detta system. Denna metod ger forskare en enkel metod att analysera cellmigration i tredimensionella såret associerade matriser i vitro, cellen vilket ökar relevansen av in vitro -studier före användning av in-vivo djur modeller.
Introduction
Sårläkning är en komplicerad process som resulterar i återställandet av vävnad integritet efter skada. Denna process är uppdelat i fyra överlappande steg omfattas av hemostas, inflammation, spridning och remodeling, som var reglerade genom en komplex kombination av lösliga ledtrådar, cell-matrix interaktioner och cell-cell kommunikation. 1 , 2 orchestrationen av dessa signaler styr en mängd cellulära svar i sårläkning inklusive, ännu viktigare, cellmigration. 3 , 4 cellmigration är en mycket dynamisk process som är beroende av både cellulära fenotyper och biokemiska och biofysiska egenskaper av den extracellulära matrix-miljön. 5 celler kontinuerligt sond deras extracellular matris miljö genom integrin-medierade vägar; denna process låter celler att känna ett brett utbud av matrix egenskaper inklusive topografi, styvhet och instängdhet. Tvådimensionell (2D) analys av cellmigration visar att migration drivs av lamellipodia bildning i framkant genom generering av aktin filament buntar. Efterföljande bildandet av fokal sammanväxningar i framkant, i kombination med actomyosin driven kontraktion och upprullning på biskäret, driver cellen framåt. 6 three-dimensional (3D) cellulär migration är för närvarande inte förstått, färska studier visar dock att 3D migration är markant annorlunda än den ovan beskrivna mekanism i 2D och drivs sannolikt alterative mekanismer. Till exempel nyligen genomförda studier av Petrie et al. visat att, beroende på egenskaperna för ECM, celler i 3D matriser kan växla mellan lamellipodium och lobopodium drivande mekanismer av migration. 7 eftersom cellmigration är en kritisk komponent i såret helande svar, 3D-modeller av cellmigration är avgörande för att förstå fysiologiska reaktioner på olika stimuli under sårläkning. Även om cellen flyttande beteende på 2D ytor har visat sig variera kraftigt från migration i 3D matriser, utnyttja mest aktuella in vitro- modeller av cellmigration under sårläkningsprocessen, inklusive den väletablerade scratch test, 2D enskiktslager kulturer. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 mer nyligen utvecklade testmetoder har utnyttjat en 3D matrix, men fortfarande kultur celler i en enskiktslager ovanpå matrisen, vilket begränsar möjligheten att verkligen sammanfatta de tre dimensionerna av cell miljön invivo. 15
Syftet med den metod som beskrivs häri är att studera cellmigration i ett fysiologiskt relevanta 3D-modellen, snarare än på en 2D-yta, för att få en mer robust förståelse av migration svaren är associerad med de tillämpa stimuli. Denna metod möjliggör utvärdering av cellmigration inom en 3D fibrin clot matris i närvaro av faktorer som kan aktivera eller hämma vägar som är associerad med cellmigration. En fibrin matris valdes för denna metod på grund av den kritiska roll fibrin spelar i de tidiga stadierna av sårläkning; följande skada, en fibrin propp bildas inom såret miljöer att hejda blodförlust och fungerar som en klätterställning för inledande cell infiltration under vävnad reparation och ombyggnad. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 dessutom fibrin används kliniskt som en kirurgisk tätningsmedel och sammansättningen av tätningsmedel har varit knuten till cellmigration och ultimate healing utfall. En tidigare studie av Cox et al. undersökt fibroblast migration med fibrin blodproppar består av varierande fibrin och trombin koncentrationer i syfte att optimera ett fibrinlim. I dessa studier kvantifierades migration av celler av fibrin blodproppar på plast rätter. 20 här presenterar vi en metod som möjliggör för kvantifiering av migration av celler inom 3D fibrin miljön. Medan den metod som beskrivs i detta protokoll specifikt använder fibrin, kan denna modell lätt ändras för att använda alternativa matris material som önskas, till exempel kollagen eller andra 3D matriser. Dessutom presenterar vi användningen av fibroblast spheroids i denna analys eftersom fibroblast migration in i såret sängen är av största vikt för extracellulärmatrix syntes och vävnad reparation/ombyggnad. Men under reparation är processen neutrofiler den första celltypen att migrera in i såret sängen, följt av makrofager. Fibroblaster börjar sedan att infiltrera såret miljön cirka 48 timmar efter inledande skada, i början av den proliferativa fasen av sårläkningsprocessen. 19 denna analys kan enkelt modifieras för att inkludera neutrofiler, makrofager eller andra celltyper att bedöma hur förändringar i fibrin clot struktur påverkar migration av dessa celltyper. 21
För att genomföra denna analys, först bildas en fibroblast sfäroid med hjälp av en ändring av tekniker som tidigare beskrivits för stamceller kultur. 22 den fibroblast sfäroid överförs därefter till en 3D fibrin matris och utväxt sedan enkelt kan övervakas och kvantifieras under flera dagar. Detta protokoll tar hänsyn till 3D av fysiologiska system genom att bädda in 3D cell spheroids inom en fibrin matris, därmed undvika begränsningarna i betydelse genom en använda en 2D tillväxt yta med en cell enskiktslager modell flyttande beteende, medan medger utvärdering av cell beteende i en starkt kontrollerad in vitro- miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: Cell- och REAGENSBEREDNING
Obs: preparering av cellen och reagens bör utföras i biologiska säkerhetsdragskåp att förhindra kontaminering av proverna.
