Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di valutare l'effetto dei fattori pro - e anti - migratory su migrazione delle cellule all'interno di una matrice tridimensionale di fibrina.
Abstract
Attualmente, maggior parte dei modelli in vitro di cicatrizzazione, come ben consolidate saggi gratta e Vinci, coinvolgono studiando la chiusura della ferita e di migrazione di cellule su superfici bidimensionali. Tuttavia, l'ambiente fisiologico in cui in vivo di cicatrizzazione avviene è tridimensionale, piuttosto che bidimensionale. Sta diventando sempre più chiaro che il comportamento delle cellule differisce notevolmente in bidimensionale vs ambienti tridimensionali; di conseguenza, c'è una necessità per i modelli più fisiologicamente rilevanti in vitro per studiare i comportamenti di migrazione cellulare in chiusura della ferita. Il metodo descritto nel presente documento consente lo studio della migrazione cellulare in un modello tridimensionale che meglio riflette le condizioni fisiologiche di saggi di gratta e Vinci bidimensionale precedentemente stabiliti. Lo scopo di questo modello è di valutare di conseguenza delle cellule tramite l'esame della migrazione cellulare lontano un corpo sferoide incorporato all'interno di una matrice di fibrina in presenza di fattori pro - o anti - migratory. Utilizzando questo metodo, conseguenza delle cellule dal corpo sferoide in una matrice tridimensionale può essere osservato ed è facilmente quantificabile nel tempo tramite microscopia in campo chiaro e analisi dell'area del corpo di sferoide. L'effetto dei fattori pro-migratori e/o inibitori su migrazione delle cellule possa anche essere valutato in questo sistema. Questo metodo fornisce ai ricercatori con un semplice metodo di analizzare la migrazione cellulare in matrici tridimensionali ferita associata in vitro, aumentando così la rilevanza di in vitro delle cellule studia prima dell'uso di in vivo animale modelli.
Introduction
Guarigione delle ferite è un processo complesso che comporta il ripristino dell'integrità del tessuto dopo la lesione. Questo processo è suddiviso in quattro fasi sovrapposte di emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento, che ciascuno sono regolati da una complessa combinazione di stecche solubile, interazioni cellula-matrice e comunicazioni cellula-cellula. 1 , 2 l'orchestrazione di questi spunti controlla una moltitudine di risposte cellulari nella guarigione delle ferite, tra cui, importante, migrazione delle cellule. 3 , 4 migrazione cellulare è un processo altamente dinamico dipendono sia fenotipi cellulari e le proprietà biochimiche e biofisiche del milieu di matrice extracellulare. 5 cellule continuamente sonda loro ambiente extracellulare attraverso vie di integrina-mediata; Questo processo permette che le cellule di percepire una vasta gamma di proprietà di matrice tra cui topografia, rigidità e confinamento. Bidimensionale (2D) analisi della migrazione cellulare dimostra che la migrazione è guidato da formazione di lamellipodi all'avanguardia attraverso la generazione di fasci di filamenti di actina. Conseguente formazione di adesioni focali all'avanguardia, in combinazione con actomiosina guidato contrazione e retrazione del bordo posteriore, guida la cellula in avanti. 6 migrazione cellulare tridimensionale (3D) attualmente non è ben compreso, tuttavia, studi recenti dimostrano che la migrazione 3D è nettamente diverso da quello il afore descritto meccanismo in 2D e probabilmente è guidato dai meccanismi alterative. Ad esempio, gli studi recenti da Petrie et al. ha dimostrato che, a seconda delle proprietà del ECM, celle in matrici 3D possono passare tra lamellipodio e lobopodium guidato meccanismi di migrazione. 7 perché la migrazione cellulare è una componente critica della ferita risposta curativa, modelli 3D di migrazione delle cellule sono critici per capire le risposte fisiologiche a vari stimoli durante la guarigione della ferita. Anche se il comportamento migratore cella su superfici 2D è stato indicato per variare notevolmente dalla migrazione in matrici 3D, modelli più attuali in vitro della migrazione cellulare durante il processo, compreso il saggio di gratta e Vinci ben consolidato, di cicatrizzazione utilizzano 2D colture dello strato monomolecolare. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 più recentemente sviluppati saggi hanno utilizzato una matrice 3D, ma ancora della coltura le cellule in un monostrato in cima la matrice, limitando così la possibilità di veramente ricapitolare la tridimensionalità dell'ambiente delle cellule in vivo. 15
