C. elegans tarmen som en Model for intercellulære Lumen morfogenese og In Vivo polariseret membran Biogenese på én celle niveau: mærkning af antistoffarvning, RNAi tab af funktion analyse og billedbehandling

Summary

Den gennemsigtige C. elegans tarmen kan tjene som en"i vivo væv kammer" for at studere apicobasal membran og lumen Biogenese på enkelt-celle og subcellulært niveau i flercellede tubulogenesis. Denne protokol beskriver hvordan man kombinerer standard mærkning, tab af funktion genetiske/RNAi og mikroskopiske tilgange til dissekere disse processer på molekylært niveau.

Abstract

Flercellede rør, grundlæggende enheder af alle interne organer, er sammensat af polariseret epitelial eller endothelial celler, apikale membraner foring lumen og basolateral membraner at kontakte hinanden og/eller den ekstracellulære matrix. Hvordan denne særprægede membran asymmetri er etableret og vedligeholdes under orgel morfogenese er stadig et uløst spørgsmål for cellebiologi. Denne protokol beskriver C. elegans tarmen som en model til analyse af polariseret membran Biogenese under tube morfogenese, med vægt på apikale membran og lumen Biogenese. C. elegans tyve-celle enkelt-lags intestinale epitel er arrangeret i en simpel bilateralt symmetrisk tube, tillader analyse på en enkelt celle niveau. Membran polarisering opstår samtidig med polariserede celledeling og migration i tidlige embryogenese, men de novo polariseret membran Biogenese fortsætter gennem hele larve vækst, når cellerne ikke længere formere sig og flytte. Den sidstnævnte indstilling gør det muligt at adskille subcellulært ændringer, der samtidig mægle disse forskellige polariserende processer, vanskeligt at skelne i de fleste polaritet modeller. Apikale-, basolateral membran-, junctional-, cytoskeletal- og endomembrane komponenter kan være mærket og spores gennem hele udviklingen af normal god landbrugspraksis fusion proteiner eller vurderet af i situ antistoffarvning. Sammen med den organisme genetiske alsidighed giver C. elegans tarmen således en unik i vivo model for det visuelle, udviklingsmæssige, og molekylær genetisk analyse af polariseret membran og tube Biogenese. De specifikke metoder (alle standard) beskrevet her omfatter sådan: label intestinal subcellulært komponenter af antistoffarvning; analysere gener involveret i polariserede membran Biogenese ved tab af funktion undersøgelser tilpasses typisk væsentlige tubulogenesis gener; vurdere polaritet defekter under forskellige udviklingstrin; fortolke fænotyper af epifluorescensmikroskop, differential interferens kontrast (DIC) og konfokal mikroskopi; kvantificere visuelle defekter. Denne protokol kan tilpasses til at analysere nogen af de ofte meget bevaret molekyler involveret i epitelial polaritet, membran Biogenese, rør og lumen morfogenese.

Introduction

Generation af cellulært og subcellulært asymmetrier, såsom dannelsen af polariseret membran domæner, er afgørende for morfogenese og funktion af celler, væv og organer¹. Undersøgelser på polariseret membran Biogenese i epitheler forblive en teknisk udfordring, da retningsbestemt ændringer i fordelingen af subcellulært komponenter afhænger af flere på hinanden følgende og sammenfaldende ekstracellulære og intracellulære signaler, der er vanskelige at adskille i de fleste modeller og høj grad afhænge af modelsystemet. Modellen præsenteres her - enkelt-lags Caenorhabditis elegans tarmen - er et væv af udsøgte enkelhed. Sammen med encellede C. elegans ekskretionsorganerne canal (Se ledsager papir på polariseret membran Biogenese i C. elegans ekskretionsorganerne canal)², det giver flere unikke fordele til identifikation og karakterisering af molekyler kræves for polariseret membran Biogenese. Bevarelse af Molekylær polaritet stikord fra gær til manden laver dette simple hvirvelløse organ en fremragende"i vivo væv kammer" at behandle spørgsmål på epitelial polaritet, som er af direkte relevans for det menneskelige system, som stadig er alt for kompleks at tillade den visuelle dissektion af disse begivenheder på enkelt celle niveau in vivo.

Selv om flere bevarede polaritet cues fra (1) extracelluar matrix, har (2) plasma membran og dens vejkryds og (3) intracellulære vesikulære handel været identificeret³, de underliggende principper i deres integration i forbindelse med polariseret epitelial membran og væv Biogenese er dårligt forstået⁴. Klassisk én celle i vivo modeller (e.g.S. cerevisiae og C. elegans zygote) har været medvirkende til at definere principperne for polariseret celledeling og anterior-posterior polaritet og har identificeret kritiske membran-associerede polaritet determinanter (den lille GTPases/CDC-42, partitionering defekte PARs)^5,6, men de afhænger af unikke symmetri bryde stikord (bud ar, sperm post) og mangler junction-sikret apicobasal membran domæner og formentlig er den tilsvarende intracellulære apicobasal sortering maskiner. Vores nuværende viden om organisation af polariseret handel i epitheler, dog bygger primært på pattedyr 2D monokulturer⁷, som mangler fysiologiske ekstracellulære og udviklingsmæssige stikord, der kan ændre holdninger af membran domæner og retninger af menneskehandel baner (et skift fra 2D til 3D i vitro kultur systemer alene er nok til at invertere membran polaritet i MDCK (Madin-Darby canine nyre) celler)⁸. In vivo udviklingsmæssige undersøgelser på epitelial polaritet i hvirvelløse modelorganismer blev oprindeligt udført i flade epitheler, for eksempel i Drosophila melanogaster epidermis, hvor de identificerede de kritiske bidrag af krydset dynamics for polariseret celle migration og cell ark bevægelse⁹og endocytic handel for polaritet vedligeholdelse¹⁰. 3D i in vitro og i vivo analyse af lumen morfogenese i rørformede epitheler i MDCK celler og C. elegans tarmen, henholdsvis, har for nylig identificeret kravet om intracellulære handel for de Novo (apikale) domæne og lumen Biogenese og positionering^11,12,13. Tykkelsen af rørformede (versus flad) epitelceller er en fordel for den 3D analyse af subcellulært asymmetrier da det giver en overlegen visuelle skelnen af den apikale-lumenal membran, apico-lateral vejkryds, lateral membranen, og den positioner af intracellulære organeller. Disse visuelle fordele, C. elegans model tilføjer in vivo indstilling, udviklingsmæssige akse, gennemsigtighed, enkelhed af organ planen, invariante og definerede celle afstamning, analytisk (genetiske) og yderligere fordele beskrevet nedenfor.

C. elegans sig selv er en rundorm rørformet struktur hvis gennemsigtighed og enkle arkitektur gør dens ligeledes rørformede indre organer direkte tilgængeligt for den visuelle analyse af rør og lumen morfogenese. Tyve cellerne i sin tarmen (21 eller 22 celler på lejlighed)¹⁴ er afledt fra en enkelt stamfader celle (E) og udvikle sig fra et dobbelt lag epitel af et intercalation skridt ind i et bilateralt symmetrisk rør af ni INT ringe (fire celler i den første ring; Figur 1 skematisk)^14,15,16. Tarmens afstamning og væv analyse, i første omgang bestemmes af Nomarski optik via nukleare identiteter¹⁷og efterfølgende af Fluorescens mikroskopi via mærket membraner, har givet kritisk indsigt i dens morfogenese, i særlig de celle-selvstændig og celle-ikke-selvstændige krav til dets retningsbestemt celledelinger og bevægelser (f.eks.intercalation, højre-venstre asymmetrier, anterior og posterior tube rotation)^14,18 . Tidlige endodermal celle specifikation og gen regulerende netværk kontrollere udviklingen af denne klonede model orgel er godt præget^19,20. Fokus her, er imidlertid på analyse af polariseret membran og lumen Biogenese i single rørformede celler, og de intracellulære asymmetrier endomembranes, cytoskeletal strukturer og organeller, der ledsager denne proces. Analysen lettes af enkelheden i dette rør, hvor alle apikale membraner (på ultrastrukturelle niveau adskilles på microvilli) står over for lumen og alle basale membraner ansigt ydre rør overflade, med lateral membraner at kontakte hinanden, adskilt fra den apikale membran af knudepunkter (figur 1 skematisk; Se referencer (^16,21) til C. elegans-bestemt organisation af stramme og adherens krydset komponenter). Apikale membran Biogenese er dermed sammenfaldende med lumen morfogenese. Endvidere, størrelsen af voksen tarmcellerne - de største celler af denne lille dyr (med undtagelse af cellen ekskretionsorganerne) - omtrentlige størrelse af et pattedyr celle, tillader i vivo visuel sporing af subcellulært elementer, f.eks. vesikel baner, der er typisk forsøg in vitro- i en kultur parabol.

