Summary
El objetivo de este protocolo es evaluar el efecto de los factores pro y anti migratory en migración de la célula dentro de una matriz tridimensional de fibrina.
Abstract
Actualmente, mayoría en vitro de los modelos de cicatrización, como ensayos de rayado bien establecidos, implican estudiar celular migración herida cierre en superficies bidimensionales. Sin embargo, el ambiente fisiológico en que en vivo de cicatrización se lleva a cabo es tridimensional en lugar de dos dimensiones. Es cada vez más claro que el comportamiento celular difiere enormemente en dos dimensiones vs entornos tridimensionales; por lo tanto, hay una necesidad de más fisiológico relevantes en vitro modelos para estudiar comportamientos de migración celular en el encierro de la herida. El método aquí descrito permite el estudio de la migración celular en un modelo tridimensional que mejor refleja las condiciones fisiológicas que ensayos cero dos dimensiones previamente establecidos. El propósito de este modelo es evaluar consecuencia de células mediante el examen de la migración de la célula de un cuerpo esferoide incrustado dentro de una matriz de fibrina en presencia de factores de pro o anti migratory. Usando este método, fruto de célula del cuerpo esferoide en una matriz tridimensional puede ser observado y es fácilmente cuantificable en el tiempo mediante microscopía brightfield y análisis de la zona del cuerpo esferoide. El efecto de factores pro-migratorias o inhibitorios sobre migración de la célula puede también ser evaluado en este sistema. Este método ofrece a los investigadores con un método sencillo de análisis de migración de la célula en matrices tridimensionales herida asociada en vitro, aumentando la relevancia de in vitro células estudios previo a la utilización de animales en vivo modelos.
Introduction
La cicatrización es un proceso complejo que resulta en la restauración de la integridad del tejido después de lesión. Este proceso se divide en cuatro etapas superpuestas de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación, que son cada uno regulado por una compleja combinación de señales solubles, las interacciones célula-matriz y célula-célula comunicaciones. 1 , 2 la orquestación de estas señales controla multitud de respuestas celulares en la cicatrización de heridas incluyendo, importantemente, migración de la célula. 3 , 4 migración celular es un proceso dinámico dependiente de fenotipos celulares y las propiedades bioquímicas y biofísicas de la medio de la matriz extracelular. 5 células sonda continuamente su entorno matriz extracelular a través de vías mediadas por integrinas; Este proceso permite a las células detectar una amplia gama de propiedades de la matriz incluyendo topografía, rigidez y aislamiento. Dos dimensiones (2D) el análisis de migración de la célula demuestra que la migración es impulsada por lamellipodia formación a la vanguardia a través de la generación de haces de filamentos de actina. Posterior formación de adherencias focales a la vanguardia, en combinación con actomyosin por contracción y retracción en el borde de fuga, unidades de la célula hacia adelante. 6 migración celular tridimensional (3D) en la actualidad no se entiende bien, sin embargo, estudios recientes demuestran que la migración 3D es marcadamente diferente a la anteriormente descrito mecanismo en 2D y es probablemente por mecanismos alterativo. Por ejemplo, estudios recientes por Petrie et al. demostró que, dependiendo de las propiedades de la ECM, las células matrices 3D pueden cambiar entre lamellipodium y lobopodium por mecanismos de la migración. 7 debido a migración de la célula es un componente crítico de la respuesta de cicatrización, modelos 3D de migración de la célula son críticos para la comprensión de respuestas fisiológicas a diferentes estímulos durante la cicatrización de heridas. Aunque el comportamiento migratorio de la célula en las superficies de la 2D se ha demostrado que varían mucho de la migración en matrices 3D, modelos en vitro más actuales de la migración celular durante el proceso, incluyendo el ensayo de rayado bien establecido, de cicatrización utilizan 2D cultivos de monocapa. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 más recientemente desarrollado análisis han utilizado una matriz 3D, pero aún las células en una monocapa sobre la matriz, lo que limita la capacidad de realmente recapitular la tridimensionalidad del entorno de la célula de la cultura en vivo. 15