Lo scopo del metodo descritto nel presente documento è quello di studiare la migrazione delle cellule in un modello 3D fisiologicamente rilevante, piuttosto che su una superficie 2D, al fine di ottenere una comprensione più robusta delle risposte di migrazione associati con gli stimoli applicati. Questo metodo permette la valutazione della migrazione cellulare all'interno di una matrice di coagulo di fibrina 3D in presenza di fattori che attivano o inibiscono vie connesse con migrazione cellulare. Una matrice di fibrina è stato scelto per questo metodo per i giochi di ruolo critico della fibrina nelle prime fasi di guarigione della ferita; seguenti lesioni, un coagulo di fibrina sono formata all'interno degli ambienti di ferita per arginare la perdita di sangue e serve come impalcatura per infiltrazione iniziale delle cellule durante la riparazione dei tessuti e il rimodellamento. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 inoltre, fibrina è usata clinicamente come sigillante chirurgico e la composizione dei sigillanti è stata legata alla migrazione cellulare e risultati di guarigione definitiva. Uno studio precedente da Cox et al. studiato la migrazione dei fibroblasti con coaguli di fibrina composto da varia fibrina e trombina concentrazioni allo scopo di ottimizzare un sigillante di fibrina. In questi studi, è stato quantificato la migrazione delle cellule fuori coaguli di fibrina su piatti di plastica. 20 qui presentiamo un metodo che consente la quantificazione della migrazione delle cellule all'interno dell'ambiente 3D della fibrina. Mentre il metodo descritto in questo protocollo specificamente utilizza fibrina, questo modello può essere modificato facilmente per utilizzare materiali alternativi matrice come desiderato, ad esempio collagene o altre matrici 3D. Inoltre, presentiamo l'uso di sferoidi del fibroblasto in questo saggio, poiché la migrazione dei fibroblasti nel letto della ferita è di fondamentale importanza per la sintesi di matrice extracellulare e la riparazione/rimodellamento tissutale. Tuttavia, durante la riparazione processo neutrofili sono il tipo di cella primo di migrare nel letto della ferita, seguito dai macrofagi. Fibroblasti allora cominciano a infiltrarsi l'ambiente della ferita circa 48 ore dopo la lesione iniziale, all'inizio della fase proliferativa del processo di guarigione arrotolato. 19 questo test potrebbe essere facilmente modificato per includere i neutrofili, macrofagi o altri tipi di cellule per valutare come alterazioni nella struttura del coagulo di fibrina influiscono sulla migrazione di questi tipi di cellule. 21
Per implementare questo test, in primo luogo, uno sferoide del fibroblasto è formato usando una modifica delle tecniche descritte in precedenza per la coltura delle cellule staminali. 22 la sferoide dei fibroblasti è successivamente trasferita in una matrice di fibrina 3D, e la conseguenza quindi può essere facilmente monitorata e quantificata per diversi giorni. Questo protocollo prende in considerazione il 3D dei sistemi fisiologici incorporando sferoidi cellulare 3D all'interno di una matrice di fibrina, evitando così le limitazioni nella rilevanza provocata da un uso di una superficie di crescita 2D con un monostrato di cellule per comportamento migratore modello, mentre consentendo comunque per la valutazione del comportamento delle cellule in un ambiente altamente controllato in vitro .