Med henblik på denne analyse af cellulært og subcellulært er passende mærkning kritisk. Tarm endo - eller plasma-membran domæner, vejkryds, cytoskeletalstrukturer, kerner og andre subcellulært organeller kan visualiseres ved mærkning deres specifikke molekylære komponenter. Mange sådanne komponenter er blevet karakteriseret og fortsætte med at blive opdaget (tabel 1 giver et par eksempler og refererer til ressourcer). For eksempel, har forskellige molekyler skelne de rørformede og/eller vesikulær rum af tarm endomembrane system, fra Skadestuen til Golgi via post-Golgi vesikler til plasma membran, været identificeret²². Den specifikke proteiner (samt lipider og sukker) kan enten være mærket direkte eller indirekte via bindende proteiner. Denne protokol fokuserer på i situ antistoffarvning af faste enheder, en af to standard mærkning teknikker (se den ledsagende papir på ekskretionsorganerne canal tubulogenesis for en beskrivelse af andre teknik² - i vivo mærkning via fluorescerende proteiner fusions - som er direkte anvendelige til tarmen; Tabel 2 giver eksempler på tarmen-specifikke initiativtagere, der kan bruges til at drive udtryk for sådanne fusion proteiner til tarmen). Dobbelt- eller flere mærkning med enten tilgang, eller med en kombination af begge plus yderligere kemisk farvning, giver mulighed for større grundig visuel opløsning og undersøgelse af rumlige og tidsmæssige ændringer i co lokalisering og rekruttering af specifikke molekyler eller subcellulært komponenter (figur 2). Fiksering og farvning procedurerne i denne protokol støtte bevarelsen af grøn fluorescerende proteiner (NGL) mærkning under immunfarvning procedurer. For billeddannelse, de vigtigste punkter for påvisning og karakterisering af tubulogenesis fænotyper via standard mikroskopiske procedurer (Fluorescens dissekere og konfokal mikroskopi) er beskrevet ()figur 3, 4). Disse kan omfatte højere opløsning imaging tilgange, for eksempel superresolution mikroskopi og transmissions Elektron Mikroskopi (ikke beskrevet her).

En nøglestyrke af dette system er evnen til at analysere polaritet i enkelte celler på forskellige udviklingsstadier, fra embryogenese gennem voksenalderen. For eksempel, kan apikale membran domæne og lumen Biogenese spores i hele udvikling på én celle-niveau via mærkning med ERM-1, en yderst velbevarede membran-actin linker den Ezrin-Radixin-Moesin familie^23,24 . ERM-1 visualiserer apikale membran Biogenese (1) under embryonale tube morfogenese, når det sker samtidig med polariserede celledeling og migration (celler flytte apikalt omkring lumen under intercalation)¹⁵; (2) i løbet af sene embryonale og larver tube forlængelse, at provenuet i mangel af celledeling eller migration; og (3) i den voksne tarmen, hvor polariseret membran domæner vedligeholdes (figur 1). I den ekspanderende post mitotiske larve epitel, de novo polariseret membran Biogenese kan således være adskilt fra polariseret væv morfogenese, hvilket ikke er muligt i de fleste i vivo og in vitro- epitelial polaritet modeller, herunder dem med enkelt-celle opløsning (f.eks. 3D MDCK cyste model⁸). Med mærkning for andre komponenter, denne indstilling giver mulighed for (især på L1 larver tidspunkt når celler har en højere cytoplasma/kerne ratio) at skelne de intracellulære ændringer, der er specifikke for polariseret membran Biogenese ( f.eks. omlægning af menneskehandel baner) fra dem, der samtidig kræves for polariseret celledeling og migration.

C. elegans genetiske alsidighed er velkendt²⁵og gør det en kraftfuld modelsystem for Molekylær analyse af biologiske spørgsmål. En undersøgelse på morfogenese, for eksempel, kan starte med en wild-type belastning, en transgene stamme, hvor strukturen af interesse (f.eks. en membran) er mærket med en fluorescerende markør, eller med en tab eller gevinst-af-funktion mutant med en defekt i denne struktur. En typisk omvendt genetisk undersøgelse kan generere en mutant, hvor gen af interesse er slettet i den germline (f.eks. ved en målrettet sletning), ændret ved mutagenese (typisk producere punktmutationer med deraf følgende tab, reduktion eller gevinst i funktion af genet), eller hvor dens udskrift er reduceret med RNAi. Lethed af RNAi af fodring i C. elegans²⁶ også egner sig til udformningen af målrettede skærme, der undersøger en større gruppe af gener af interesse. En genetisk model organisme vel nok største styrke er evnen til at udføre i vivo fremad skærme (fx mutagenese, systematisk eller genome-wide RNAi skærme) at tillade en uvildig undersøgelse af den molekylære årsag til en fænotype af interesse. For eksempel, en fordomsfri visual C. elegans RNAi tubulogenesis skærmen, begyndende med en transgene dyr med ERM-1-mærket apikale membraner, opdagede en spændende reversible intestinal polaritet konvertering og ektopisk lumen fænotype, anvendes her som eksempel for denne form for analyse. Denne skærm identificeret nedbrydningen af glycosphingolipids (GSLs; obligat membran lipider, identificeret via deres GLS-biosyntetiske enzymer) og komponenter af vesikel frakke clathrin og dens AP-1 adapter som de specifikke molekylære defekter forårsager denne polaritet konvertering fænotype, hvilket kendetegner disse handel molekyler som in vivo cues for apikale membran polaritet og lumen positionering^12,13. Når du starter med en bestemt genetisk mutation/morfogenese fænotype, kan sådanne skærme (eller enkelt genetiske/RNAi interaktion eksperimenter) også undersøge funktionel interaktioner mellem to eller flere gener af interesse (Se ledsager papir på den ekskretionsorganerne kanalen for et eksempel på en sådan analyse)². Denne protokol fokuserer på RNAi, som ud over dens evne til direkte identificere det gen, som tab forårsager fænotype i fremad skærme, giver specifikke fordele til analyse af morfogenese. Da genprodukter lede morfogenese ofte arbejde i en dosisafhængig måde, er RNAi som regel en succes i at generere et spektrum af fænotyper. Evnen til at generere informative delvis tab af funktion fænotyper hjælper også til at løse det problem, at størstedelen af vigtige tubulogenesis gener er væsentlige og at deres tab forårsage sterilitet og tidlige embryonale dødelighed. Denne protokol indeholder betinget RNAi strategier for at overvinde denne vanskelighed og foreslår måder at optimere generation af et bredere spektrum af fænotyper, såsom en allel serie produceret af mutagenese.

Protocol

1. Mærkning C. elegans tarmen

Note: Se den ledsagende papir af forfatterne på analysen af ekskretionsorganerne canal tubulogenesis ² til opførelse af væv specifikke fluorescerende markør plasmider og generation af transgene dyr, herunder drøftelser på transkriptionel og translationel fusion proteiner (sidstnævnte kræves for subcellulært lokalisering af et molekyle af interesse). Disse procedurer kan tilpasses ved hjælp af specifikke initiativtagere til at køre molekyle af interesse til tarmen. Se tabel 1 eksempler på molekyler vist sig nyttige til at visualisere C. elegans intestinal endo - og plasma membraner og deres knudepunkter, tabel 2 eksempler på initiativtagere til kørsel udtryk til tarmen, og tabel 3 for ressourcer til mere omfattende samlinger af intestinal markører og promotorer.

