Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

C. elegans tarmen som en modell för intercellulära Lumen morfogenes och In Vivo polariserade membran biogenes på Single-cell nivå: märkning av antikropp färgning, RNAi förlust-av-funktion analys och Imaging

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56100
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

De transparenta C. elegans tarmen kan fungera som en ”in-vivo vävnad kammare” för att studera apicobasal membran och lumen biogenes på single-cell och subcellulär nivå under flercelliga tubulogenesis. Det här protokollet beskriver hur man kombinerar standard märkning, genetiska förlust-av-funktion/RNAi och mikroskopiska metoder att dissekera dessa processer på molekylär nivå.

Abstract

Flercelliga rör, grundläggande enheter av alla inre organ, består av polariserade epitelial eller endothelial celler, med apikala membran foder lumen och basolateral membranen att kontakta varandra och/eller extracellulärmatrix. Hur denna särskiljande membran asymmetri är under och bibehållas orgel morfogenes är fortfarande en olöst fråga cellbiologi. Det här protokollet beskriver C. elegans tarmen som en modell för analys av polariserade membran biogenes under tube morfogenes, med betoning på apikala membran och lumen biogenes. C. elegans tjugo-cell singel-skiktad intestinala epitelet är ordnad in i en enkel bilateralt symmetriska tube, möjliggör en analys på en enskild cell-nivå. Membranet polarisering sker samtidigt med polariserade celldelning och migration under tidig embryogenes, men de novo polariserade membran biogenes fortsätter hela larval tillväxt, när celler inte längre föröka sig och flytta. Den senare inställningen gör att man kan separera subcellulär förändringar som samtidigt förmedlar dessa olika polariserande processer, svårt att urskilja i de flesta polaritet modeller. Apikala-, basolateral membran-, Junktional-, cytoskeletal- och endomembrane komponenter kan vara märkt och spåras under hela utvecklingen av GFP fusionsproteinerna eller bedömt i situ antikropp färgning. Tillsammans med organismens genetiska mångsidighet ger C. elegans tarmen således en unik i vivo modell för visuellt, utvecklande, och molekylär genetisk analys av polariserade membran och tube biogenes. Specifika metoder (standard) beskrivs här inkluderar hur: etikett intestinal subcellulära komponenter av antikropp färgning; analysera gener involverade i polariserade membran biogenes av förlust-av-funktion studier anpassas till vanligtvis väsentliga tubulogenesis gener; bedöma polaritet defekter under olika utvecklingsstadier; tolka fenotyper av epifluorescence, differentiell störningar kontrast (DIC) och konfokalmikroskopi; kvantifiera synfel. Detta protokoll kan anpassas att analysera någon av de ofta mycket molekylerna som är inblandade i epitelial polaritet, membran biogenes, röret och lumen morfogenes.

Introduction

Generering av cellulär och subcellulär asymmetrier, såsom bildandet av polariserade membran domäner, är avgörande för morfogenes och funktion av celler, vävnader och organ1. Studier på polariserade membran biogenes i epitel förbli en teknisk utmaning, eftersom riktade förändringar i fördelningen av subcellulära komponenter är beroende av flera på varandra följande och sammanfallande extracellulära och intracellulära signaler som är svårt att separera i de flesta modeller och starkt beroende av modell systemet. Modellen presenteras här - den enda lager Caenorhabditis elegans tarmen - är en vävnad av utsökta enkelhet. Tillsammans med encelliga C. elegans utsöndringsorganen canal (Se medföljande papper på polariserade membran biogenes i C. elegans utsöndringsorganen kanal)2, det ger flera unika fördelar för identifiering och karakterisering av molekyler som krävs för polariserade membran biogenes. Bevarande av molekylär polaritet ledtrådar från jäst till mannen göra detta enkla ryggradslösa organ en utmärkt ”i vivo vävnad kammare” att hantera frågor på epitelial polaritet som är av direkt betydelse för det mänskliga systemet, som fortfarande är alltför komplex att tillåta visuell dissektion av dessa händelser på enda cell nivå i vivo.