- Varma filtreras Dulbecco ' s ändrad Eagle ' s Medium (DMEM), fetalt bovint serum (FBS), L-glutamin och penicillin/streptomycin i 37 ° C vattenbad.
- Förbered neonatal mänskliga dermal fibroblast (HDFn) media genom att komplettera värmde DMEM med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin och 1% L-glutamin.
- Tina en injektionsflaska med frysta HDFns och Centrifugera i 8 min vid 200 x g för att ta bort frysförvaring medium. Återsuspendera cellerna i beredda HDFn media med en täthet på 1 x 10 6 celler/mL och utsäde i en T-75 kultur mätkolv.
- Plats kolven i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) för att tillåta cellproliferation.
- Store HDFn media vid 4 ° C.
- Förbereda pro - och anti - migratory reagenser som behövs.
2. Dag 3: Sfäroid förberedelse
- utför följande i en kultur huva att förhindra kontaminering av proverna.
- När celler når 80% konfluens, aspirera media och tillsätt 5 mL av 0,25% Trypsin-EDTA. Store kolven i en 37 ° C inkubator för 5 min till fullt lossa cellerna från kolvens yta.
- Tillsätt 5 mL av värmde media till kolven att neutralisera trypsin.
- i en mikrocentrifug rör, blanda 10 μL Trypan blå och 10 μL av cellsuspensionen.
- Centrifugera ursprungliga cellsuspensionen i 8 min vid 200 x g.
- Medan cellsuspensionen är centrifugeras, tillsätt 10 μL av Trypan blå cellsuspensionen till en hemocytometer och utföra en cell sammanräkning.
- Efter centrifugering, aspirera media utan lossnar cellpelleten. Återsuspendera cellpelleten med en koncentration på 1,25 x 10 5 celler/mL.
- Tillsätt 5 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) längst ned på en 10 cm petriskål upprätthålla en hydrerad miljö under sfäroid tillväxt.
- Invertera locket på petriskål. Tillsätt flera droppar för 20 μL av cellsuspensionen på inre ytan av petriskål locket.
- Snabbt Invertera locket igen och placera den tillbaka på botten av skålen, vara noga med att inte rubba den hängande droppar. figur 1 illustrerar framgångsrikt bildade hängande droppar.
- Försiktigt placera skålen i en inkubator i 37 ° C och låt spheroids att växa i en hängande droppe kultur under en period av 72 h.
3. Dag 6: Bädda in Spheroids i 3D Matrix
- utför följande i en kultur huva att förhindra kontaminering av proverna.
- För bildandet av första fibrin lager, skapar en propp lösning av tillräcklig volym för att tillsätt 100 μL av koagel lösning per brunn för så många brunnar som krävs (1 sfäroid per brunn). Blodproppar består av 10% 10 X HEPES buffert av volym (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL humant fibrinogen och 0,1 U/mL humant alfa-trombin. Återstoden av koagel volymen består av ultrarent vatten.
- Lägg till trombin senast och snabbt lägga till lösning till önskad brunnar i en 48-well platta för att förhindra blodproppar från polymeriserande före läggs till brunnar.
- Försiktigt skaka/tap väl plattan för att säkerställa att fibrin clot blandning är beläggning hela väl och placera sedan väl plattan i inkubatorn för 1 h att tillåta clot bottenlagret att polymerisera. Skaka inte väl plattan tillräckligt hårt för att framkalla bubbla bildas; bara rock plattan som behövs tills hela brunnen är belagda. Om större blodpropp volymer används, detta steg kanske inte är nödvändigt.
- Överföra spheroids till fibrin lagret.