El propósito del método descrito en este documento es estudiar la migración de células en un modelo 3D fisiológicamente relevante, en lugar de en una superficie 2D, para tener una comprensión más robusta de las respuestas de migración asociados con los estímulos aplicados. Este método permite la evaluación de la migración de la célula dentro de una matriz del coágulo de fibrina 3D en presencia de factores que activan o inhiben vías asociadas con la migración de la célula. Una matriz de fibrina fue elegida para este método debido al papel crítico que desempeña fibrina en las primeras etapas de la cicatrización de heridas; siguientes lesiones, un coágulo de fibrina se formaron dentro de los entornos de la herida para detener la pérdida de sangre y sirven como un andamio para la infiltración de la célula inicial durante la reparación del tejido y remodelación. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 además, fibrina se utiliza clínicamente como un sellante quirúrgico y la composición de los selladores ha estado ligada a la migración de la célula y el último los resultados de curación. Un estudio previo por Cox et al. investigado la migración de fibroblastos con coágulos de fibrina compuestos de fibrina variable y concentraciones de trombina con el fin de optimizar un sellante de fibrina. En estos estudios, se cuantificó la migración de células de coágulos de fibrina en platos de plástico. 20 aquí presentamos un método que permite la cuantificación de la migración de las células en el entorno 3D de la fibrina. Aunque el método descrito en el presente Protocolo específicamente utiliza fibrina, este modelo puede ser modificado fácilmente para utilizar materiales alternativos de matriz como se desee, como el colágeno u otras matrices 3D. Además, presentamos el uso de esferoides de fibroblastos en este ensayo debido a la migración de fibroblastos en el lecho de la herida es de suma importancia para la síntesis de matriz extracelular y tejido reparación/remodelación. Sin embargo, durante la reparación proceso neutrófilos son el primer tipo de células a migrar en el lecho de la herida, seguido por los macrófagos. Fibroblastos comienzan entonces a infiltrarse en el entorno de la herida aproximadamente 48 horas después de lesión inicial, al comienzo de la fase proliferativa del proceso de cicatrización. 19 este ensayo podría ser fácilmente modificado para incluir neutrófilos, macrófagos y otros tipos de células para evaluar cómo alteraciones en la estructura del coágulo de fibrina afectan la migración de estos tipos celulares. 21
Para aplicar este análisis, en primer lugar, un esferoide del fibroblasto se forma utilizando una modificación de las técnicas descritas para el cultivo de células madre. 22 el esferoide del fibroblasto se transfiere posteriormente en una matriz de fibrina 3D, y consecuencia puede entonces fácilmente supervisar y cuantificar durante varios días. Este protocolo tiene en cuenta el 3D de sistemas fisiológicos incrustando esferoides celulares 3D dentro de una matriz de fibrina, evitando así las limitaciones en relevancia provocada por usar una superficie de crecimiento 2D con una monocapa de células al comportamiento migratorio de la modelo, mientras que que permite para la evaluación del comportamiento de la célula en un ambiente altamente controlado en vitro .
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Protocol
1. día 1: la célula y preparación de los reactivos
Nota: toda la preparación de la célula y el reactivo debe realizarse en un gabinete para prevenir la contaminación de las muestras de seguridad biológica.
- Caliente filtrada Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medio (DMEM), suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina/estreptomicina en un baño de agua de 37 ° C.
- Prepare medios de fibroblastos dérmicos humanos neonatales (HDFn) complementando calentado DMEM con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1% y 1% L-glutamina.
- Descongelar un vial de congelados HDFns y centrifugue durante 8 min a 200 x g para eliminar medio criopreservación. Resuspender las células en medios de HDFn preparados a una densidad de 1 x 10 6 células/mL y semilla en un frasco de cultura T-75.
- Matraz de lugar en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para permitir la proliferación celular.
- Tienda HDFn media a 4 ° C.
- Preparar los pro y anti migratory reactivos según sea necesario.
2. Día 3: Esferoide preparación
- haga lo siguiente en una campana para prevenir la contaminación de las muestras de cultura.
- Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, aspirar los medios de comunicación y añadir 5 mL de 0.25% tripsina-EDTA. Frasco de tienda en una incubadora de 37 ° C por 5 min separar completamente las células de la superficie del frasco.