Även om flera bevarade polaritet ledtrådar från (1) extracelluar matris, (2) plasmamembranet och dess korsningar och (3) intracellulära vesikulär människohandel har varit identifierade3, de underliggande principerna för deras integration i processen för polariserade epitelial membran och vävnad biogenes är dåligt förstådd4. De klassiska encelliga i vivo modellerna (e.g.S. cerevisiae och C. elegans zygoten) har varit avgörande för att fastställa principerna för polariserade celldelning och främre-bakre polaritet och har identifierat kritiska membran-associerade polaritet bestämningsfaktorer (den små GTPases/CDC-42, partitionering-defekta parsna)5,6, men de är beroende av unika symmetri bryta cues (knopp ärr, spermier posten) och saknar junction-säkrade apicobasal membran domäner och, förmodligen, den motsvarande intracellulära apicobasal sortering maskiner. Vår nuvarande kunskap om organisationen av polariserade människohandel epitel, dock främst förlitar sig på däggdjur 2D monokulturer7, som saknar fysiologiska extracellulära och utvecklingsmässiga ledtrådar som kan ändra positioner av membran domäner och riktningar av människohandel banor (en switch från 2D till 3D i vitro kultur system ensam räcker för att invertera membran polaritet i MDCK (Madin-Darby canine njure) celler)8. In vivo utvecklande studier på epitelial polaritet i ryggradslösa modellorganismer genomfördes initialt med platt epitel, exempelvis i Drosophila melanogaster epidermis, där de identifierade kritiska bidrag korsningen dynamics för polariserade cellmigration och cell ark rörelse9och endocytic människohandel för polaritet underhåll10. 3D i in vitro- och in-vivo analys av lumen morfogenes i tubulär epitel i MDCK celler och i C. elegans tarmen, respektive har nyligen identifierat kravet av intracellulära människohandel för de Novo (apical) domän och lumen biogenes och placering11,12,13. Tjockleken av tubulär (kontra platt) epitelceller är en fördel för 3D analys av subcellulär asymmetrier eftersom det tillåter en överlägsen visuell skillnad av den apikala-lumenal membranen, apico-laterala korsningar, laterala membranet, och den placerar av intracellulära organeller. Till dessa visuella fördelar, C. elegans modellen lägger den i vivo inställning, utvecklingsmässiga axel, öppenhet, enkelhet kropp plan, invarianta och definierade cellen härstamning, analytiska (genetisk) och ytterligare fördelar som beskrivs nedan.

C. elegans själv är en spolmask tubulär struktur vars öppenhet och enkla arkitektur göra dess jämväl tubulär inre organ direkt tillgänglig för visuell analys av röret och lumen morfogenes. Tjugo cellerna av dess tarmen (ibland 21 eller 22-celler)14 härleds från en enda progenitor cell (E) och utvecklas från ett epitel med dubbla lager av ett interkalation steg till ett bilateralt symmetriska rör av nio INT ringar (fyra celler i den första ring; Figur 1 Schematisk)14,15,16. Tarmens härstamning och vävnad analys, initialt bestäms av Nomarski optik via nukleära identiteter17och därefter av fluorescensmikroskopi via märkt membran, har gett viktiga insikter om dess morfogenes, i särskilt de cell-autonoma och cell-icke-självständiga krav för dess riktnings celldelningar och rörelser (t.ex., interkalation, höger-vänster asymmetrier, främre och bakre tube rotation)14,18 . Tidiga endodermal cell specifikation och gen rättsliga nätverket styr utvecklingen av denna klonala modell orgel är väl karakteriserade19,20. Fokus här, är dock på en analys av polariserade membran och lumen biogenes i inre tubulära cellerna, och de intracellulära asymmetrierna endomembranes, cytoskeletal strukturer och organeller som åtföljer denna process. Analys underlättas av enkelheten i denna tube, där alla apikala membran (på ultrastrukturella nivå kännetecknas av Mikrovilli) möta lumen och alla basala membran möta yttre röret ytan, med laterala membran att kontakta varandra, skild från det apikala membranet genom korsningar (figur 1 Schematisk; se referenser (16,21) för i C. elegans-specifik organisation av tight och adherens junction komponenter). Apikala membran biogenes är således sammanfaller med lumen morfogenes. Dessutom storleken på vuxen intestinala celler - de största cellerna i detta lilla djur (med undantag av utsöndringar cellen) - ungefärliga storleken på en däggdjursceller, tillåter i vivo visuell spårning av subcellulär element, t.ex. vesikler banor, som oftast är försök in vitro- i en kultur maträtt.