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Protocol
1. giorno 1: cella e preparazione dei reagenti
Nota: tutti i cellulari e reagente preparazione deve essere eseguita in un armadietto per prevenire la contaminazione dei campioni di sicurezza biologica.
- Calda filtrata Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM), siero bovino fetale (FBS), L-glutamina e penicillina/streptomicina in bagnomaria a 37 ° C.
- Media di fibroblasti cutanei umani neonatale (HDFn) di preparare completando riscaldato DMEM con 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 1% L-glutammina.
- Scongelare una fiala di HDFns congelati e centrifugare per 8 min a 200 x g per rimuovere il mezzo di crioconservazione. Risospendere le cellule in preparati HDFn media ad una densità di 1 x 10 6 cellule/mL e semi in un matraccio di cultura T-75.
- Immergere la muffola in un'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2) per consentire la proliferazione delle cellule.
- Media store HDFn a 4 ° C.
- Preparare pro - e anti - migratory reagenti come necessario.
2. Giorno 3: Sferoide preparazione
- eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio di cultura per prevenire la contaminazione dei campioni.
- Quando le cellule raggiungono 80% confluency, aspirare media e aggiungere 5 mL di 0,25% tripsina-EDTA. Boccetta di archivio in un incubatore a 37 ° C per 5 min staccare completamente le cellule dalla superficie del pallone.
- Aggiungere 5 mL di terreno riscaldato al pallone per neutralizzare la tripsina.
- In un tubo del microcentrifuge, mescolare 10 μL di Trypan Blue e 10 μL della sospensione cellulare.
- Centrifugare la sospensione cellulare originale per 8 min a 200 x g.
- Mentre la sospensione cellulare è essere centrifugata, aggiungere 10 μL della sospensione delle cellule di Trypan Blue per un emocitometro ed eseguire un conteggio delle cellule.
- Dopo la centrifugazione, aspirare media senza sloggiare il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare ad una concentrazione di 1,25 x 10 5 cellule/mL.
- Aggiungere 5 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) alla parte inferiore di un 10 cm di Petri per mantenere un ambiente idratato durante la crescita della sferoide.
- Inverti il coperchio del piatto Petri. Aggiungere qualche goccia di 20 µ l della sospensione delle cellule sulla superficie interna del coperchio di Petri.
- Rapidamente invertire nuovamente il coperchio e reimmetterlo sul fondo del piatto, facendo attenzione a non staccare le gocce d'attaccatura. la figura 1 illustra gocce di sospensione correttamente formato.
- Attentamente mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C e consentire sferoidi a crescere in una sospensione goccia cultura per un periodo di 72 h.
3. Giorno 6: Incorporamento di sferoidi in 3D Matrix
- eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio di cultura per prevenire la contaminazione dei campioni.
- Per la formazione del primo strato di fibrina, creare una soluzione di coagulo di volume sufficiente per aggiungere 100 μL di soluzione di coagulo per pozzetto per come molti pozzi come richiesto (1 sferoide per pozzetto). I grumi sono costituiti da 10% 10 X HEPES buffer di volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl 2, pH 7.4), fibrinogeno umano 2 mg/mL e 0.1 U/mL trombina umana alfa. Il resto del volume coagulo è composto di acqua ultrapura.
- Aggiungi trombina Ultima e rapidamente aggiungere soluzione desiderata nei pozzetti in una piastra a 48 pozzetti al fine di impedire la polimerizzazione prima di essere aggiunto ai pozzi di coaguli.
- Delicatamente shake/rubinetto ben piatto per garantire che miscela di coagulo di fibrina è il rivestimento l'intero bene e quindi posizionare ben piatto nell'incubatrice per 1 h per consentire lo strato di coagulo inferiore a polimerizzare. Non agitare bene piatto abbastanza duro per indurre la formazione di bolle; semplicemente rock piastra se necessario fino a quando la totalità del pozzo è rivestita. Se vengono utilizzati più grandi volumi di coagulo, questo passaggio potrebbe non essere necessario.