1. Antistoffarvning af C. elegans tarmen ^{27 , 28}
   1. fiksering
      1. tage et rent glas dias og bruge poly-L-lysin til generere en tynd film til orme til at holde på. Sted 30 µL 0,1-0,2% poly-L-lysin på dias og sted et andet dias på poly-L-lysin drop at gøre en " sandwich ". Så gnide dias forsigtigt et par gange til våd hele overfladen af begge og lad dem lufttørre i 30 min. etiket i matteret side dias med blyant.
         Bemærk: 0,2% poly-L-lysin delprøver af 200 µL blev foretaget ved at opløse pulveret i dH ₂ O; Dette kan opbevares ved-20 ° C. Brug høj molekylvægt poly-L-lysin til forbedret stikning af orme. Koncentrationen af poly-L-lysin er også kritisk. Alt for lave koncentrationer vil tillade ikke orme til stick men også høje koncentrationer kan generere fluorescens baggrund signal. En for tyk film kan løsne i sin helhed.
      2. Placerer en flad metal blok fast på bunden af en container (f.eks. en polystyren container) fyldt med flydende kvælstof.
         Bemærk: Man kan bruge tøris i stedet, men flydende kvælstof holder en metal blok mere stabil i container bunden og kulderystelser godt.
      3. Indsamle orme enten ved vask dem off deres plader med M9 ²⁹ eller vælge forskellige fase orme (enten æg, L1, L2, L3 og L4 larver fase orme) på hvert dias. Typisk, vælge ~ 100 larver og embryoner eller ~ 20 voksne til hver dias. Sted 10 µL vaskes orme på midten af diaset eller pick æg/orme i 10 µL M9 eller 10 µL 1 x PBS ²⁷ (fosfatbufferet saltopløsning).
         1. Brug en pipette til at sprede ud stort antal orme at undgå sammenklumpning.
            Bemærk: Blandet populationer af vaskes af orme, som følge af fortrængning og forskellige tykkelse af faser, ikke holde godt og er mindre effektivt fryse-krakket (se nedenfor), derfor picking fase-specifikke orme (eller synkroniseret populationer) giver bedre resultater. Larverne holder bedre end voksne og flere dyr kan placeres pr. slide.
         2. Før picking orme på dias, overføre dem til en Nematode vækst Medium (NGM) plade ²⁹ uden OP50 bakterier. Overskydende bakterier tilhænger til orme kan også forstyrre stikning. Passe på, at orme ikke tørre ud.
      4. Forsigtigt sted (drop) en 22 mm × 22 mm coverslip Kors-måder på toppen af den indsamlede orme sådan, at dets kanter hænge over mindst én side af diaset. Tryk lige ned forsigtigt men fast med én eller to fingre på coverslip. Undgå klipning der vil skade væv integritet.
      5. Straks og forsigtigt overføre diaset til metal blokken i flydende nitrogen og lad det sidde i ca 5 min til at fryse. Derefter " svirp " coverslip i en swift flytte ved hjælp af overhængende kanten.
         Bemærk: Dette trin skal gøres beslutsomt og mens diaset er frosset for at opnå " sprængning " af neglebånd. Forsigtig: Følg retningslinjerne for PPE (personlige værnemidler) når man arbejder med flydende kvælstof.
      6. Fordybe fryse-krakket diassene i en methanol-fyldt glas Coplin krukke til 5 min. ved-20 ° C. Derefter overføre til en acetone-fyldt glas Coplin krukke til en anden 5 min. ved -20 ° C.
         Bemærk: Methanol og acetone skal opbevares i-20 ° C i mindst 30 min før brug. Efter fiksering, dias kan opbevares ved -20 ° C. forsigtighed: methanol og acetone er giftige.
      7. Fjern dias fra krukken og lad dem lufttørre ved stuetemperatur (RT) før brug.
   2. Farvning
      1. omgiver området af faste orme med et tyndt lag vaseline på diaset. Tegne en cirkel omkring dette område på undersiden af diaset for at markere stedet.
         Bemærk: Det er kritisk at gelé cirkel intakt hele farvning proceduren for at forhindre udsivning af farvning løsninger.
      2. Forbered en " våde kammer " i en plast bin med låg ved at placere vådt papirhåndklæder til det. Placer slide på en rack i dette " våde kammer " til at forhindre udtørring af diasene under farvningen.
         Bemærk: Dias skal ikke være i kontakt med vand eller med hinanden.
      3. Forsigtigt afpipetteres ca 50 µL 1 x PBS i jelly cirklen, nok til at dække området. Tæt på " våde kammer " med låg. Der inkuberes ved RT i 5 min.
         Bemærk: For at undgå at miste orme på dette trin, ikke afpipetteres PBS direkte på orme. Blidt sæt pipette tip på kanten af cirklen og tillader væske at glat sprede over orme.
      4. Vippe diaset og Aspirér langsomt PBS med en pipette. Placer diasset tilbage flade på rack og tilsæt 50 µL (eller det krævede beløb til at dække stedet) blokerer løsning omhyggeligt. Inkuber dette i den våde kammer på RT for 15 min. Mens vi venter, fortyndes de primære antistoffer i blokerende løsning (Se Tabel af materialer til eksempler på primære antistoffer og koncentrationer).
         Bemærk: Frisk forberede blokerende løsning ved hjælp af 1 x PBS (10 mL), 10% tween (50 µL) og mælkepulver (0,2 g). Mængden af vaskemiddel og koncentration af mælk kan variere afhængigt af antistoffer bruges og muligvis skal bestemmes empirisk. Aspiration af væske fra diaset er endnu et skridt til let mister orme. Kontrollere status ved at undersøge dias dissekere omfattet, men passe på at diaset ikke tørre ud.
      5. Vippe diaset og Opsug væk den blokerende løsning, ved hjælp af de samme forholdsregler som beskrevet ovenfor. Placer slide tilbage flade på rack og tilsættes langsomt 50 µL fortyndede primære-antistof, ved hjælp af de samme forholdsregler. Tæt på " våde kammer " og inkuberes ved 4 ° C natten over eller i kortere perioder på RT.
         Bemærk: Inkubationstiden kan være nødvendigt at bestemmes empirisk til et specifikt antistof.
      6. Aspirat off primære antistof løsning som gjort for andre løsninger. Derefter vask dias med blokerende løsning i 10 minutter, 3 gange, tilføje og fjerne løsningen på samme måde som beskrevet ovenfor.
      7. Tilføj sekundære (fluorescently-mærket) antistof fortyndet i blokerende løsning, inkuberes ved RT i 1 h. Se Tabel af materialer til eksempler på sekundære antistoffer og koncentrationer.
      8. Fjerne sekundær antistof og vask, som ovenfor, med blokering løsning 2 gange og rydde ud den blokerende løsning, med 1 x PBS, i 10 min.
      9. Opsug væk så meget PBS som muligt uden tillader modellen til at tørre ud, og fjern forsigtigt jelly omkring prøven.
      10. Tilføje en dråbe montering medium på modellen, og Placer en coverslip forsigtigt på toppen. Forsegle kanterne af coverslip med neglelak. Placer dias i mørke dias for at bevare farvning og gemme i 4 ° C.
          Bemærk: Hold dias i mørke på grund af lysfølsomhed (Fluorescens kan blegne med tiden) og forhindre luft eksponering ved at holde dem lukket, af samme grund. Dias kan opbevares i længere tid ved 4 ° C eller -20 ° C.

2. Interferens med funktionen af væsentlige tubulogenesis gener i C. elegans tarmen. Eksempel: RNAi.

Bemærk: C. elegans stammer er kulturperler på OP50 bakterier seedede på NGM plader efter standardprotokoller ²⁹. For RNAi, C. elegans feed på HT115 RNAi bakterier på RNAi plader suppleret med 25 µg/mL carbenicillin og 2 mM IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) til induktion af bakteriel promotor, der genererer den dobbelt strandede RNA (dsRNA) fra den indførte C. elegans genet. Antibiotika og IPTG koncentration kan variere efter RNAi klon/bibliotek og ønskede RNAi styrke, resp. specifikke RNAi kloner kan være fremstillet af kommercielt tilgængelige genome-wide RNAi fodring biblioteker (Se ( ^{26 , 30 , 31}) for baggrundsoplysninger om fodring RNAi i C. elegans og Tabel af materialer til materialer/reagenser og RNAi biblioteker).

1. Standard RNAi af fodring ^{26 , 31}
   1. Tag RNAi bibliotek plade fra-80 ° C og læg det på tøris. Fjern den forsegling tape og bruge steril pipette tip til at overføre vedhængende bakterier af klon af interesse til LB (Luria bouillon) agar plader ²⁹ suppleret med 100 µg/mL ampicillin og 15 µg/mL tetracyclin. Streak ud bakterier på agar plade. Forsegle RNAi bibliotek plade med en ny forsegling tape. Vokse bakterier natten over ved 37 ° C.
      Bemærk: Disse agar plader kan opbevares ved 4 ° C i flere uger. Nye bakterier kan være kulturperler direkte fra dem til at beskytte de oprindelige RNAi bibliotek.
   2. Næste dag, podes RNAi bakterier fra LB agar plade i 1 mL LB flydende medium ²⁹ indeholdende 50 µg/mL ampicillin hver og ryste for 14 (8-18) h eller natten over ved 37 ° C.
      Bemærk: Optimale resultater bruge friske bakterier hver gang. Se reference ( ³⁰) til sammenligning af forskellige kultur betingelser (fx timingen af kultur).
   3. Næste dag, frø 200 µL pr. klon af kulturperler RNAi bakterier på separate RNAi plader. Lad pladerne tørre og lad på RT natten til induktion af bakteriel promotor.
   4. Overføre 4-6 L4-Stadium larver på hver RNAi tallerken. Inkuber seedede RNAi pladerne på RT eller 22 ° C i 3-5 dage.
      Bemærk: Vælge L4 larver først på en NGM tallerken uden bakterier til at fjerne tilhænger OP50, der vil forstyrre RNAi eller seriefremstillede overføre dem til en ny NGM plade uden OP50 tre gange. Kontroller stammer ikke forurenes, som forurenende bakterier - ligesom OP50 foretrak mad til ormene - vil også interferere med RNAi. Justere temperatur efter behov: fx udviklingen accelererer med højere temperatur; stammer muligvis temperatur følsom.
   5. For udviklingsmæssige undersøgelser, kontrollere fænotyper af F1-afkom fra dag 2 og fremefter.
      Bemærk: Det er afgørende at kontrollere dyrene ofte for at undgå manglende udseende eller progression af en fænotype (f.eks. markør forskydning) Hvornår vurdere polariseret membran Biogenese under udvikling. Berigelse af befolkningens F2 for stærk fænotyper (f.eks. ved at samle overordnet hermafroditter til en ny RNAi plade på dag 2 for at vælge i mest kraftigt påvirket mid del af deres afkom) er sjældent nødvendigt, eftersom et spektrum fra mild til stærk fænotyper er ønskeligt.
2. Betingede RNAi
   Bemærk: RNAi betingelser kan ændres til at reducere alvorlige, eller øge milde virkninger eller at blande etape-specielt; ændringer er nyttige for den fulde vurdering af fænotypisk virkninger af den ofte dødbringende tubulogenesis gener.
   1. Larve RNAi - evaluering af RNAi effekter i den samme generation (mild, fase-specifikke RNAi)
      Bemærk: overvinde sterilitet eller embryonale dødelighed eller forstyrre genfunktion på en bestemt fase post embryogenese, RNAi er induceret i larver, bogføre embryonically. Enten placere ubehandlede æg (2.2.1.1), fælderne voksne (2.2.1.2) eller synkroniseres L1 (eller, hvis det ønskes, senere fase) larver (2.2.1.3) på RNAi plader; evaluere effekterne RNAi i den samme generation, fx to dage senere og fremefter, larver og/eller voksne.
      1. Pick 30-50 fælderne voksne i en slip blegning løsning (et 1: 4 opløsning af 10 M NaOH og husholdningernes natriumhypochlorit) placeret på kanten af et RNAi plade. Lad tørre og tillade L1s at klække og flytte til bakteriel plænen.
         Bemærk: Blegning løsning, almindeligvis anvendes til dekontaminering, vil dræbe alt undtagen embryoner i deres æggeskaller. Derfor ikke placere den blegning løsning på eller tæt på RNAi bakterier.
      2. Pluk eller frø ~ 20 unge fælderne voksne på RNAi pladen og lad dem lægge æg i 2-3 timer, eller indtil der er ca. 300 æg på tallerkenen, derefter slå ned på voksne.
         Bemærk: Denne metode kan forårsage forurening af RNAi bakterier af OP50. For at mindske denne risiko, først overføre voksne på en NGM tallerken uden bakterier til at fjerne OP50 tilhænger til ormene. Passe på, at voksne ikke bliver for lang på RNAi plader til at undgå RNAi effekt på embryoner.
      3. Pluk eller placere L1 fase orme direkte på RNAi plader (Se reference ( ²⁹)-for synkronisering protokoller).
         Bemærk: Man kan bruge en forkortet synkronisering protokol (f.eks. for en moderat storstilet set-up) ved at vaske orme fra tætbefolkede plader med M9 for flere gange, indtil der kun æg tilbage. Efter 2-3h rugeæg L1s kan derefter afhentes i M9 fra disse plader, renset af yderligere vasker at fjerne bakterier (3 x i M9), og seedet på RNAi plader.
   2. Fortynding af RNAi bakterier med tomme vektor RNAi bakterier (mild RNAi)
      Bemærk: reduktion i mængden af dsRNA ved at fortynde mængden af RNAi bakterier kan være tilstrækkelig til at fremkalde mildere effekter og kan også reducere embryonale dødelighed uden at alle embryonale effekter. Fortynding af RNAi bakterier er også brugt til dobbelt RNAi eksperimenter og titreres betingelser for genetiske interaktion eksperimenter (f.eks. til at generere mild for vurdering af ekstraudstyr og stærke virkninger for vurdering af undertrykkelse).
      1. Vokse op RNAi og emPTY vektor HT115 RNAi bakterier i 1 mL LB medium med 50 µg/mL ampicillin, som gjort standardvilkår RNAi.
      2. Fortyndes RNAi bakterier med tomme vektor RNAi bakterier til at opnå en vifte af forskellige koncentrationer, for eksempel, 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. Bland bakterier godt af pipettering op og ned. Tilsæt 200 µL blandet bakterier på et RNAi tallerken.
      3. Pick 4-6 L4 larver på hver RNAi plade. Kontrollere fænotype fra dag 2 fremefter.
   3. RNAi følsomme stammer (stærk RNAi)
      1. bruge tilgængelige RNAi-følsomme stammer, for eksempel, eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) eller eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (den sidstnævnte supersensitive), og følg RNAi standardprocedurer beskrevet i 2.1 ^{31 , 32 , 33}.
         Bemærk: RNAi følsomme stammer (fx rrf-3 og eri-1) kan have en lavere kuld størrelse end wild-type dyr og være sterile ved 25 ° C. De kan også have en lav baggrund af egen fænotyper, fx lav penetrant embryonale dødelighed, som skal tages i betragtning, når de evaluerer specifikke RNAi effekter.