I syfte att denna cellulär och subcellulär analys är lämplig märkning avgörande. Intestinal endo - eller -plasmamembranet domäner, korsningar, cytoskeletalstrukturer, kärnor och andra subcellulär organeller kan visualiseras genom märkning deras specifika molekylära komponenter. Många sådana komponenter har karaktäriserats och fortsätta att bli upptäckta (tabell 1 ger några exempel och refererar till resurser). Exempelvis varit olika molekyler skilja de tubulära eller vesikulär fack av intestinal endomembrane systemet, från ER till Golgi via post-Golgi blåsor till plasmamembranet, identifierade22. Den specifika proteiner (och lipider samt sockerarter) kan antingen vara märkt direkt eller indirekt via bindande proteiner. Detta protokoll fokuserar på i situ antikropp färgning av fasta prover, en av två standard märkning tekniker (se det medföljande papperet på utsöndringsorganen canal tubulogenesis för en beskrivning av andra teknik2 - in-vivo märkning via fluorescerande protein fusions - som är direkt tillämplig på tarmen; Tabell 2 ger exempel på tarmen-specifika initiativtagare som kan användas för att köra uttrycket av sådan fusionsproteiner till tarmen). Dubbel- eller flera märkning med antingen tillvägagångssätt eller med en kombination av båda plus ytterligare kemisk färgning, tillåter större djupgående visuella upplösning och undersökning av rumsliga och tidsmässiga förändringar i samtidig lokalisering och rekrytering av specifika molekyler eller subcellulära komponenter (figur 2). Fixering och färgning procedurerna som beskrivs i detta protokoll stöd bevarandet av grönt fluorescerande protein (GFP) märkning under immunfärgning förfaranden. För imaging, huvudpunkter av detektion och karakterisering av tubulogenesis fenotyper via mikroskopiska standardförfaranden (fluorescens dissekera och confocal microscopy) är beskrivs ()figur 3, 4). Dessa kan utökas till högre upplösning imaging metoder, för instans superresolution mikroskopi och överföring elektronmikroskopi (inte beskrivs här).

En styrka av detta system är förmågan att analysera polaritet i enskilda celler i olika utvecklingsstadier, från embryogenes genom vuxenlivet. Exempelvis kan apikala membran domän och lumen biogenes spåras i hela utveckling på enskild cell nivå via märkning med ERM-1, en mycket membran-aktin länkare av Ezrin-Radixin-Moesin familj23,24 . ERM-1 visualiserar apikala membran biogenes (1) under embryonala tube morfogenes, när det uppstår samtidigt med polariserade celldelning och migration (celler flytta apikalt runt lumen under interkalation)15; (2) under sena embryonala och larver tube förlängning som intäkterna i avsaknad av celldelning eller migration. och (3) i vuxen tarmen, där polariserade membran domäner bibehålls (figur 1). I det expanderande efter mitotiska larval epitelet, de novo polariserade membran biogenes kan således skiljas från polariserade vävnad morfogenes, vilket inte är möjligt i de flesta i vivo och in vitro- epitelial polaritet modeller, inklusive de med encelliga upplösning (t.ex. 3D MDCK cysta modell8). Med märkning för andra komponenter, den här inställningen ger möjlighet (särskilt på den L1 larvstadium när celler har en högre cytoplasman/nucleus ratio) att skilja de intracellulära ändringar som är specifika för polariserade membran biogenes ( t.ex. omorienteringen av människohandel banor) från dem som samtidigt krävs för polariserade celldelning och migration.

Genetiska mångsidigheten hos C. elegans är välkända25och gör det en kraftfull modellsystem för molekylär analys av biologiska frågor. En studie på morfogenes, exempelvis kan börja med en vildtyp stam, en transgena stam där strukturen av intresse (t.ex. ett membran) är märkt med en fluorescerande markör, eller med en förlust - eller gain-of-function mutation med en defekt i detta struktur. En typisk omvänd genetisk studie kan generera en mutant där genen intresseanmälan raderas i den könsceller (t.ex. genom en riktad borttagning), ändrat genom mutagenes (vanligtvis producerar punktmutationer med påföljande förlust, minskning eller vinst i funktion av genen), eller där dess avskrift minskas med RNAi. Lättheten av RNAi genom utfodring i C. elegans26 lämpar sig också till design av riktade skärmar som undersöker en större grupp av gener av intresse. En genetisk modellorganism utan tvekan största styrka är förmågan att genomföra i vivo framåt skärmar (e.g. mutagenes, systematisk eller genome-wide RNAi-skärmar) som tillåter en förutsättningslös utredning molekylär orsaka för en fenotyp av intresse. Exempelvis en opartisk visual C. elegans RNAi tubulogenesis skärmen, börjar med en transgena djur med ERM-1-märkt apikala membran, upptäckte en spännande reversibel intestinal polaritet konvertering och ektopisk lumen fenotyp, används här som ett exempel för denna typ av analys. Denna skärm identifierats utarmning av glykosfingolipider (GSLs; obligata membran lipider, identifieras via sin GLS-biosyntetiska enzymer) och delar av den vesikler coat clathrin och dess AP-1 adapter som de specifika molekylära defekter som orsakar denna polaritet konvertering fenotyp, därmed karaktärisera dessa människohandel molekyler som i vivo ledtrådar för apikala membran polaritet och lumen positionering12,13. När du startar med en specifik genetisk mutation/morfogenes fenotyp, kan sådana skärmar (eller enda genetiska/RNAi interaktion experiment) även undersöka funktionella interaktioner mellan två eller flera gener av intresse (Se medföljande papper på den utsöndringar kanalen för ett exempel på sådan analys)2. Detta protokoll fokuserar på RNAi som, utöver sin förmåga att direkt identifiera den gen vars förlust orsakar fenotypen i framåt skärmar, ger särskilda fördelar för analys av morfogenes. Eftersom genprodukter styra morfogenes ofta arbeta på ett dosberoende sätt, är RNAi oftast framgångsrik generera ett spektrum av fenotyper. Förmågan att generera informativ partiella-förlust-av-funktion fenotyper hjälper även till att ta itu med problemet att majoriteten av viktiga tubulogenesis gener är avgörande och att deras förluster orsaka sterilitet och tidig embryonal dödlighet. Detta protokoll villkorlig RNAi strategier för att övervinna denna svårighet och föreslår olika sätt att optimera generering av ett bredare spektrum av fenotyper, såsom en alleliska serie producerad av mutagenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Märkning C. elegans tarmen