- Trasferire lo strato di fibrina sferoidi.
Piastra
- Rimuovi il pozzo e la capsula di Petri contenente sferoidi nell'impiccagione goccia cultura dall'incubatrice ed esaminare sferoidi sotto un microscopio. Poi mettere la teglia nel cofano cultura.
- Inverti con cautela il coperchio del piatto Petri per consentire l'accesso per l'impiccagione goccia culture.
- Con attenzione usando un ago 21G collegato a una siringa da 1 mL, trasferire una goccia dal coperchio rovesciato al centro di ogni bene, facendo attenzione a non per forare lo strato di fibrina polimerizzata rivestimento del fondo del pozzo. Per trasferire in modo efficace la goccia, tirare lentamente la discesa nell'ago. Smettere di tirare lo stantuffo al più presto la caduta di intera è all'interno dell'ago; tirando la goccia indietro troppo lontano può introdurre bolle d'aria, che possono interferire con trasferimento efficace sferoide o formazione immagine successiva.
- Esaminare la piastra ben sotto un microscopio per garantire che sferoidi sono correttamente trasferite nei pozzetti tutto desiderate.
- Per la formazione del secondo strato di fibrina, creare un'altra soluzione di coagulo utilizzando la stessa preparazione come sopra per la creazione del primo strato di fibrina (punto 3.2). Con attenzione aggiungere 100 μL in ogni goccia di sferoide-contenenti ed esaminare sotto un microscopio nuovo affinché sferoidi sono ancora intatte e non sono stati spinti ai bordi dei pozzi.
- Restituire la piastra ben nell'incubatore e consentire il secondo strato di polimerizzare per 1 h.
4. Giorno 6: Aggiunta di Pro-migratori o fattori inibitori
- media HDFn calda a 37 ° C.
- Eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio per evitare contaminazione.
- Preparare supporti per ogni gruppo incluso concentrazioni adeguate di agenti pro/anti-migratory da valutarsi a.
- Rimuovere la piastra ben da incubatrice e posto in una cappa di cultura.
- Aggiungere 500 μL di supporti standard per ciascun pozzetto nel gruppo di controllo sferoide, 500 μL di inibitoria media in ciascun pozzetto del gruppo sferoide ha inibito la migrazione e 500 μL di media pro-migratori in ciascun pozzetto del gruppo migrazione avanzata sferoide.
- Riporre la piastra ben nell'incubatore.
- Media di cambiamento ogni 48 h.
5. Giorni 6-9: valutazione della migrazione cellulare e la proliferazione
- immagine sferoidi mediante microscopia in campo chiaro immediatamente dopo l'aggiunta di media (0 h) e quindi ogni 24 h per 72 h. Optional: ogni punto del tempo, prendere un immagine dello stack z al fine di determinare se migrazione avviene nei piani fuori della zona principale di messa a fuoco. Nella nostra esperienza questo non avviene; Tuttavia, è utile garantire questo è il caso in ogni esperimento.
- Uso ImageJ per determinare di conseguenza delle cellule in ogni pozzetto analizzando aumento percentuale della superficie per ogni sferoide traccia il bordo della cella per ogni sferoide in ciascun punto di tempo successivi e utilizzando il " misura " la funzione per ottenere l'area.