3. In vivo billeddannelse af C. elegans tarmen af fluorescens dissekere mikroskopi

1. før visualisere dyr under fluorescens lys, kontrollere RNAi plader under skarpt lys på enhver dissekere mikroskop. Vurdere (og potentielt optage) fænotyper synlig under skarpt lys, der kan påvirke analysen, som dødelighed, sterilitet (lavere antal afkom), udviklingsmæssige (f.eks. larve anholdelsen) og andre synlige fænotyper, der kan hjælpe karakterisere funktionen af et gen, der er involveret i polariserede membran Biogenese og lumen morfogenese.
   Bemærk: Kun score plader, der har tilstrækkeligt afkom for evaluering (mindst 50), ellers Prøv alternative RNAi betingelser. Kvantitative evaluering Sørg for, at pladerne ikke forurenes eller vokse OP50, (der interfererer med RNAi).
2. At visualisere dyr under fluorescerende lys, fjerne låget og lægge RNAi pladen direkte under dissekere fluorescens mikroskop.
   Bemærk: For at registrere subtile intestinal fænotyper skal en dissekere mikroskop med en højere magt stereo fluorescens udlæg, der giver mulighed for et tilstrækkeligt udvalg af forstørrelse. Denne protokol beskriver brugen af et område med en 1,5 og 10 x mål og et zoomområde fra 3,5 til 45.
3. Først finde dyr under lys til at fokusere. Dernæst undersøge dyrene under fluorescerende lys ved lav forstørrelse (f.eks. under målet om 1,5 x), ved hjælp af passende filteret. Undersøge plade systematisk fra øverste venstre hjørne til nederste højre hjørne til at scanne hele pladen for fænotyper.
4. Vælg dyr af renter og ændre til 10 x mål. Fokusere på tarmen og brug zoom til at vurdere tubulogenesis/lumen morfogenese fænotype. Se afsnit 5 for scoring af fænotyper. Først, tage billeder ved lav forstørrelse. Derefter skifte til høj forstørrelse.
   Bemærk: Da sunde dyr bevæge sig hurtigt, arbejde hurtigt, med den ene hånd på computermus til billede erhvervelse samtidig fokusere mikroskop med anden hånden. Aftagende dyr (f.eks. af forbigående placering af plader til 4 ° C) kan ikke være påkrævet når arbejder med tubulogenesis fænotyper i for det meste anholdt embryoner og tidlige larver. Billederne kan blive fanget af et mikroskop-monteret CCD kamera og image capture software.

4. Imaging C. elegans tarmen på højere opløsning af laser scanning konfokalmikroskopi ^{34 , 35}

1. montering og immobilisering
   1. Brug fingerspids til tyndt spredt en lille mængde smørefedt eller vaseline i en cirkel på et glas dias (~ 6-8 mm i diameter).
      Bemærk: Tykkelse af fedt cirkel er kritisk for montering. For bedste imaging resultater, billede kun én eller flere larver ad gangen og bruge en ultratynde fedt cirkel med som lille væske som muligt således, at dyret er direkte fast mellem glas dias og dække slip (hvis gjort perfekt, dyret vil være immobiliseret uden bedøvelse). Montering af æg og ældre dyr kræver en lidt tykkere cirkel for at undgå ødelæggelse af prøven, når du tilføjer dække slip.
   2. Tilsættes en dråbe af typisk 3.5 µL 10 mM natrium indeholder løsningen ind i midten af cirklen og vælge orme i det dissekere mikroskopet.
      Bemærk: Forberede en 1 M natrium indeholder stamopløsning ved at opløse 65.01 mg NaN3 i 1 ml dH ₂ O; tilføje 200 µL i denne løsning til 1M ind i 20 mL M9 buffer. Vælge orme hurtigt til drop af natrium indeholder løsning til at undgå løsning til at tørre ud. Vælge faser særskilt for optimal montering, med henblik på omkring 50 embryoner pr dias og ca. 20 larver når undersøge større populationer. Man kan bruge M9 i stedet for natrium indeholder løsning, når picking embryoner. Hvis du bruger natriumazid, dyr skal være afbildet inden for 30 min til at undgå vævsskader af dette giftige kemikalie.
      Forsigtig: natriumazid er giftigt.
   3. Blidt sted en 22 mm × 22 mm coverslip på diaset. Vær omhyggelig med ikke at knuse ormene. Brug mild pres og tjek under dissekere mikroskop for at sikre orme er fast godt mellem dias og dække slip. Label diaset.
      Bemærk: Den rigtige mængde af pres er afgørende for at undgå at beskadige modellen (for meget pres) og ikke løse det godt (for lidt pres: dyr flyde i stedet for stikning til diaset). Flydende dyr hovedsagelig hinder passende imaging.
2. Imaging
   1. sted dias under Konfokal mikroskop. Søg efter orme med 10 x mål og fokus.
      Bemærk: Bruge lys til at fokusere, hvor det er muligt at undgå photobleaching.
   2. Ændring 60 x eller 100 x mål og fokus på tarmen.
      Bemærk: Tarmen kan let identificeres under lys af sin lumen løber gennem midten af dyr fra svælget til anus nær spidsen af halen. Vær forsigtig, når du anvender olie 60 x eller 100 x olie mål. Blande forskellige typer af olier kan interferere med yderligere imaging. Sted lille dråbe olie på dias når ved hjælp af en opretstående mikroskop eller på mål når du bruger en omvendt anvendelsesområde, pas på ikke for at forurene andre målsætninger eller dele af mikroskopet.
   3. Etablere Kohler DIC/Nomarski belysning til de mål, der bruges til scanning af ³⁶. Inspicere dyr under fluorescerende lys med passende kanal at kontrollere mærkning af tarmen og/eller kontrollere fænotype, for at vælge egnet prøvemateriale til billedbehandling. Arbejde hurtigt for at undgå blegning.
   4. Switch til laser scanning for at begrænse potentielle billede til tarmen ved at scanningen grænser på sin dorsal og ventral side.
      Bemærk: Bracketing tarmen på denne måde er kritisk, hvis fluorophore også etiketter strukturer uden for tarmen. Under denne pilot scanning, arbejde med hurtig scanning betingelser til avOID photobleaching.
   5. Stopper scanning for at vælge scanning parametrene for eksperimentet. Sæt 6-20 sektioner for intestinal scanning langs z-aksen, fx med 0,2 µm mellemrum, afhængigt af undersøgelsen etape af animalsk og/eller tekniske overvejelser. Sæt ramme gennemsnit pr. billede afhængigt af kompleksiteten af mærkning og kræves opløsning til at reducere støj.
      Bemærk: Indstillingen detaljer afhænger af mikroskop og eksperimentere. Man kan være nødvendigt at reducere mængden af sektioner til at undgå blegning hvis udførelse af sekventielle scanning af tre forskellige fluorophores. Justere antallet af rammer for antal sektioner (bør være lavere end antallet af sektioner til at undgå billedforvrængning; også vejer i stigningen i photobleaching). 4-6 rammer er normalt tilstrækkelig.
   6. Gå tilbage til scanning med endelige (langsom) laser scanning betingelser og justere: lysstyrke (brug mindst gevinst at reducere baggrund); laser power (så højt som nødvendigt, så lavt som muligt - stigninger photobleaching; normalt minimum indstilling er tilstrækkelige); pinhole (undgå åbning hvis ikke forpligtet til at opretholde resolution).
      Bemærk: Scanning betingelser afhænger af modellen og skal bestemmes empirisk i begyndelsen af den scanning session. Sørg for, at lysstyrken ikke overstige mætning (vil begrænse muligheden for at redigere billedet senere af imaging software). Ved fastsættelsen af scanning betingelser, også overveje at identiske betingelser skal anvendes for alle billedbehandling i eksperimenter, der sammenligner forsøgsdyr med kontrolelementer.
   7. Opsamling billede serie. Flette billeder ind i en enkelt fremskrivning billede.
      Bemærk: Muligvis gemme projektion billeder og/eller overlejringer separat afhængigt af mikroskop.
   8. Når du tager billeder multi kanal bruge sekventielle scanning for at undgå gennemblødning mellem kanaler (kritisk for Co lokalisering undersøgelser).
      Bemærk: Billedindstillinger muligvis ændres givet øget photobleaching tilsluttet længere scanningstiden.
   9. Altid erhverve tilsvarende DIC/Nomarski billeder (sektioner) til vartegn og overordnede tilstand af morfologi af scannede dyr.