Obs: se den medföljande papperet av författarna på analys av utsöndringar canal tubulogenesis 2 för byggandet av vävnad specifik fluorescerande markör plasmider och generering av transgena djur, inklusive diskussioner på transkriptionell och translationell fusionsproteiner (det senare krävs för subcellulär lokalisering av en molekyl av intresse). Dessa förfaranden kan anpassas med hjälp av specifika initiativtagare för att köra molekyl av intresse till tarmen. Se tabell 1 för exempel på molekyler som visat sig användbar för att visualisera C. elegans intestinal endo - och plasma membran och deras korsningar, tabell 2 exempel på initiativtagare för körning uttrycket till tarmen, och tabell 3 för resurser för mer omfattande samlingar av intestinal markörer och främjare.

  1. Antikropp färgning av C. elegans tarmen 27 , 28
    1. fixering
      1. ta en ren glasskiva och använda poly-L-lysin till Generera en tunn film för maskar att sticka på. Plats 30 µL 0,1-0,2% poly-L-lysin på bilden och placera en andra bild på den poly-L-lysin-släpp för att göra en " smörgås ". Sedan gnugga bilderna försiktigt några gånger till våt hela ytorna av båda och låt dem lufttorka för 30 min. etikett den frostade sidan bilder med blyerts.
        Obs: 0,2% poly-L-lysin alikvoter av 200 µL gjordes av upplösning av pulvret i dH 2 O; Detta kan förvaras vid-20 ° C. användningen hög molekylvikt poly-L-lysin för bättre klibba av maskar. Koncentrationen av poly-L-lysin är också kritisk. Alltför låga koncentrationer kommer inte att tillåta maskar att sticka men alltför höga koncentrationer kan generera fluorescens bakgrund signal. En för tjock film kan lossa i sin helhet.
      2. Placera en platt metall block stadigt på botten av en behållare (t.ex. en polystyren behållare) fylld med flytande kväve.
        Obs: Man kan använda torris i stället, men flytande kväve håller ett metall block stabilare längst behållare och frossa väl.
      3. Samla maskar antingen genom tvätta dem av sina tallrikar med M9 29 eller plocka olika skede maskar (antingen ägg, L1, L2, L3 och L4 larvstadium maskar) på varje bild. Typiskt, plocka ~ 100 larver och embryon eller ~ 20 vuxna till varje bild. Plats 10 µL tvättas bort maskar på mitten av bilden eller plocka ägg/maskar i 10 µL M9 eller 10 µL 1 x PBS 27 (fosfatbuffrad saltlösning).
        1. Använd en pipett att sprida ut ett stort antal maskar att undvika klumpar.
          Obs: Blandade populationer av tvättas bort maskar, på grund av trängsel och olika tjocklek på skeden, stick inte väl och är mindre effektivt frysa-knäckt (se nedan), därför plockning scenen-specifika maskar (eller synkroniserade populationer) ger överlägsna resultat. Larverna håller bättre än vuxna och fler djur kan placeras per bild.
        2. Innan plockning maskar på diabilder, överföra dem till en nematod tillväxt Medium (NGM) plattan 29 utan OP50 bakterier. Överskjutande bakterier anhängare till maskar kan också störa sticker. Ta hand att maskar inte torka.
      4. Försiktigt plats (drop) en 22 mm × 22 mm täckglas cross-vägar ovanpå den insamlade maskar så att kanterna hänga över på minst en sida av bilden. Tryck rakt ner försiktigt men bestämt med ett eller två fingrar på täckglaset. Undvika klippning som kommer att skada vävnad integritet.
      5. Omedelbart och försiktigt överföra bilden till metall block i flytande kväve och låt det sitta i ca 5 min att frysa. Sedan " svep bort " på täckglaset i en swift flytta med hjälp av överhängande kanten.
        Obs: Detta steg måste göras beslutsamt och medan bilden fryses för att uppnå " sprickbildning " av nagelband. Varning: Följ riktlinjerna PPE (personlig skyddsutrustning) när du arbetar med flytande kväve.