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Representative Results
Cultura della sferoide possa essere utilizzata per valutare correttamente l'effetto di agenti pro e anti-migratori sulla migrazione dei fibroblasti in vitro
Sferoidi del fibroblasto 3D possono essere formate tramite sospensione goccia cultura per un periodo di 72 h (Figura 1). Dopo il periodo di coltura, sferoidi sono incorporati all'interno della matrice di coagulo ed imaged utilizzando la microscopia a campo chiaro (Figura 2). Le aree iniziali di sferoidi (raffigurate nella figura come zone delimitate da bordi bianchi) sono state determinate utilizzando ImageJ e usato come punto di riferimento per determinare il grado di conseguenza di successive delle cellule dai corpi della sferoide. Misure di superficie media iniziale per sferoidi sono state determinate per essere 4.3 x4 di 10 μm2 ± 1,1 x 10 μm a4 2 per sferoidi controllo, 4.4 x4 di 10 μm2 ± 1,1 x 10 μm a4 2 per la pro-migratori sferoidi e 4.5 x 104 ± 7,7 x 103 μm2 per l'anti-migratori sferoidi. Supporti contenenti fattori pro - o anti - migratory è stato aggiunto ai coaguli contenenti sferoide e conseguenza delle cellule dal corpo sferoide iniziale era imaged ogni 24 h, con finale immagini scattate 72 h dopo il supporto originale è stato aggiunto (Figura 3).
Al termine dell'esperimento, crescita della sferoide nel corso del tempo è stata analizzata usando ImageJ per calcolare le modifiche nell'area di sferoide per ciascun campione. Come mostrato nella Figura 3, il bordo più esterno del cluster delle cellule in ogni momento è stato utilizzato per determinare il grado di tempo specifico di conseguenza delle cellule. Ci aspettiamo che le macchie di out-of-focus illustrate nella Figura 3 sono detriti cellulari, e non questo contiamo nel nostro quantificazione. Immagini full-size mostrano un bordo di cella chiaro, continuo emergenti dal corpo sferoide; è questo confine che viene tracciato quando si determina di conseguenza. Conseguenza delle cellule è stato quantificato normalizzando l'area di conseguenza cella rispetto all'area del corpo sferoide originale a t = 0 h e poi esprimere la crescita come percentuale dell'area originale della sferoide. Quantificazione della conseguenza delle cellule durante il periodo di 72 h rivela che sferoidi esposti ad un agente pro-migratori presentano un grado significativamente aumentato di migrazione lontano dal corpo sferoide originale in confronto sferoidi esposti a un agente di migrazione-inibitorio e sferoidi di controllo esposti su supporti standard (p < 0,0001, Figura 4). Al contrario, sferoidi esposti ad un agente anti-migratorio hanno esibito significativamente in diminuzione grado di migrazione lontano dal corpo sferoide originale rispetto per controllare sferoidi (p < 0,0001).
Per confronto, abbiamo fornito un esempio di un'analisi di gratta e Vinci (Figura 5). Questa analisi è stata eseguita da semina fibroblasti a 500.000 cellule/cm2 su 24 pozzetti rivestiti con fibrinogeno di 2 mg/mL. Fibroblasti sono stati ammessi a crescere durante la notte. La superficie ben quindi è stata graffiata con una punta di pipetta e migrazione delle cellule nell'area di lavoro era imaged oltre 24 ore. Come mostrato nelle immagini rappresentative presentati in Figura 5A, non ci sono limitazioni a questo test; graffi non sono molto riproducibili e in alcuni casi, i confini non sono chiaramente delineati. Tuttavia, le tendenze globali di migrazione in presenza di fattori pro - e anti - migratory sono gli stessi di quelli presenti nell'analisi della sferoide 3D, nonostante la variabilità di cui sopra e le differenze nelle modalità di migrazione. Si deve osservare che i tassi di migrazione sono più veloci in 2D scratch test, rispetto al dosaggio della sferoide 3D. La chiusura era più veloce in presenza dell'agente pro-migratori e tutti i campioni coltivati in presenza dell'agente pro-migratori erano completamente chiusi entro 24 h.