- Añadir 5 mL de medio caliente al matraz para neutralizar la tripsina.
- En un tubo de microcentrífuga, mezclar 10 μL de azul tripán y 10 μL de la suspensión celular.
- Centrifugar la suspensión de la célula original durante 8 min a 200 x g.
- Mientras que la suspensión de células es ser centrifugada, añadir 10 μL de la suspensión de células de azul de tripano a un hemocitómetro y realizar un conteo de.
- Después de centrifugación, aspirar los medios de comunicación sin el desalojamiento de la pelotilla de la célula. Resuspender el precipitado de células en una concentración de 1,25 x 10 5 células/mL.
- Añadir 5 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS) en la parte inferior de una placa de Petri para mantener un ambiente hidratado durante el crecimiento del esferoide de 10 cm.
- Invertir la tapa de la caja Petri. Añadir varias 20 gotas de μL de la suspensión de células en la superficie interna de la tapa de la caja de Petri.
- Rápidamente invertir la tapa nuevamente y colocar en el fondo de la fuente, teniendo cuidado de no desplazar las gotas de la suspensión. la figura 1 ilustra correctamente formados colgante gotas.
- Cuidadosamente coloque el plato en una incubadora de 37 ° C y esferoides en colgante gota cultura durante un período de 72 h.
3. Día 6: Incorporación de esferoides en matriz 3D
- haga lo siguiente en una campana para prevenir la contaminación de las muestras de cultura.
- Para la formación de la primera capa de fibrina, crear una solución de coágulo de volumen suficiente para añadir 100 μL de solución de coágulo por pozo para tantos pozos como necesaria (1 esferoide por pozo). Coágulos se componen de 10% 10 X HEPES del almacenador intermediario por volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), fibrinógeno humano 2 mg/mL y 0,1 U/mL humano alfa de la trombina. El resto del volumen del coágulo se compone de agua ultrapura.
- Añadir trombina última y rápidamente agregue una solución a pozos deseadas en una placa de 48 pozos para impedir que coágulos de polimerizarse antes de ser añadido a los pozos.
- Agitar suavemente/tap bien placa para asegurar que la mezcla del coágulo de fibrina es capa todo el bien y luego colocar la placa bien en la incubadora durante 1 hora permitir que la capa inferior de clot polimerizar. No sacuda la placa bien dura inducir la formación de burbujas; simplemente la placa de roca como sea necesario hasta que la totalidad del pozo es revestida. Si se utilizan volúmenes de coágulos más grandes, este paso puede no ser necesario.
- Transferencia esferoides a la capa de fibrina.
- Quitar bien la placa y la placa de Petri que contiene esferoides en el colgante gota de cultivo de la incubadora y examinan esferoides bajo un microscopio. Luego coloque el plato en la campana de cultura.
- Invertir cuidadosamente la tapa de la caja Petri para permitir el acceso al colgante gota culturas.
- Cuidadosamente con una aguja de 21 G conectada a una jeringa de 1 mL, transferir una gota de la tapa invertida en el centro de cada bien, teniendo cuidado de no para perforar la capa de fibrina polimerizada cubriendo el fondo del pozo. Para transferir efectivamente la gota, Jale lentamente la caída en la aguja. Dejar de tirar el émbolo hacia atrás tan pronto como la caída de toda está dentro de la aguja; tirando la caída hacia atrás demasiado lejos puede introducir burbujas de aire, que pueden alterar imágenes posteriores o transferencia efectiva esferoide.
- Examinar la placa bien bajo un microscopio para asegurarse de que esferoides han transferido correctamente en pocillos todo deseados.
- Para la formación de la segunda capa de fibrina, crear otra solución de coágulo, con la misma preparación que el anterior para la creación de la primera capa de fibrina (paso 3.2). Cuidadosamente Pipetee 100 μL en cada gota que contiene el esferoide y examinar bajo el microscopio para asegurarse de que los esferoides están todavía intactos y no han empujado a los bordes de los pozos.
- Devolver la placa bien a la incubadora y permitir que la segunda capa polimerizar por 1 h.
4. Día 6: Adición de factores inhibitorios o Pro migratorias
- medios de HDFn caliente a 37 ° C.