      6. Fördjupa de frysa-knäckt glider in en metanol-fylld Coplin glasburk för 5 min vid-20 ° C. Sedan överföra till en aceton-fylld Coplin glasburk för en annan 5 min vid -20 ° C.
        Obs: Metanol och aceton ska förvaras i-20 ° C i minst 30 min innan användning. Efter fixering, bilder kan lagras vid -20 ° C. försiktighet: metanol och aceton är giftiga.
      7. Ta bort bilder från burk och låt dem lufttorka vid rumstemperatur (RT) före användning.
    2. Färgningen
      1. omger området fasta maskar med ett tunt lager vaselin på bilden. Rita en cirkel runt detta område på undersidan av bilden för att markera platsen.
        Obs: Det är viktigt att gelé cirkeln förblir intakt under hela förfarandet färgning för att förhindra läckage av färgning lösningar.
      2. Förbered en " våta kammare " i en plast bin med lock genom att placera våta pappershanddukar in i den. Placera bilden på ett rack i detta " våta kammare " att förhindra torkning av bilderna under färgningen.
        Obs: Bilderna bör inte vara i kontakt med vatten eller med varandra.
      3. Pipettera försiktigt cirka 50 µL 1 x PBS i gelé cirkeln, nog att täcka området. Nära den " våta avdelningen " med locket. Inkubera vid RT för 5 min.
        Obs: För att undvika att förlora maskar i detta steg, Pipettera inte PBS direkt på maskar. Försiktigt placera pipettspetsen vid kanten av cirkeln och låt vätska att smidigt sprida över maskar.
      4. Luta bilden och aspirera långsamt PBS med en pipett. Placera bilden tillbaka platt på racket och tillsätt 50 µL (eller det erforderliga beloppet att täcka platsen) blockerar lösningen noga. Inkubera detta i den våta kammaren vid RT i 15 min. Medan du väntar, späd de primära antikropparna blockera lösning (se Tabell av material för exempel på primära antikroppar och koncentrationer).
        Obs: Nymalen Bered blockerande använder 1 x PBS (10 mL), 10% tween (50 µL) och mjölkpulver (0.2 g). Mängden tvättmedel och koncentrationen av mjölk kan variera beroende på antikroppar som används och kan behöva bestämmas empiriskt. Aspiration av vätska från bilden är ytterligare ett steg att enkelt förlora maskar. Kontrollera förloppet genom att undersöka bilden dissekera omfattas, men ta hand att bilden inte torkar ut.
      5. Luta bilden och aspirera bort blockerande lösningen, med samma försiktighetsåtgärder som beskrivs ovan. Placera bilden tillbaka platt på rack och tillsätt 50 µL utspädda primär antikropp, använder samma försiktighetsåtgärder. Nära den " våta kammare " och inkubera vid 4 ° C över natten eller i kortare perioder på RT.
        Obs: Inkubationstiden kan behöva bestämmas empiriskt för en specifik antikropp.
      6. Aspirera av primär antikropp lösning som gjort för andra lösningar. Tvätta sedan bilderna med blockerande lösning för 10 min, 3 gånger, lägga till och ta bort lösningen på samma sätt som beskrivs ovan.
      7. Lägg till sekundära (fluorescently-märkt) antikropp utspätt i blockerande lösning, inkubera vid RT i 1 h. Se Tabell för material för exempel på sekundära antikroppar och koncentrationer.
      8. Ta bort sekundära antikroppar och tvätta, som ovan, med blockering lösning 2 gånger och till klar bort den blockerande lösningen, med 1 x PBS, för 10 min varje.
      9. Aspirera bort så mycket PBS som möjligt utan att tillåta preparatet till torka ut och ta försiktigt bort gelé runt preparatet.
      10. Lägg till en droppe monteringsmedium på preparatet, och Placera ett täckglas försiktigt på toppen. Försegla kanterna på täckglaset med nagellack. Placera bilder i en mörk bild för att bevara färgning och lagra i 4 ° C.
        Obs: Hålla bilder i mörker på grund av ljuskänslighet (fluorescens kan blekna med tiden) och förhindrar luft genom att hålla dem förseglade, av samma anledning. Bilder får lagras under längre perioder vid 4 ° C eller -20 ° C.