5. Kvantificering af polariseret membran Biogenese defekter i C. elegans tarmen

Bemærk: eksempel: Basolateral forskydning af apikale ERM-1::GFP og ektopisk laterale lumen dannelse induceret af Lad-767 og ApS-1 RNAi.

1. Scoring fænotyper under dissekere mikroskop ( figur 5 A, D, E)
   1. definere kategorier for scoring. Eksempel: a wild-type (WT), (ii) basolateral forskydning af ERM-1::GFP (polaritet defekt), og (iii) ektopisk lumen dannelse (udvikler efter basolateral forskydning).
      Bemærk: En lav forstørrelse visuel analyse egner sig til scoring antal dyr med eller uden en specifik fænotype. Her, vi har valgt et eksempel på tre kvalitativt forskellige fænotypiske kategorier, der er på den samme tid vejledende for en forværring af den polaritet fænotype, der er analyseret. Men en lang række forskellige kvalitative og kvantitative fænotyper kan blive scoret, såsom lumen morfogenese defekter, fravær/tilstedeværelse (eller tal) af normal god landbrugspraksis positive cytoplasmatisk vacuoles, lumen diameter og størrelse eller antal intralumenal cyster (Se < stærk class = "xfig" > figur 3 for eksempler).
   2. Afhængigt af på omfanget af forventede forskelle, score ca 100 levende orme på deres agar plader under dissekere mikroskop i en dobbelt eller tredobbelt sæt eksperimenter.
      Bemærk: Man skal score alle dyr, der kommer til syne ved scanning plader systematisk, fx fra øverste venstre til at sænke ret af pladen (Sørg for orme har befolket plader jævnt).
   3. Gentag dette for 3 uafhængige sæt eksperimenter. Generere bar graf og vurdere betydningen af resultater.
2. Scoring fænotyper under Konfokal mikroskop ( figur 5 B)
   1. definere kategorier for scoring, fx antallet af ektopiske lumen pr. dyr
      Bemærk: en højere forstørrelse visuel analyse egner sig til scoring en kvantificerbar markør eller fænotype pr. dyr og giver mulighed for scoring af subcellulært markører, der ikke kan være mærkbar af dissekere mikroskopi. Den nuværende eksempel på optælling ektopisk lumen pr. dyr i en delmængde af orme i samme eksperiment tidligere evalueret af dissekere mikroskopi (5.1.1, kategori 3) forædler evaluering af forværrede polaritet fænotype, der er undersøgt her. Imidlertid en række andre fænotyper eller parametre kan blive scoret, fx antallet af vesikler, tilstedeværelse eller mangler eller antallet af subcellulært komponenter, der co lokalisere fluorescens intensitet (sidstnævnte kvantificeres ved ImageJ; Se ledsager papir på den ekskretionsorganerne canal) ².
   2. Afhængigt af omfanget af forventede forskelle, kvantificere fænotypiske markør (her, ektopiske lumen) i ca. 20 dyr i en dobbelt eller tredobbelt sæt af forsøg under Konfokal mikroskop.
   3. Repeat for 3 uafhængige sæt eksperimenter. Generere søjlediagrammer og vurdere betydningen af resultater.

Representative Results

Denne protokol beskriver, hvordan molekylemæssigt analysere og visualisere polariseret membran Biogenese og lumen morfogenese i C. elegans tarmen på enkelt celle og subcellulært niveau. Tyve-celle enkelt-lags C. elegans tarmen er dannet af styret celledeling og migration i midten af embryogenese. På dette tidspunkt, polariseret membran domæner blive etableret, men de novo polariseret membran Biogenese fortsætter i den modne, men udvide epitel i hele fire larve stadier indtil voksenalderen, gør det muligt at fokusere analysen på polariseret membran Biogenese (figur 1A).

For at visualisere C. elegans cellulært og subcellulært komponenter, to strategier er almindeligt anvendt: immunofluorescens (detaljeret i denne protokol, punkt 1; Figur 2 , Figur 4D -F) og udtryk for fluorescens fusion proteiner (beskrevet i den ledsagende papir på ekskretionsorganerne canal polariseret membran Biogenese²; Figur 1B, figur 2, figur 4, figur 5 c). Dobbelt og flere mærkning, kombinere forskellige etiketter for hver eller begge metoder kan løse membran asymmetrier såsom apikale og basolateral membran domæner, og forholdet mellem forskellige subcellulært komponenter til hinanden (figur 2, Figur 4D-E). Membran-cytoskeleton linker ERM-1::GFP er vist her som en indikator for apikale membran Biogenese, der falder sammen med lumen morfogenese i denne single-lag epitel. Ved hjælp af denne markør, en bred vifte af intestinal apikale membran/lumen Biogenese defekter og deres forårsagende gendefekter kan identificeres ved tab af funktion undersøgelser, for eksempel af uvildige genome-wide skærme ved hjælp af RNAi (RNAi tilgange vedtaget at den generation af sådanne fænotyper er beskrevet i afsnit 2 i denne protokol). Figur 3 og figur 4 viser eksempler på lav til moderat forstørrelse billeder af apikale membran/lumen Biogenese fænotyper erhvervet af en dissekere fluorescens mikroskop udstyret med en høj effekt mål; og højere forstørrelse billeder erhvervet ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop (disse mikroskopiske tilgange er beskrevet i afsnit 3 og 4). Som et eksempel på kvantificere polariseret membran Biogenese defekter, virkningerne af RNAi med Lad-767 (kodning en steroid dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA reduktase) og aps-1 (kodning sigma underenhed af clathrin AP-1 adapter) på ERM-1::GFP lokalisering og lumen placering er vist i figur 5.