- Siga los siguientes pasos en una campana para evitar la contaminación.
- Preparar los medios de comunicación para cada grupo incluyendo las concentraciones adecuadas de agentes pro/anti-migratory evaluarse.
- Quitar la placa de la pozo de incubadora y el lugar en una campana de cultura.
- Añadir 500 μL de medio estándar a cada pocillo del grupo control esferoide, 500 μL de inhibitoria media a cada pocillo del grupo inhibe migración esferoide y 500 μL de medios pro migratorias en cada pocillo del grupo de mayor migración esferoide.
- Devolver la placa de la pozo a la incubadora de.
- Medios de cambio cada 48 h.
5. Días 6-9: evaluación de la migración celular y la proliferación
- imagen esferoides mediante microscopía brightfield inmediatamente después de la adición de medios (0 h) y luego cada 24 h por 72 h. opcional: en cada momento, tomar una imagen de z-stack para determinar si migración es que ocurre en planos fuera del área principal de enfoque. En nuestra experiencia esto no ocurre; sin embargo, es útil para asegurarse de esto es el caso en todos los experimentos.
- Uso de ImageJ para determinar extensión de células en cada pozo analizando por ciento aumento de superficie para cada esferoide trazar la frontera de la célula para cada esferoide en cada momento sucesivo y utilizando la " medida " función para obtener el área de.
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Representative Results
Cultura de esferoide puede ser utilizada para evaluar con éxito el efecto de agentes profesionales y anti migratorios sobre la migración de fibroblastos in vitro
Esferoides 3D del fibroblasto pueden ser formados vía colgante gota cultura durante un periodo de 72 h (figura 1). Tras el período de la cultura, esferoides se encajan dentro de la matriz del coágulo y reflejada mediante microscopía de campo luminoso (figura 2). Las áreas iniciales de los esferoides (mostrados en la figura las zonas delimitadas por bordes blancos) fueron determinadas mediante ImageJ y utilizan como punto de referencia para determinar el grado de consecuencia subsecuente de la célula de los cuerpos de esferoide. Mediciones de área inicial promedio para los esferoides determinaron que 4.3 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 de los esferoides de control, 4.4 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 para pro-migratorios esferoides y 4.5 x 104 ± 7.7 x 103 μm2 esferoides anti migratorias. Medios que contienen factores de pro o anti migratory fue agregado a los coágulos que contiene el esferoide, y consecuencia de la célula del cuerpo esferoide inicial era reflejada cada 24 h, con imágenes finales 72 h después de que el medio original fue agregado (figura 3).
Al finalizar el experimento, crecimiento del esferoide con el tiempo se analizó mediante ImageJ para calcular los cambios en el área de esferoide para cada muestra. Como se muestra en la figura 3, el borde exterior de la agrupación de células en cada momento se utilizó para determinar el grado específicos de consecuencia de la célula. Esperamos que los puntos fuera de enfoque se muestra en la figura 3 son restos de células, y no contamos esto en la cuantificación. Imágenes de tamaño completo muestran un borde de célula clara, continua saliendo el cuerpo esferoide; es esta frontera que se traza cuando se determina la consecuencia. Consecuencia de la célula se cuantificó por la normalización de la zona de consecuencia de la célula en relación con el área de cuerpo esferoide original en t = 0 h y entonces expresando el crecimiento como un porcentaje del área original del esferoide. Cuantificación de la consecuencia de la célula durante el período de 72 h revela que esferoides expuestos a un agente pro migratorias exhiben un grado significativamente mayor de migración lejos del cuerpo esferoide original en comparación con esferoides expuestos a un agente inhibidor de la migración y esferoides de control expuesto a los medios de comunicación estándar (p < 0.0001, figura 4). Por el contrario, esferoides expuestos a un agente anti migratorio exhibieron significativamente disminuido grado de migración del cuerpo esferoide original comparado con el control de esferoides (p < 0.0001).