2. Störningar med funktionen av väsentliga tubulogenesis gener i C. elegans tarmen. Exempel: RNAi.

Obs: C. elegans stammar är odlade på OP50 bakterier seedade på NGM plattor enligt standardprotokoll 29. För RNAi, C. elegans foder på HT115 RNAi bakterier på RNAi tallrikar kompletteras med 25 µg/mL carbenicillin och 2 mM IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) för induktion av bakteriell arrangören som genererar den dubbla stranded RNA (dsRNA) från introducerad C. elegans genen. Antibiotika och IPTG koncentration kan variera beroende på RNAi klon/bibliotek och önskad RNAi styrka, resp. specifika RNAi kloner kan erhållas från kommersiellt tillgängliga genome-wide RNAi utfodring bibliotek (se ( 26 , 30 , 31) för bakgrunden på utfodring RNAi i C. elegans och Tabell av material för material/reagenser och RNAi bibliotek).

  1. Standard RNAi vid utfodringen 26 , 31
    1. ta ut RNAi bibliotek plattan från-80 ° C och lägga den på torris. Ta bort förseglingstejpen och Använd sterila pipettspetsen överföra vidhäftande bakterier av klon av intresse till LB (Luria buljong) agarplattor 29 kompletteras med 100 µg/mL ampicillin och 15 µg/mL tetracyklin. Strimma ut bakterier på agarplattan. Försegla RNAi bibliotek plattan med en ny förseglingstejpen. Odla bakterier över natten vid 37 ° C.
      Obs: Dessa agarplattor kan lagras vid 4 ° C i flera veckor. Nya bakterier kan vara odlade direkt från dem för att skydda det ursprungliga RNAi biblioteket.
    2. Nästa dag Inokulera RNAi bakterier från LB agarplattan till 1 mL LB flytande medium 29 innehållande 50 µg/mL ampicillin varje och skaka för 14 (8-18) h eller över natten vid 37 ° C.
      Obs: För optimalt resultat använd färska bakterier varje gång. Se referens ( 30) för jämförelse av olika odlingsbetingelser (t.ex. tidpunkten för kultur).
    3. Nästa dag, utsäde 200 µL per klon av odlade RNAi bakterier på separata RNAi plattor. Låt plattorna torka och lämna på RT över natten för induktion av bakteriell arrangören.
    4. Överföra 4-6 L4-scenen larver på varje RNAi-plattan. Inkubera seedade RNAi plattorna vid RT eller 22 ° C i 3-5 dagar.
      Obs: Plocka L4 larver först på en NGM plattan utan bakterier ta bort anhängare OP50 som kommer att störa RNAi eller seriellt överföra dem till en ny NGM platta utan OP50 tre gånger. Kontrollera att stammar inte är förorenade, som vattenförorenande bakterier - som OP50 program mat för maskar - kommer också att störa RNAi. Justera temperaturen som behövs: e.g. utveckling accelererar med högre temperatur. stammar kan vara temperaturkänsliga.
    5. För utvecklande studier, kontrollera fenotyper av F1 avkomman från dag 2 och framåt.
      Obs: Det är viktigt att kontrollera djur ofta för att undvika att missa uppkomsten eller progression av en fenotyp (t.ex. markör förskjutning) när bedömningen av polariserade membran biogenes under utveckling. Anrikning av F2 befolkningen för stark fenotyper (t.ex. genom att plocka överordnade hermafroditer till en ny RNAi-tallrik på dag 2 för att välja för mest starkt påverkas mitten delen av deras avkomma) är sällan nödvändig, eftersom ett spektrum från mild till stark fenotyper är önskvärd.
  2. Villkorlig RNAi
    Obs: RNAi villkor kan ändras att minska allvarliga eller öka milda effekter, eller att blanda scenen-specifikt; ändringar är till hjälp för en fullständig utvärdering av fenotypiska effekterna av den ofta dödliga tubulogenesis gener.
    1. Larver RNAi - utvärdering av RNAi effekter i samma generation (mild, scenen-specifika RNAi)