- Ta bort brunnen plattan och petriskål innehållande spheroids i hängande släppa kultur från inkubatorn och undersöka spheroids under ett mikroskop. Sedan placera skålen i kultur huven.
- Noggrant Invertera locket på petriskål att tillåta åtkomst till hängande släpp kulturer.
- Noga med en 21 G nål bifogas en 1 mL spruta, överföra en droppe från inverterad locket in i centrera av varje väl, noga med att inte punktera polymeriserat fibrin lagret beläggning botten av brunnen. För att effektivt överföra drop, långsamt dra drop in nålen. Sluta att dra kolven tillbaka så snart hela fallhöjden är inuti nålen; Dra drop tillbaka för långt kan införa luftbubblor, som kan störa effektiva sfäroid överföring eller efterföljande imaging.
- Undersöka väl plattan under ett mikroskop för att säkerställa att spheroids ordentligt har överförts till alla önskade brunnar.
- För bildandet av andra fibrin lager, skapa en annan propp lösning använder samma förberedelser som ovan för skapandet av den första fibrin lagret (steg 3,2). Noggrant Tillsätt 100 μL till varje sfäroid-innehållande droppe och undersöka i Mikroskop igen för att säkerställa att spheroids är fortfarande intakt och har inte drivits till kanterna på brunnarna.
- Returnera den väl plattan till inkubatorn och låta det andra lagret att polymerisera för 1 h.
4. Dag 6: Tillägg av Pro-flyttande eller hämmande faktorer
- varm HDFn media till 37 ° C.
- Utför följande steg i en huva att förhindra kontaminering.
- Förbered för varje grupp inklusive lämpliga koncentrationer av pro/anti-migratory agenter utvärderas.
- Avlägsna väl plattan från inkubator och plats i en kultur huva.
- Lägga till 500 μL standard media till varje brunn av gruppen kontroll sfäroid, 500 μL av inhibitoriska media till varje brunn i gruppen migrering-hämmade sfäroid och 500 μL av pro-flyttande media till varje brunn i gruppen migrering-förbättrade sfäroid.
- Tillbaka väl plattan till inkubatorn.
- Ändra media varje 48 h.
5. Dagar 6-9: utvärdering av Cell Migration och spridning
- bild spheroids med brightfield mikroskopi omedelbart efter tillägg av media (0 h) och sedan varje 24 h för 72 h. tillval: vid varje tidpunkt, ta en z-stack bild för att avgöra om migrationen sker i flygplan utanför den primära fokus. Vår erfarenhet inträffar detta inte; Det är emellertid lämpligt att se till att detta är fallet i varje experiment.
- Användning ImageJ att bestämma cell utväxt i varje brunn genom att analysera procent ökning i området för varje sfäroid genom spårning cellens kantlinje för varje sfäroid vid varje efterföljande tidpunkt och använda den " åtgärd " funktion att få området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sfäroid kultur kan utnyttjas för att kunna utvärdera effekten av pro- och anti flyttande agenter på fibroblast migration in vitro-
3D fibroblast spheroids kan bildas via hängande droppe kultur under 72 h (figur 1). Efter perioden kultur, spheroids är inbäddade i matrisen clot och avbildas med hjälp av brightfield mikroskopi (figur 2). De första områdena i de spheroids (avbildad i figuren som de områden som avgränsas av de vita kanter) var fast beslutna använder ImageJ och används som en referenspunkt för att fastställa graden av efterföljande cell utväxt från sfäroid kroppar. Inledande genomsnittliga område mätningar för spheroids var fast beslutna att vara 4.3 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 för de kontroll spheroids, 4.4 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 för den pro-flyttfåglar spheroids och 4.5 x 104 ± 7,7 x 103 μm2 för de anti flyttande spheroids. Media som innehåller pro - eller anti - migratory faktorer lades till de sfäroid-innehållande blodproppar och cell utväxt från inledande sfäroid kroppen fotograferades varje 24 h, med sista bilderna tagna 72 h efter det ursprungliga mediet lades (figur 3).