Figura 1 : Fibroblasti cutanei umani in una sospensione goccia cultura. Le cellule vengono lasciate in una sospensione goccia cultura per 72 h per indurre la formazione della sferoide. Una vista dall'alto (A) e laterale (B) dell'impiccagione goccia cultura sono presentati. Schema (C) raffigurante la vista laterale della formazione della sferoide in una goccia di sospensione. La linea nera rappresenta il top della piastra, la sfera rosa rappresenta i media e le sfere viola rappresentano le cellule all'interno della sferoide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Aspetto sferoide dopo l'incorporamento iniziale nella matrice di fibrina (t = 0 h dopo aggiunta di media) Imaging utilizzando la microscopia in campo chiaro a 10 ingrandimenti. (A, D) Sferoide di controllo; (B, E) Sferoide esposta all'agente anti-migratori nei media; (C, F) Sferoide esposta all'agente pro-migratori nei media. Immagini sono indicate con (D-F) e senza (A-C) linee bianche che indicano i bordi utilizzati per determinare la zona di conseguenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Aspetto sferoide dopo 72 h Imaging utilizzando la microscopia in campo chiaro a 10 ingrandimenti. (A, D) Sferoide di controllo; (B, E) Sferoide esposta all'agente anti-migratori nei media; (C, F) Sferoide esposta all'agente pro-migratori nei media. Immagini sono indicate con (D-F) e senza (A-C) linee bianche che indicano i bordi utilizzati per determinare la zona di conseguenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Crescita della sferoide oltre 72 h. Agenti pro- e anti-migratori nei mezzi di comunicazione sono indicati per avere un impatto significativomigrazione dei fibroblasti e la proliferazione in ambienti 3D. N = 3/gruppo; * rappresenta p < 0,0001. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Confronto di test standard di gratta e Vinci 2D. (A) immagini rappresentative della migrazione cellulare in un'analisi standard di gratta e Vinci più di 24 ore. Fibroblasti sono stati coltivati in media condizionata con fattori pro - o anti - migratory e differenze in chiusura sul gratta e Vinci sono state quantificate nel corso del tempo. (B) percentuale chiusura nel tempo per i fibroblasti coltivati in controllo, pro-migratori, o supporti anti-migratori. Anche se ci sono differenze nelle modalità di migrazione presente in questo test 2D vs l'analisi 3D della sferoide, le tendenze globali di migrazione rimangono coerenti. N = 3/gruppo; * rappresenta p < 0.05. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo permette per l'esame della migrazione cellulare nella guarigione delle ferite associato ECMs attraverso un modello 3D in vitro . Un passo fondamentale nella corretta esecuzione della procedura è il corretto sviluppo di sferoidi del fibroblasto; concentrazione di cellule durante la preparazione è stata ottimizzata per dare una concentrazione iniziale di 2.500 cellule/goccia, permettendo sferoidi per formare in modo affidabile su un periodo di incubazione di 72 h. Se vengono utilizzato un numero insufficiente di cellule, sferoidi non possono aggregare in modo efficace e possono suddividere al momento di essere trasferiti e incorporato negli strati di fibrina. Se vengono utilizzati diversi tipi di cellule, cellula iniziale concentrazione e/o sferoide maturazione tempo potrebbe essere necessario essere regolato al fine di ottenere la formazione della sferoide coerente, stabile. Per i tipi di cellule che proliferano più lentamente di fibroblasti, una concentrazione molto alta di cellula iniziale può essere necessaria per garantire la formazione della sferoide corretto entro l'intervallo di tempo di 72 ore. Le cellule non dovrebbero rimanere in una sospensione goccia cultura più di 72 h dovuto l'incapacità di cambiare supporto su sferoidi mentre nella cultura. Differenze nel formato della sferoide iniziale sono attesi a causa della intrinseca variabilità biologica; affrontiamo questa variabilità, avviando la formazione della sferoide con un consistente numero di cellule per ridurre al minimo le differenze di dimensioni per quanto possibile e normalizzando la crescita nel tempo per consentire per confrontare i dati.