Para la comparación, hemos proporcionado un ejemplo de un ensayo de rayado (figura 5). Este análisis fue realizado por la siembra de fibroblastos en 500.000 células/cm2 en 24 placas de pocillos recubiertos con el fibrinógeno 2 mg/mL. Fibroblastos se permitieron crecer durante la noche. La superficie bien entonces estaba rayada con una punta de pipeta, y migración de la célula en la zona cero fue reflejada durante 24 horas. Como se muestra en imágenes representativas que se presenta en la figura 5A, existen limitaciones a este ensayo; arañazos no son muy reproducibles y en algunos casos, los límites no están claramente delineados. Sin embargo, las tendencias generales de la migración en presencia de factores pro y anti migratory son los mismos que los presentes en el ensayo de esferoide 3D, a pesar de la variabilidad mencionada y las diferencias en los modos de la migración. Cabe señalar que las tasas de migración son más rápidas en el ensayo de rayado 2D, en comparación con el ensayo de esferoide 3D. Cierre fue el más rápido en presencia del agente pro migratorias y todas las muestras cultivadas en presencia del agente pro migratorias fueron completamente cerradas dentro de 24 h.
Figura 1 : Fibroblastos dérmicos humanos en colgante gota cultura. Las células quedan en un colgante gota cultura por 72 h para inducir la formación de esferoide. Una parte superior (A) y lateral (B) vista de colgar gota cultura se presentan. (C) esquema que representan vistas de formación esferoide en una gota colgante. La línea negra representa la parte superior de la placa de la esfera rosa representa los medios de comunicación y las esferas púrpuras representan las células dentro del esferoide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Aspecto esferoide después de inclusión inicial en matriz de fibrina (t = 0 h después de la adición de medios de comunicación) reflejada mediante microscopía brightfield con 10 aumentos. (A, D) Esferoide de control; (B, E) Esferoide expuesto al agente anti migratoria en los medios de comunicación; (C, F) Esferoide expuesto al agente pro migratorias en los medios de comunicación. Imágenes se muestran con (D-F) y sin (A-C) las líneas blancas que indican las fronteras para determinar área de consecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Aspecto esferoide después de 72 h fotografiado mediante microscopía brightfield con 10 aumentos. (A, D) Esferoide de control; (B, E) Esferoide expuesto al agente anti migratoria en los medios de comunicación; (C, F) Esferoide expuesto al agente pro migratorias en los medios de comunicación. Imágenes se muestran con (D-F) y sin (A-C) las líneas blancas que indican las fronteras para determinar área de consecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Crecimiento esferoidal sobre 72 h. Agentes migratorios Pro y anti migratorios en los medios de comunicación han demostrado un impacto significativo enmigración de fibroblastos y la proliferación de entornos 3D. N = 3/Grupo; * representa p < 0.0001. Barras de error representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Comparación estándar 2D ensayo cero. (A) imágenes representativas de la migración de la célula en un ensayo de rayado estándar durante 24 horas. Los fibroblastos fueron cultivados en medios condicionados migratory pro o anti factores y diferencias en cierre scratch fueron cuantificadas en el tiempo. (B) cierre por ciento en el tiempo de fibroblastos cultivados en medios anti migratorios o control, pro migratorias. Aunque hay diferencias en los modos de la migración presente en este ensayo 2D vs el ensayo 3D esferoide, tendencias generales de migración siguen siendo constantes. N = 3/Grupo; * representa p < 0.05. Barras de error representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo permite el examen de la migración celular en la cicatrización de heridas asociadas ECMs a través de un modelo 3D en vitro . Un paso crucial en la correcta ejecución del procedimiento es el correcto desarrollo de esferoides de fibroblastos; concentración celular durante la preparación se optimizó para dar una concentración inicial de 2.500 células/drop, permitiendo esferoides de forma fiable durante un período de incubación de 72 h. Si se usa un número insuficiente de células esferoides no pueden agregar efectivamente y pueden romperse aparte a ser transferido y encajado en las capas de fibrina. Si se utilizan diferentes tipos de células, la concentración celular inicial o esferoide, época de maduración tenga que ajustarse para obtener formación esferoide consistente y estable. Tipos de células que proliferan más lentamente que los fibroblastos, una mucho mayor concentración celular inicial puede ser necesaria para asegurar la formación esferoide adecuada dentro de la 72 horas de duración. Las células no deben permanecer en un colgante gota más de 72 h debido a la imposibilidad de cambiar los medios de comunicación en los esferoides en la cultura de la cultura. Las diferencias en tamaño inicial esferoide se esperan debido a la variabilidad biológica inherente; nos dirigimos a esta variabilidad a partir de un número constante de células para reducir al mínimo las diferencias del tamaño máximo posibles formación esferoide y normalización de crecimiento con el tiempo para permitir comparaciones de datos.