Efter avslutad experimentet analyserades sfäroid tillväxt över tid med ImageJ för att beräkna förändringar i sfäroid område för varje prov. Som visas i figur 3, för den yttersta kanten av cellen klustret vid varje tidpunkt att bestämma tid-specifika graden av cell utväxt. Vi förväntar oss att den out-of-fokus fläckar visas i figur 3 är cellfragment och vi räknas inte detta i våra kvantifiering. Full storlek bilder visar en tydlig, kontinuerlig cellkantlinje framväxande från sfäroid kroppen; Det är denna gräns som spåras vid fastställandet av utväxt. Cell utväxt kvantifierades genom att normalisera cell utväxt området i förhållande till det ursprungliga sfäroid organ området vid t = 0 h, och då uttrycker tillväxten som en procentandel av den ursprungliga sfäroid. Kvantifiering av cell utväxten under perioden 72 h avslöjar att spheroids utsätts för en pro-flyttande agent uppvisar en betydligt ökad grad av migration från ursprungliga sfäroid kroppen jämfört med spheroids utsätts för en migration-hämmande agent och kontroll spheroids utsätts för standard-media (p < 0,0001, figur 4). Omvänt, spheroids utsätts för en anti flyttande agent uppvisade signifikant minskad grad av migration från ursprungliga sfäroid kroppen jämfört med styra spheroids (p < 0,0001).
För jämförelse, har vi gett ett exempel på en repa test (figur 5). Denna analys utfördes av sådd fibroblaster på 500 000 celler/cm2 på 24 brunn-tallrikar täckt med 2 mg/mL. Fibroblaster tilläts växa över natten. Väl ytan var sedan skrapas med en pipettspetsen och cellmigration in i scratch området fotograferades under 24 timmar. Som visas i representativa bilder presenteras i figur 5A, finns det begränsningar för denna analys; repor är inte mycket reproducerbara och i vissa fall gränserna är inte tydligt avgränsad. De övergripande migrationstendenserna i närvaro av pro - och anti - migratory faktorer är dock desamma som de som är närvarande i 3D sfäroid analysen, trots det ovannämnda variabilitet och skillnaderna i lägen av migration. Det bör noteras att migration är snabbare i 2D scratch analysen, jämfört med 3D sfäroid analysen. Stängningen var snabbast i närvaro av pro-flyttande agenten och alla prover odlade i närvaro av pro-flyttande agenten var helt stängd inom 24 h.
Figur 1 : Mänskliga dermal fibroblaster i en hängande droppe kultur. Cellerna finns kvar i en hängande droppe kultur för 72 h för att framkalla sfäroid bildas. En topp (A) och (B) sidovy av hängande droppe kultur presenteras. (C) Schematisk föreställande sidovy av sfäroid bildning i en hängande droppe. Den svarta linjen representerar toppen av plattan, den rosa cirkel representerar media och lila kulorna representerar cellerna inom sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Sfäroid utseende efter inledande inbäddning i fibrin matris (t = 0 h efter tillsats av media) avbildas med brightfield mikroskopi vid 10 X förstoring. (A, D) Kontroll sfäroid; (B, E) Sfäroid utsätts för anti flyttande agent i media; (C, F) Sfäroid utsätts för pro-flyttande agent i media. Bilder visas med (D-F) och utan (A-C) vita linjer som indikerar de gränser som används för att bestämma utväxt område. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Sfäroid utseende efter 72 h avbildas med brightfield mikroskopi vid 10 X förstoring. (A, D) Kontroll sfäroid; (B, E) Sfäroid utsätts för anti flyttande agent i media; (C, F) Sfäroid utsätts för pro-flyttande agent i media. Bilder visas med (D-F) och utan (A-C) vita linjer som indikerar de gränser som används för att bestämma utväxt område. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Sfäroid tillväxt över 72 h. Pro-flyttande och anti flyttande agenter i media visas att väsentligt påverkafibroblast migration och spridning i 3D-miljöer. N = 3/grupp; * representerar p < 0,0001. Felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Jämförelsen till standard 2D scratch assay. (A) representativa bilder av cellmigration i en standard scratch test under 24 timmar. Fibroblaster odlades i media luftkonditionerade med pro - eller anti - migratory faktorer och skillnader i scratch stängning kvantifierades över tid. (B) procent stängning över tiden för fibroblaster odlas i kontroll, pro-flyttande, eller anti flyttande media. Även om det finns skillnader i lägen av migration i detta 2D assay vs. 3D sfäroid analysen, förblir övergripande migrationstendenserna konsekvent. N = 3/grupp; * representerar p < 0,05. Felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll kan prövningen av cellmigration i sårläkning associerade ECMs genom en in vitro- 3D-modellen. Ett avgörande steg för korrekt genomförande av förfarandet är en sund utveckling av fibroblast spheroids; cellkoncentrationen under beredning var optimerad för att ge en initial koncentration av 2.500 celler/drop, att spheroids att bilda tillförlitligt över en inkubationstid på 72 h. Om ett otillräckligt antal celler används, spheroids kan inte samlade effektivt och kan bryta isär på villkor att överföras och inbäddade i fibrin lagren. Om olika celltyper används kan ursprungliga cellen koncentration eller sfäroid mognad tid behöva justeras för att erhålla jämn och stabil sfäroid bildandet. För celltyper som föröka sig långsammare än fibroblaster, kan en mycket högre initiala cellen koncentration vara nödvändiga för att säkerställa korrekt sfäroid formation inom 72 timmar tidsspannet. Cellerna bör inte förbli i en hängande droppe kultur längre än 72 h på grund av oförmåga att ändra media på spheroids medan i kultur. Skillnader i inledande sfäroid storlek förväntas på grund av inneboende biologiska variationer; Vi tar itu med denna variation av börjar sfäroid bildning med en konsekvent antal celler för att minimera storleksskillnaderna så mycket som möjligt och normalisera tillväxt över tid för att möjliggöra jämförelser av data.