Figur 1 : Cellulært og subcellulært struktur og morfogenese af wild-type C. elegans tarmen. (A) Skematisk af C. elegans intestinal udvikling, cellulære sammensætning, og endo- og plasma membraner. C. elegans tarmen genereres alsidighed fra E blastomer født på de 8-celle stadium. Efter fire runder af celledeling, dens 16 celler (E16 fase) form en radially symmetrisk fordoblet-lag epitel¹⁵. På dette stadium polarizes cytoplasma af hver celle med kerner flytter til de fremtidige apikale, og cytoplasmatisk komponenter på vej mod modsat (fremtidige basal), membran domæner. I ét intercalation trin flytte venstre og højre ventrale celler (sideløbende) i den dorsale cellelag at danne 9 INT ringe bilateralt symmetrisk tube. Hver celle ansigter og bygger lumen med sin apikale/lumenal membran (grøn, strukturelt adskilles på specifikke membran microdomains, microvilli) og kontakter tilstødende celler eller kroppen hulrum med sin basolateral membraner (blå), undtagen først INT ring, der er dannet af fire celler. Apikale vejkryds (rød) separat apikale og basolateral membran domæner. Efter intercalation fortsætter de novo membran Biogenese sammen med væksten i tarmen under sent embryogenese og de fire larve faser ind i voksenalderen, hvor kun minimal yderligere vækst opstår (fase af polariseret membran vedligeholdelse ). Den forstørrede enkelt celle angiver endomembrane system med ER og Golgi ovenfor kernen (N) og endosomal blærer. (B) DIC/Nomarski og konfokal overlapning micrographs af udvikle C. elegans tarmen mærket med den apikale membran-cytoskeleton markør ERM-1::GFP. Tarmen på stadiet komma er skitseret af en hvid streg (ERM-1::GFP er allerede svagt til udtryk på den apikale membran i begyndelsen af intercalation men kan ikke blive værdsat i dette billede). Dyr ned her og nedenfor er vist med forreste (hoved) venstre, bageste (hale) lige, dorsale op, ventrale. Skalalinjen: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Eksempler på dobbelt og tredobbelt mærkning af udviklingslandene wild-type C. elegans tarmen ved hjælp af antistoffer og fusion proteiner. (A, B) Embryoner. (A) komma fase. PAR-6::GFP (grøn, komponent af den apikale PAR polaritet komplekse), sub-par-3 antistof (rød/TRITC (tetramethyl rodamin isothiocyanat), en anden komponent af den apikale PAR polaritet komplekse) og MH33 (blå/Cy5 (Cyanine5), anti-IFB-2/mellemprodukt glødetråden). PAR-6::GFP og PAR-3 antistof label den apikale membran af C. elegans tarmen (parentes). IFB-2, en anden apikale markør i senere faser, er panmembraneously lokaliseret på dette tidlige tidspunkt. PAR-6::GFP og sub-par-3 også label svælget (venstre); intestinal lumen er angivet med deres overlapning med IFB-2 (turkis) og tarm røret er skitseret af blå anti-IFB-2 (højre). (B) 2-fold fase. AJM-1::GFP (grøn, krydset komponent), ICB4 antistof (rød/Alexa, ICB4 registrerer en ukendt membraneous tarm antigen). AJM-1::GFP etiketter apikale knudepunkter af C. elegans tarmen, synlig som peri-lumenal stigen mønster (det også etiketter hypodermal vejkryds, ikke synlige siden billedet er fokuseret på tarmen, se afsnit 4, Konfokal imaging). ICB4 pletter alle membraner af C. elegans tarmen. Pilene peger basolateral membraner plettet af anti-ICB4. (C, D) L2 larver. (C) Lad-413::GFP (grøn), phalloidin (rød/Texas-rød, en phallotoxin binding til F-actin) og MH33 (blå/Cyanine5, anti-IFB-2). Lad-413/kradse er en del af den basale polaritet komplekse og lokaliserer til basolateral membraner af C. elegans tarmen (parentes). Phalloidin og IFB-2 antistof label apikale submembraneous cytoskelet af C. elegans tarmen (lilla). Phalloidin pletter også kraftigt kroppen væggen muskler, overvældende intestinal farvning. Inset viser højere forstørrelse af boxed område. (E) L3 larve. SLCF-1::GFP (grøn; integreret membRane komponent/sukker transporter), ERM-1::mCherry (rød) og MH27 antistof (blå/Cyanine5, anti-AJM-1). SLCF-1::GFP etiketter basolateral membran, mens ERM-1::mCherry etiketter den apikale membran af C. elegans tarmen (bracket); AJM-1 etiketter sin apikale vejkryds. (F-F''') L2 larve. (F, F') Enkelt farvebilleder. SLCF-1::GFP (grøn) etiketter basolateral membran (lateral membraner angivet med tynde hvide pile). MH27 (blå/Cyanine5) etiketter apikale vejkryds (korte gule pile). (F"F''') Overlay billeder med og uden aktin. Mellemværker Vis højere forstørrelse af boxed områder. Bemærk klar skelnen af apicolateral vinkel af tarmcellerne af disse forskellige membran/krydset markører, der vises på overfladen ligner i enkelt Farvebilleder (F, F'). Tykke hvide pile i F'''peger på den apikale/lumenal actin cytoskeleton mærket af phalloidin (ellers overvældet af muskel aktin). Alle billeder er Konfokal fremskrivninger (z-stakke af 0,2 µm), erhvervet af sekventielle scanning for at undgå gennemblødning mellem kanaler. Skalere barer (for A-E, F-F'' ' og alle mellemværker): 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Eksempler på C. elegans tarm polariseret membran og lumen morfogenese defekter ved lav til moderat forstørrelse (dissekere fluorescens micrographs). Alle billeder er erhvervet af en dissekere fluorescerende mikroskop udstyret med en specialfremstillet high-power stereo fluorescens vedhæftet fil (Tabel af materialer). Forskellige forstørrelser er vist. Alle fænotyper blev indhentet af RNAi med forskellige gener i en stamme, der er mærket med ERM-1::GFP (lokaliseret på tarm og ekskretionsorganerne canal apikale/lumenal membraner i embryonale og tidlige larve faser, vist her). Den tarm lumen og polaritet fænotyper er: (A, B) vildtype embryo (A) og larve (B); (C, D) basolateral forskydning af ERM-1::GFP; tarmcellerne forstørres og vises oppustet i dette Foster (C, pilene peger på enkelt tarmcellerne), men er wild-type størrelse og arrangement i disse larver (D, pil peger til laterale membraner mellem INT II og III); (E) udvidet og højtravende lumen i tre embryoner; (F) ERM-1::GFP udvidelse i sideretningen knudepunkt område (zigzag lumen) og ind i tarm cytoplasma, der indeholder normal god landbrugspraksis-negative vacuoles (pile); (G) lumenal cyster inbetween intralumenal sammenvoksninger (pile peg på to cyster). (H) Cytoplasmic og basolateral ERM-1::GFP forskydning med ektopisk lumen (pile); (jeg) ERM-1::GFP forskydning til normal god landbrugspraksis-positive puncta (pile) i cytoplasmaet. Ekskretionsorganerne kanaler og ekskretionsorganerne canal fænotyper er ikke beskrevet her (kanalen er vist til venstre, tarmen til højre i alle billeder). Skalere barer: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Eksempler på C. elegans tarm polariseret membran og lumen morfogenese defekter ved højere forstørrelse (Konfokal billeder). (A, C, E, G, I, K) Embryoner. (B, D, F, H, J, L) Larver. Alle fænotyper blev indhentet af RNAi med forskellige gener i en stamme, der er mærket med ERM-1::GFP (grøn i alle billeder). Imaging er fokuseret på tarmen. Billeder af embryoner viser også ekskretionsorganerne kanaler (venstre side af billedet), herunder canal fænotyper (ikke beskrevet). (A, B) Vildtype embryo (A) og larve (B). (C) Basolateral forskydning af apikale ERM-1::GFP (komma fase, sent intercalation). (D) polaritet konvertering: basolateral forskydning af apikale ERM-1::GFP og apikale ophobning af basolateral ICB4, afsløret ved dobbelt mærkning. F-actin (mærket af phalloidin-TRITC) skitserer dyr, der ved farvning langsgående muskel bundter (dyr er triple mærket). (E) Basolateral forskydning af ERM-1::GFP i sent 3-fold embryo. Den apikale IFB-2 antistof (blå/Cyanine5) angiver intakt lumen og peri-lumenal mellemliggende filamenter. (F) ektopisk lumen mærket af anti-IFB-2 (blå/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP negative vacuoles i tarm cytoplasma. (H) ERM-1::GFP positive vacuoles i tarm cytoplasma. (I, J) Fravær af lumen i embryoner og larver, henholdsvis. (K) bred gut. (L) cystisk og højtravende gut. (A, D, H, I, J, K, L) er Konfokal fremskrivninger. (B, C, E, F) er Konfokal sektioner. Lysstyrke var steget i G at fremhæve cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis-negative vacuoles. Skalere barer: 10 µm (samme for alle embryoner og larver, henholdsvis). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Tarm polaritet konvertering og reversion: et eksempel for kvantificering af polariseret membran og lumen Biogenese fejl. (A, B, C) Lad-767og aps-1RNAi begge forårsage ERM-1::GFP basolateral deplacement (BL) og ektopisk lumen dannelse (EL), men på forskellige udviklingsstadier. (A) kvantificering af dissekere mikroskop: optælling af embryoner (venstre) og larver (tilhøjre) med polaritet fænotyper 2 dage efter såning orme på RNAi plader. Bemærk: alle mock og let-767(RNAi) dyr har udklækket på dette tidspunkt (der er således ingen embryoner, som havde dog alle vildtype polaritet; brudt linje kolonner). ApS-1 RNAi inducerer polaritet defekter allerede i embryoner, mens Lad-767RNAi inducerer dem i larver. Den højere procentdel af ektopiske lumen (vs basolateral forskydning) i aps-1RNAi embryoner versus larver er på grund af arrestationen af embryoner med ektopisk lumen. (B) kvantificering af Konfokal mikroskopi: optælling af ektopiske lumen pr. dyr fra starten af ektopiske lumen udvikling i larver. Lad-767 RNAi inducerer mere ektopisk lumen i larver end aps-1RNAi (aps-1RNAi larver er "escapers", der har ikke arresTed som embryoner). (C) Konfokal billeder til wild-type larver og larverne med ERM-1::GFP basolateral deplacement (BL) og ektopisk lumen (EL); skalalinjen: 5µm. (D, E) polaritet reversion i Lad-767RNAi dyr (optælling af dyr med og uden polaritet defekt [BL/EL] af dissekere mikroskop). 20 let-767(RNAi) dyr med mild ektopisk lumen fænotyper blev overført fra et RNAi plade til en OP50 plade på dag 4 og evalueres efter 40 timer. (D) mere end 50% larver har vendt til vildtype polaritet (ERM-1 på den apikale membran). (E) 20% af dyr vokser op ud over L1 larver stage (let-767(RNAi) resultater i L1 anholdelsen). Alle data er vist som middel +/-SEM, n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Eksempler på markører for C. elegans larve og voksen tarm membran system1.
Protein navn	Subcellulært lokalisering	Protein struktur og funktion	Kommercielt tilgængelige C. elegans specifikke antistoffer (DSHB2)	Eksempler på stammer tilgængelige på CGC
OPT-2/PEPT-1	apikale transmembrane protein	oligopeptide transporter		KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412):: Normal god landbrugspraksis) + pha-1(+)])
AQP-4	apikale transmembrane protein	vand kanal
ERM-1	apikale brushborder	membran-cytoskeleton linker	ERM1
ACT-5	apikale brushborder	cytoplasmatisk actin	(3)
IFB-2	apikale brushborder	mellemliggende glødetrådens komponent	MH33
EPS-8	apikale brushborder	Human-epidermal-Growth-Factor-receptor-kinase-substrate-8 ortholog
PAR-6	apikale membran	apikale polaritet kompleks komponent
SLCF-1	basolateral transmembrane protein	monocarboxylate transporter
AQP-1	basolateral transmembrane protein	vand kanal
LAD-413	basolateral membran	Kradse homolog, adapter og polaritet determinant	LET413
HMP-1	apikale junction (CCC4)	Α-catenin, cadherin-catenin kompleks komponent		FT1609 (unc-119(ed3) III xnIs528 [hmp-1p::hmp-1:: Normal god landbrugspraksis + unc-119(+)])
HMR-1	apikale junction (CCC)	E-cadherin, cadherin-catenin kompleks komponent	HMR1
AJM-1	apikale junction (DAC5)	krydset integritet molekyle, DLG-1/AJM-1complex komponent	MH27	SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
DLG-1	apikale junction (DAC)	Diske-store homolog, MAGUK protein, DLG-1/AJM-1complex komponent	DLG1
RAB-11	endosomal blærer	menneskehandel6		RT311 (unc-119 (ed3) III, pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
RAB-5	endosomal blærer	handel		RT327 (unc-119 (ed3) III, pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
RAB-7	endosomal blærer	handel		RT476 (unc-119 (ed3) III, pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
RAB-10	endosomal blærer	handel		RT525 (unc-119 (ed3) III, pwIs206 [pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
MANS	Golgi	Α-mannosidase II		RT1315 (unc-119 (ed3) III, pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1 Eksempler er valgt fra ressourcer i Tabel3.
2 Udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank.
3 Antistoffer mod hvirveldyr actin krydsreagere.
4 CCC: cadherin-catenin kompleks; lokaliserer den apikale del af apikale krydset; svarende til adherens krydset (AJ).
5 DAC: DLG-1/AJM-1complex; lokaliserer den basale del af apikale krydset; svarende til tight junction (TJ).
6 Se ref (22) for yderligere vesikel-associerede molekyler udtrykt i tarmen.
Bemærk: ikke alle molekyler har været testet som fusion proteiner under deres egne projektledere eller af antistoffer.