      Obs: att övervinna sterilitet eller embryonal dödlighet, eller att störa geners funktion på en specifik scen post embryogenes, RNAi induceras i larver, post embryonically. Antingen placerar obehandlad ägg (2.2.1.1), dräktig vuxna (2.2.1.2) eller synkroniseras L1 (eller, om så önskas, senare skede) larver (2.2.1.3) på RNAi plåtar. utvärdera RNAi effekter i samma generation, t.ex. två dagar senare och framåt, larver och/eller vuxna.
      1. Plocka 30-50 dräktig vuxna till en droppe blekning lösning (en 1: 4 lösning 10 M NaOH och hushållens natriumhypoklorit) placeras på kanten av en RNAi-plattan. Låt torka och tillåta L1s att kläckas och flytta till bakteriell gräsmattan.
        Obs: Blekning lösning, som allmänt används för dekontaminering, kommer döda allt utom embryon i sina äggskal. Därför placera inte blekning lösningen på eller nära RNAi bakterier.
      2. Plocka utsäde ~ 20 unga dräktig vuxna på RNAi plattan och låt dem lägga ägg för 2-3 h eller tills det finns omkring 300 ägg på plattan, sedan plocka bort vuxna.
        Obs: Denna metod kan orsaka förorening av RNAi bakterier av OP50. För att minska denna risk, först överföra vuxna på NGM plåt utan bakterier ta bort OP50 anhängare till maskar. Ta hand att vuxna inte stanna länge på RNAi tallrikar att undvika RNAi effekt på embryon.
      3. Plocka eller placera L1 scenen maskar direkt på RNAi plattor (se referens ( 29)-för synkronisering av protokollen).
        Obs: Man kan använda en förkortad synkroniseringen-protokoll (t.ex. för en måttligt stor skala set-up) genom tvättning maskar från tätbefolkade plattor med M9 för flera gånger tills bara ägg kvar. Efter 2-3h kläckning L1s kan sedan samlas i M9 från dessa plåtar, rengöras genom ytterligare tvättar bort bakterier (3 x i M9) och seedade på RNAi plattor.
    2. Utspädning av RNAi bakterier med tom vektor RNAi bakterier (mild RNAi)
      Obs: nedsättning av dsRNA genom att späda ut mängden RNAi bakterier kan räcka för att framkalla mildare effekter och kan också minska embryonal dödlighet utan att avskaffa alla embryonala effekter. Utspädning av RNAi bakterier används också för dubbel RNAi experiment och att titrera villkor för genetisk interaktion experiment (t.ex. att generera milda effekter för bedömning av förbättring och starka effekter för bedömning av dämpning).
      1. Växa upp RNAi- och emPTY vektor HT115 RNAi bakterier i 1 mL LB medium med 50 µg/mL ampicillin, som gjort för RNAi standardförhållanden.
      2. Späd RNAi bakterierna med tom vektor RNAi bakterier att uppnå ett utbud av olika koncentrationer, till exempel 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. Blanda bakterierna väl genom pipettering upp och ner. Pipettera 200 µL blandat bakterier på en RNAi plattan.
      3. Plocka 4-6 L4 larver på varje RNAi-platta. Kontrollera fenotypen från dag 2 framåt.
    3. RNAi känsliga stammar (stark RNAi)
      1. använda tillgängliga RNAi-känsliga stammar, till exempel eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) eller eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (den senare supersensitive) och följ RNAi-standardförfaranden som beskrivs i 2.1 31 , 32 , 33.
        Obs: RNAi känsliga stammar (e.g. rrf-3 och eri-1) kan ha lägre barnaskara storlekar än vildtyp djur och vara sterila vid 25 ° C. De kan också ha en låg bakgrund av egna fenotyper, e.g. låg penetrant embryonal dödlighet, vilket måste beaktas vid utvärdering av specifika RNAi effekter.