El reto principal de la aplicación de este método es la transferencia de esferoides de colgante gota de cultura en la matriz del coágulo. Este protocolo utiliza una aguja y una jeringa para aspirar la gota que contiene el esferoide de la tapa de la caja Petri invertida, pero otros métodos, como el uso de pinzas o de Micropipetas a puntas recortadas, pueden aplicarse también para transferir efectivamente la esferoides de colgante gota a la matriz. Esferoides pueden transferir confiablemente tirando el émbolo de la jeringa espalda ligeramente antes de transferir la gota y asegurándose de que la gota se elabora en la aguja lentamente para que no se introduzcan burbujas de gas en la gota. Émbolo de la jeringa debe solamente ser hacia atrás lo suficiente como para llevar la gota entera dentro de la aguja; tirando de alguno más también introducir burbujas e interfiere con la transferencia confiable de los esferoides en los pocillos de la placa de la pozo. Especializados colgante gota cultura placas también se pueden utilizar para simplificar la cultura esferoide, pero son menos costo eficiente forma de hacerlo que usando simplemente un plato estándar.
Durante la cicatrización en vivo, fibroblastos que invaden el área de la herida producen proteasas de serina extensas que resultan en la degradación de la matriz de fibrina. Posteriormente, estas células sintetizan nueva matriz extracelular, compuesto predominantemente por colágeno, para reparar el tejido dañado. 23 este mecanismo de migración permite invasión controlada que no es captada por nuestro método y representa una limitación del sistema. También hay que señalar que los fibroblastos utilizados en este método secretan proteasas que con el tiempo degradan la red de fibrina; por lo tanto, si a largo plazo (> 72 horas) se desean estudios migratorios, inhibidores de la proteasa, como la aprotinina, deben añadirse a los medios de cultivo celular.
A pesar de estas limitaciones, este método proporciona un método simple, económico y reproducible que estudiar 3D celular migración en vitro. Mientras que proporciona un entorno más fisiológicamente relevante de modelos 2D utilizados, análisis de crecimiento en el modelo 3D descrito mantiene el sencillo análisis proporcionado por modelos 2D. Esferoides son fáciles de visualizar mediante microscopía brightfield o fase simple y, si lo desea, este método puede fácilmente modificar para su uso en microscopía de fluorescencia fluorescencia de etiquetado las membranas celulares y proteínas de la matriz. Este protocolo hace uso de fibroblastos dérmicos humanos neonatales debido al papel de la migración de fibroblastos en reparación/remodelación tisular. Si lo desea, neutrófilos, macrófagos, queratinocitos u otros tipos de células podrían utilizarse en este ensayo para evaluar cómo alteraciones en la estructura del coágulo de fibrina afectan la migración de otros tipos de células implicadas en la cicatrización de heridas. El material 3D también puede ser modificado según sea necesario; según la aplicación deseada, colágeno u otros materiales de matriz 3D pueden usarse en lugar de una matriz de fibrina para proporcionar un modelo fisiológico relevante. Un modelo útil para estudiar la migración de la célula a largo plazo en un entorno de herida-como podría obtenerse con este protocolo utilizando colágeno en lugar de fibroblastos, queratinocitos y fibrina. Los métodos descritos también permiten una mayor flexibilidad y rentabilidad en la migración celular y la herida curativo estudios a través de la implementación de un modelo fisiológico relevantes en vitro en lugar de requerir trabajo inmediato en vivo siguiendo el clásico bidimensional en vitro estudios.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El financiamiento de este trabajo fue proporcionado a través de la Asociación Americana del corazón (16SDG29870005) y la investigación de la Universidad del estado de Carolina del norte y financiación innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
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