Tabel 2 : Eksempler på C. elegans tarmen-specifikke initiativtagere og tidspunktet for udtryk1.
Initiativtagere	Udtrykket fase
elt-2	udtryk begynder under de 2 E celle stadium og fortsætter ind i voksenalderen
vha-6	udtryk begynder i den sene embryo og fortsætter ind i voksenalderen
ges-1	udtryk begynder ved cirka 4E celle stadium og fortsætter ind i voksenalderen
ende-1	udtryk begynder efter 1E celle stadium og falder under senere embryogenese
1 Eksempler er valgt fra ressourcer, der er anført i tabel 3.

Tabel 3: Ressourcer til at finde C. elegans tarmen-specifikke molekyler, mærkning reagenser/stammer og antistoffer.

1. Caenorhabditis genetik Center (CGC)42 til rådighed reagenser og stammer

2. Wormbase43 oplysninger om tarmen-specifikke molekyler, stammer og antistoffer

3. Oplys

tion om tarmen-specifikke molekyler^20,44 4. Transgeneome hjemmeside⁴⁵ for Translationel normal god landbrugspraksis fusion konstruktioner 5. C. elegans udtryk mønster⁴⁶ for transcriptional normal god landbrugspraksis fusion konstruktioner 6. de nationale BioResource projekt (NBRP)::C.elegans⁴⁷ oplysninger på tarmen-specifikke initiativtagere 7. udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank (DSHB)⁴⁸ for C. elegans antistoffer 8. for sekundære antistoffer og farvestoffer Se reference^27,28

Discussion

Denne protokol beskriver hvordan man kombinerer standard tab af funktion genetiske/RNAi og imaging (mærkning og mikroskopiske) tilgange for at drage fordel af den intestinale epitel, C. elegans som en model for den visuelle og molekylær dissektion af in vivo polariseret membran og lumen Biogenese.

Mærkning

Denne protokol fokuserer på antistoffarvning. In situ mærkning af antistoffer er en meget specifik alternativ tilgang til mærkning af fluorescerende fusion proteiner (beskrevet i den ledsagende papir på ekskretionsorganerne canal membran Biogenese)². Selvom antistoffarvning ikke tillader live imaging, kan det give bekræftelse for lokalisering af et protein af interesse (hverken mærkning metode er uden mislykkes). Desuden kan spørgsmål vedrørende morfogenese og/eller subcellulært lokalisering af en protein ofte vurderes i faste dyr. Immunfarvning er nyttig for dobbelt og flere mærkning og den kan kombineres med mærkning af fluorescerende fusion proteiner, hvis disse kan bevares gennem de nødvendige fiksering og permeabilization procedurer. Den her skitserede protokollen tillader typisk denne (figur 2). In situ mærkning af faste dyr af antistoffer eller kemiske pletter kan også give fordele for superresolution mikroskopiske teknikker såsom STORM (stokastiske optisk genopbygning mikroskopi). Immunfluorescens registrerer den endogene antigen, og kan tilpasses, for eksempel, for at skelne mellem specifikke posttranslationelle protein ændringer. Det kan give hurtige resultater, hvis antistoffer er tilgængelige, når i situ farvning teknikker - ikke så ligetil i C. elegans prøver som i cellekultur - er blevet etableret.

Generation af et nyt antistof (ikke beskrevet her) er dog tidskrævende. Desværre, udvælgelse af kommercielt tilgængelige C. elegans primære antistoffer er stadig forholdsvis lille, og ikke alle er i stand til påvisning af antigen i situ (Se tabel 1 for eksempler på antistoffer viste at opdage intestinal antigener i situog tabel 3 for yderligere ressourcer). De fleste antistoffer dannet mod hvirveldyr antigener vil ikke krydsreagere med deres C. elegans homologs. Udvælgelse af sekundære antistoffer skal der tages hensyn til arten af det første antistof (diskuteres i generelle immunofluorescens protokoller^27,28). Store valg er kommercielt tilgængelige med løbende forbedre fluorescerende farvestoffer (fx Alexa-Fluor farvestoffer). For optimeret farvning, farvestoffer kan være udvalgt for deres evne til at matche mikroskop bruges til billedbehandling, fx laser af Konfokal mikroskop, eller hvis super opløsning mikroskopi er også planlagt, for deres evne til at "blink"³⁷. Direkte mærket primære antistoffer eller kemiske pletter (f.eks. fluorescently mærket phalloidin) er også tilgængelig og er især nyttige for dobbelt farvning.

Har vanskeligt ved i situ antistof farvning i C. elegans er uigennemtrængelighed af Fosters æg shell og larver/voksen neglebånd at begge kræver kemiske og/eller mekanisk afbrydelse hen til indrømme adgang af antistof til væv. Selv om komplekse flydende antistof farvningsprotokoller er blevet udviklet for at overvinde dette problem^27,28, omfatter de fleste collagenase for permeabilization, som har tendens til at beskadige målvæv. Derimod er fryse-knæk metode beskrevet her en enkel måde at åbne orm neglebånd eller æggeskaller. Det er udført direkte på glasset slide hvor enhederne er indsamlet (og hvor resten af farvning udføres også), og virker specielt godt for æg og larver at holde bedst på glas dias (dvs. faser overvejende undersøgt i tubulogenesis undersøgelser). Det også interferere ikke med bevarelse af fluorophore-mærket fusion proteiner. Teknikken kræver nogle håndelag, som det korrekte tryk på coverslip (før svippede) og undgåelse af shear pres er afgørende for at bevare modellen (som er skånsom håndtering og pipettering under hele farvnings-proceduren).