Den primära utmaningen att genomförandet av denna metod är överföringen av spheroids från en hängande släppa kultur i matrisen clot. Detta protokoll används en nål och spruta för att aspirera sfäroid-innehållande droplet-programmet från inverterad petriskål locket, men andra metoder, såsom användning av pincett eller Mikropipetter bifogas trimmade tips, kan också tillämpas för att effektivt överföra den spheroids från hängande droppe till matrix. Spheroids kan överföras på ett tillförlitligt sätt genom att dra kolven i sprutan tillbaka något före överföring droplet-programmet och genom att säkerställa att droplet-programmet utarbetas in nålen långsamt så att gasbubblor inte förs in droplet-programmet. Sprutkolven bör endast dras tillbaka precis tillräckligt för att sätta hela droplet-programmet i nålen; Dra tillbaka kommer någon ytterligare också införa bubblor och störa tillförlitlig överföring av spheroids i brunnar av väl plattan. Specialiserade hängande droppe kultur plattor kan också användas för att förenkla sfäroid kulturen, men är ett mindre kostnads effektivt sätt att göra så än att bara använda en vanlig maträtt.
Under sårläkning i vivo, producera fibroblaster som invaderar sårområdet omfattande serine proteaser som resulterar i fibrin matrix nedbrytning. Dessa celler syntetisera därefter nya extracellulärmatrix, huvudsakligen består av kollagen, för att reparera den skadade vävnaden. 23 denna mekanism migrationens tillåter kontrollerad invasion som inte fångas av vår metod och utgör en begränsning av systemet. Det bör också noteras att fibroblaster utnyttjas i denna metod kommer utsöndrar proteaser som skulle med tiden försämra fibrin nätverket; Därför, om långsiktiga (> 72 timmar) migration studier önskas, proteashämmare, såsom aprotinin, bör läggas till cell kultur media.
Trots dessa begränsningar ger denna metod en enkel, kostnadseffektiv och reproducerbar metod att studera 3D cell migration i vitro. Medan en mer fysiologiskt relevanta miljö än vanliga 2D-modeller, Tillväxtanalys i 3D-modellen beskrivs häri bibehåller rättfram analys som tillhandahålls av 2D-modeller. Spheroids är lätt att visualisera med hjälp av enkla brightfield eller fas mikroskopi och, om så önskas, denna metod kan lätt ändras för användning i fluorescensmikroskopi av fluorescently märkning cellmembran och matrix proteiner. Detta protokoll gjord använda av neonatal mänskliga dermal fibroblaster på grund av rollen av fibroblast migration i vävnad reparation/ombyggnad. Om så önskas, kan neutrofiler, makrofager, keratinocyter eller andra celltyper användas i denna analys för att bedöma hur förändringar i fibrin clot struktur påverkar migration av andra celltyper som är inblandade i sårläkning. 3D materialet kan också ändras efter behov; beroende på det önskade programmet, kan kollagen eller andra 3D matrix material användas i stället för en fibrin matris för att ge en fysiologiskt relevanta modell. En användbar modell för att studera långsiktiga cellmigration i såret-liknande miljö kunde erhållas med detta protokoll med hjälp av keratinocyter och kollagen snarare än fibroblaster och fibrin. De metoder som beskrivs också tillåta större flexibilitet och kostnadseffektivitet i cellmigration och sår läkning studier genom genomförande av ett fysiologiskt relevanta in vitro- modell i stället för att som kräver omedelbar i vivo arbete efter klassiska tvådimensionella in vitro- studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering för detta arbete lämnades genom American Heart Association (16SDG29870005) och North Carolina State universitetsforskning och Innovation Seed finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S.
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