La sfida principale per l'implementazione di questo metodo è il trasferimento di sferoidi da un'impiccagione cultura negli incavi della matrice di coagulo. Questo protocollo utilizza un ago e una siringa per aspirare la gocciolina contenenti sferoide dal coperchio rovesciato di Petri, ma altri metodi, come l'uso di pinzette o di micropipette attaccate al profilato suggerimenti, possono essere applicati anche per trasferire in modo efficace la sferoidi da appendere goccia alla matrice. Sferoidi possono essere trasferiti in modo affidabile tirando lo stantuffo della siringa indietro leggermente prima di trasferire la goccia e assicurando che la goccia è redatto nell'ago lentamente affinché le bolle di gas non vengano introdotti nella goccia. Lo stantuffo della siringa solo dovrebbe essere tirato indietro quanto basta per portare la gocciolina intera nell'ago; tirando indietro qualsiasi ulteriore sarà anche introdurre bolle e interferire con il trasferimento affidabile di sferoidi nei pozzetti della piastra ben. Specializzato sospensione goccia cultura piastre possono essere utilizzati anche al fine di semplificare la cultura sferoide, ma sono un mezzo meno costo efficiente di farlo che semplicemente usando un piatto standard.
Durante la cicatrizzazione in vivo, fibroblasti che invadono la zona ferita producono proteasi della serina vasto che provocare la degradazione della matrice di fibrina. Queste cellule sintetizzano successivamente nuova matrice extracellulare, composta principalmente da collagene, al fine di riparare il tessuto danneggiato. 23 questo meccanismo di migrazione consente di invasione controllata che non viene acquisito con il nostro metodo e rappresenta una limitazione del sistema. Dovrebbe anche essere notato che i fibroblasti utilizzati in questo metodo si secernono proteasi che degraderebbero, nel corso del tempo, la rete di fibrina; Pertanto, se a lungo termine (> 72 ore) gli studi di migrazione sono desiderati, inibitori della proteasi, come ad esempio aprotinina, devono essere aggiunto al terreno di coltura delle cellule.
Nonostante queste limitazioni, questo metodo fornisce un metodo semplice, economico e riproducibile in cui studiare 3D cell migrazione in vitro. Mentre fornendo un ambiente più fisiologicamente rilevante rispetto ai modelli 2D comunemente usati, analisi di crescita nel modello 3D descritto nel presente documento mantiene il dritto in avanti analisi fornite da modelli 2D. Sferoidi sono facili da visualizzare utilizzando la microscopia a campo chiaro o fase semplice e, se lo si desidera, questo metodo può essere modificato facilmente per l'uso in microscopia a fluorescenza di etichettatura fluorescente di membrane cellulari e proteine della matrice. Questo protocollo fatto uso di fibroblasti cutanei umani neonatali a causa del ruolo della migrazione dei fibroblasti in riparazione/rimodellamento tissutale. Se lo si desidera, neutrofili, macrofagi, cheratinociti o altri tipi di cella potrebbero essere usati per questo test per valutare come alterazioni nella struttura del coagulo di fibrina influiscono sulla migrazione di altri tipi cellulari coinvolti nella guarigione delle ferite. Il materiale 3D può anche essere modificato come necessario; a seconda dell'applicazione desiderata, collagene o altri materiali a matrice 3D possono essere utilizzati al posto di una matrice di fibrina per fornire un modello fisiologicamente rilevante. Un utile modello per lo studio a più lungo termine migrazione cellulare in un ambiente simile ferita potrebbe essere ottenuto con questo protocollo utilizzando keratinocytes piuttosto che fibroblasti e collagene, fibrina. I metodi descritti anche consentono una maggiore flessibilità ed economicità nella migrazione cellulare e ferita guarigione studi attraverso l'implementazione di un modello fisiologicamente rilevanti in vitro , anziché richiedere lavoro immediato in vivo Dopo studi classici bidimensionale in vitro .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Finanziamento per questo lavoro è stato fornito attraverso l'American Heart Association (16SDG29870005) e la North Carolina State University Research e innovazione finanziamenti di avviamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
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