Fiksering betingelser muligvis empirisk bestemmes og justeres til den struktur /-antigen, der skal farves (behandles i²⁷). Mildere (fx formaldehyd-baseret) fiksering teknikker kan bedre bevare antigenicity, selv om det skal være afbalanceret med behovet for at opretholde væv morfologi, kritisk analyse af morfogenese. Mildere fiksering betingelser også bidrage til at bevare fluorescerende fusion proteiner i dobbelt mærkning eksperimenter. På samme måde, mængden af blokering agent (f.eks. mælk eller bovin serum albumin/BSA) og vaskemiddel i Vaskeopløsningen kræver empiriske justering at afbalancere baggrund med specifik farvning. Oplysninger om generelle aspekter af immunofluorescens teknikker, f.eks. diskussion af forskellige farvning teknikker, design af passende kontrol og tips til at optimere disse procedurer for orm tarmene (fx minimere tarm autofluorescence) kan findes i almindelighed og C. elegans specifikke immunofluorescens protokoller, som der refereres til i hele.

Interferens med genfunktioner og evaluering af tubulogenesis fænotyper

Denne protokol fremhæver særlige RNAi tilgange, der er nyttige, når de evaluerer gener med tidlige, væsentlige og allestedsnærværende funktioner, hvis delvise (snarere end komplet) tab er mest informative, som er tilfældet for de fleste tubulogenesis gener (vores genome-wide skærmen på ERM-1::GFP-mærket tarmene foreslog at indblanding med sådanne gener forårsager > 90% af alle informative tubulogenesis fænotyper i denne særlige indstilling¹²). De mange fordele, der C. elegans tilbyder for genetiske manipulationer (f.eks. dens kort generationstid) og de forskellige tilgange til at forurolige genfunktion af fremad (begyndende med funktion/fænotype) og omvendt (begyndende med den gen) genetiske metoder er beskrevet i generelt C. elegans litteratur^31,38. Tilgængeligheden af kommercielt tilgængelige genome-wide RNAi fodring biblioteker også gør det muligt at bruge denne omvendte genetiske teknik som et fremadrettet genetisk screeningsværktøj (Se Tabel af materialer for ressourcer). De specifikke fordele af RNAi til analyse af tubulogenesis omfatter dens evne: til at generere en række fænotyper svarende til en mutant allel serie (dette normalt arbejder godt for dosisafhængig morfogenese gener); at fjerne maternel RNA'er (typisk involveret i tidlige morfogenese/tubulogenesis); etape-specielt blande sig (nyttig for at vurdere virkningerne på polariseret membran Biogenese under postmitotic larve vækst).

Detaljer om generelle aspekter af RNAi procedurer er drøftet i refs (^26,s = "xref" > 31). Nøglen til analyse af dødbringende tubulogenesis fænotyper er evnen til at modulere RNAi betingelser at øge spektrum af fænotyper. Informative tubulogenesis fænotyper kan normalt blive genereret i wild-type baggrund uden behov for tarmen-specifikke RNAi stammer³⁹. Men disse stammer er tilgængelig, hvis dette mislykkes og kan også bruges til at skelne celle-autonome fra ikke-selvstændige effekter. Forskellige tilgange til modulerende styrken af RNAi er blevet rapporteret, f.eks. titrering af IPTG koncentrationer til induktion af dsRNA, en tilgang, der kan producere de mest reproducerbare resultater³⁰. Kvantitativt nøjagtige titrering kan dog ikke være nødvendigt når med det formål at generere et spektrum af forskellige fænotyper. Samlet set succes af denne analyse er ikke så meget afhængig af maksimering RNAi-effekt, som det er på fastsættelse af RNAi betingelser, der genererer en informativ spektrum af fænotyper (der kan ofte være resultatet af suboptimal (fx mildere) RNAi betingelser).

For den visuelle vurdering af tubulogenesis fænotyper induceret af RNAi er det vigtigt at fastslå den optimale vindue for fænotypisk evaluering. Det er bedst at begynde at evaluere plader tidligt (f.eks. to dage efter plukning af dyrene til deres RNAi plader under standardbetingelser RNAi) og følge dem længe nok for eventuelle forsinkede virkninger. En udviklingsmæssig tidsforløb af en forværring polaritet defekt, for eksempel, bør omfatte 3-7 dage i typisk anholdt larver. Betingelser for analyse af polariseret membran Biogenese i postmitotic ikke dividere celler af larve tarmen kan blive yderligere forbedret, når du bruger mutanter eller RNAi dyr med bremset væksten (som, for eksempel let-767(RNAi) eller mutant dyr ¹², figur 5). Enhver tid naturligvis har at blive afbrudt, hvis F2 dyr vises (kan fjerne L4s i eksperimenter hvor de fleste, men ikke alle dyr arrestere som larver). Hvert eksperiment kræver en samtidig vurdering af passende positive og negative kontroller (f.eks. bakteriel RNAi kloner at fremkalde en defineret tubulogenesis fænotype og tømme vektor eller røræg RNAi kloner, henholdsvis). Et andet krav for evaluering er en tilstrækkelig yngel størrelse (mindst 50). Hvis ikke er opfyldt, kan være forsøgt andre (fx betinget) RNAi betingelser. Endelig nogle særligt interessante tubulogenesis fænotyper forekommer på lave penetrans, således et tilstrækkeligt antal dyr skal evalueres.

Mikroskopi

Lav til moderat forstørrelse dissekere fluorescerende mikroskopi og høj forstørrelse Konfokal mikroskopi, de to standard billeddiagnostiske procedurer beskrevet her, er normalt tilstrækkelig til at karakterisere de grundlæggende aspekter af en tube eller lumen fænotype i den C.elegans tarmen og kan også bruges til visuelt skærmen større sæt af dyr i fremad skærme. Dissekere Fluorescens mikroskopi tillader: i vivo billeddannelse af dyrene på deres plader (levende dyr, forbigående immobiliserede af anæstetika, kan dog også inddrives fra mounts efter Konfokal eller DIC imaging); screening store sæt af dyr; sporing af udviklingsmæssige begivenheder (f.eks. fordrivelse og udskiftning af en polariseret markør under membran udvidelsen); sporing af specifikke udtryk mønstre (nogle mønstre og asymmetrier bedre udmærker sig ved lavere forstørrelse); at vælge og picking fluorescerende orme egnet til videre analyse (f.eks. Konfokal mikroskopi) eller vedligeholdelse af extrachromosomal transgener. Visualisering ved høj forstørrelse af konfokalmikroskopi tillader for at karakterisere fænotype på enkelt celle og subcellulært niveau. Denne protokol beskriver imaging med en laser scanning Konfokal mikroskop, der tilbyder de bedste confocality over alternativer såsom en roterende disk Konfokal mikroskop. En roterende disk Konfokal mikroskop er dog mikroskop af valg for dynamisk og time-lapse undersøgelser da det inducerer mindre fototoksicitet (Se refs (^34,35) for yderligere diskussion af lav og høj forstørrelse mikroskopi i C. elegans). Roman samt konventionelle mikroskopiske teknikker tilbyder ekstra fordele og tillade imaging på højere opløsning i nanoskala rækkevidde (f.eks. transmissions elektron og super-resolution mikroskopi, diskuteres i^{37, 40}).

Når imaging C. elegans tarmene under en Konfokal mikroskop, er montering og immobilisering kritisk. Blandt forskellige kemikalier til immobilisering, natriumazid - selv om giftige - virker mest pålideligt hvis scanning udføres straks. Levamisol, producerer selv ikke giftige, hypercontraction, der nogle gange forstyrrer evaluering af morfogenese fænotyper. Visse bedøvelsesmidler kan interferere med membran-associerede fluorescerende proteiner og kan producere artefakter, der kan ligne polaritet defekter. C. elegans er en tyk modellen og dermed 3D analyse (skæring) er afgørende for at drage fordel af den specifikke styrke af rørformede intestinale epitel, der giver fremragende visualisering af apikale vejkryds og den laterale membran (ikke nemt tilgængelige i flade epitheler). Konfokal indstillinger skal reguleres for hvert dias og mål at få god kvalitetsbilleder, herunder parametre som bracketing, gennemsnit, laser power, gevinst, pinhole og lysstyrke. Et særligt problem for intestinal imaging er dette organ indhold af grøn/gul autofluorescent granulat (lysosomet relateret organeller (LROs)), kan interferere med fortolkning af resultaterne, navnlig ved vurderingen af forskydning af Normal god landbrugspraksis-mærket endo - og plasma-membran tilhørende komponenter. Dette problem er velkendt i feltet og kan tackles af forskellige tilgange (afhængigt af mikroskop), herunder DAPI udstødelse, spektrale fingeraftryk og empiriske scanner indstillinger^13,41.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Tween	Fisher Scientific	50-213-612
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Powdered milk	Sigma	MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse)			Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse)			Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit)			Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit)			Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit)	ABCam	AB175471	Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse)	Life technologies	A10524	Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit)	Invitrogen	T2769	Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse)	Sigma	F9006	Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin			Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	335148
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
C. elegans related			see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates			see reference29 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
NaCl	Sigma	S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
Ampicillin	Sigma	A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912
M9 Medium			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
KH2PO4	Sigma	P0662
Na2HPO4	Sigma	S7907
MgSO4	Sigma	M2773
NGM plates			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
RNAi plates			see reference30 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
IPTG	US Biological	I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP2648
NaOH	Fisher Scientific	SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)	Source BioScience
Imaging related
Sodium azide	Fisher Scientific	BP9221-500
Equipment
dissecting microscope	Nikon	SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions)	Olympus	SZX12
Laser-scanning confocal microscope	Leica Microsystem	TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope	Nikon	C2