3. In vivo imaging av C. elegans tarmen av fluorescens dissekera mikroskopi

  1. före visualisera djur under fluorescens ljuset, kontrollera RNAi plattor under starkt ljus på alla dissekera Mikroskop. Bedöma (och eventuellt spela in) fenotyper synlig under starkt ljus som kan påverka analysen, till exempel dödlighet, sterilitet (lägre antal avkomma), utvecklingstoxicitet (e.g. larval gripandet) och andra synliga fenotyper som kan hjälpa karakterisera funktionen av en gen som är inblandad i polariserade membran biogenes och lumen morfogenes.
    Obs: Endast Poäng plattor som har tillräcklig avkomma för utvärdering (minst 50), annars prova alternativa RNAi villkor. Kontrollera att plattorna inte är smittade för kvantitativ utvärdering eller växa OP50 (som stör RNAi).
  2. Att visualisera djur under fluorescerande ljus, ta av locket och placera RNAi plattan direkt under mikroskopet dissekera fluorescens.
    Obs: För att upptäcka subtila intestinal fenotyper måste en dissekera Mikroskop med en högre makt stereo fluorescens kvarstad som möjliggör ett tillräckligt utbud av förstoring. Det här protokollet beskriver användningen av ett scope med en 1,5 och 10 x mål och ett zoomomfång från 3,5 till 45.
  3. Först hitta djur under starkt ljus att fokusera. Nästa, undersöka djuren under fluorescerande ljus i låg förstoring (t.ex. under målet 1,5 x), med hjälp av lämpliga filter. Undersöka plattan systematiskt från övre vänstra till nedre högra att skanna hela plattan för fenotyper.
  4. Välj djur sevärdheter och ändra till 10 x-objektiv. Fokusera på tarmen och Använd zoom för att bedöma tubulogenesis/lumen morfogenes fenotyp. Se avsnitt 5 för poängsättning av fenotyper. Först, ta bilder i låg förstoring. Växla sedan till hög förstoring.
    Obs: Eftersom friska djur rör sig snabbt, arbeta snabbt, med en hand på datormusen för bild förvärv samtidigt fokusera mikroskopet med den andra handen. Bromsa djur (t.ex. av övergående placering av skyltar till 4 ° C) får inte krävas när arbetar med tubulogenesis fenotyper i mestadels grips embryon och tidigt yngel. Bilderna kan fångas av en Mikroskop-monterad CCD-kamera och bild ta till fånga mjukvaran.

4. Imaging C. elegans tarmen med högre upplösning av laserscanning konfokalmikroskopi 34 , 35

  1. montering och immobilisering
    1. användning fingertoppen till tunt Sprid en liten mängd fett eller vaselin i en cirkel på en glasskiva (~ 6-8 mm i diameter).
      Obs: Tjocklek av fett cirkel är kritiska för montering. För bästa imaging resultat, bilden en eller flera larver i taget och använda en ultrathin fett cirkel med som lite vätska som möjligt så att djuret är direkt fastnat mellan objektglas och täckglas (om gjort perfekt, djur kommer att vara orörlig utan bedövningsmedel). Montering av ägg och av äldre djur kräver en något tjockare cirkel för att undvika förstörelse av provet när du lägger till täckglas.
    2. Lägg till en droppe normalt 3,5 µL 10 mM natrium natriumazid lösning in i mitten av cirkeln och plocka maskar i det enligt mikroskopet dissekera.
      Obs: Förbereda en 1 M natrium natriumazid stamlösning av upplösning 65.01 mg NaN3 i 1 ml dH 2 O; Tillsätt 200 µL av denna 1M lösning i 20 mL M9 buffert. Plocka maskar snabbt in droppe natrium natriumazid lösning att undvika lösning att torka ut. Plocka stadier separat för optimal montering, som siktar på ca 50 embryon per bild och ca 20 larver vid prövningen av större populationer. Man kan använda M9 istället för natrium natriumazid lösning när plocka embryon. Om du använder natriumazid, djur måste avbildas inom 30 min att undvika vävnadsskada av detta miljögift.
      FÖRSIKTIGHET: Natriumazid är giftigt.
    3. Försiktigt placera ett 22 mm × 22 mm täckglas på bild. Var noga med att inte krossa maskar. Använd milt tryck och kolla under dissekera Mikroskop för att kontrollera att maskar är fasta väl mellan bild och täckglas. Märk bilden.
      Obs: Rätta mängden tryck som är avgörande för att undvika skadliga preparatet (för mycket tryck) och inte fastställa det väl (för lite tryck: djur flyta i stället för att klibba till bild). Flytande djur utesluter i princip lämpliga imaging.
  2. Imaging
    1. under mikroskopet confocal glida på plats. Sök efter maskar med 10 x mål och fokus.
      Obs: Använd ljus fokus där det är möjligt att undvika fotoblekning.
    2. Förändring till 60 x eller 100 x mål och fokus på tarmen.
      Obs: Tarmen kan enkelt identifieras under starkt ljus genom dess lumen som går genom mitten av djur, från svalget till anus nära spetsen av svansen. Var försiktig när tillämpa olja för 60 x eller 100 x olja mål. Blanda olika typer av oljor kan störa ytterligare imaging. Plats lilla droppe olja på bild när du använder ett upprätt Mikroskop eller på målet när du använder en inverterad omfattning, utan för att förorena andra mål eller delar av mikroskopet.
    3. Upprätta Kohler DIC/Nomarski belysning för syftet att användas för skanning 36. Inspektera djur under fluorescerande ljus med rätt kanal att kontrollera märkning av tarmen och/eller kontrollera fenotyp, för att välja lämplig förlaga för avbildning. Arbeta snabbt för att undvika blekning.
    4. Switch till laser scanning för att begränsa blivande bild till tarmen genom att skanna gränser på dess rygg- och ventrala sida.
      Obs: Bracketing tarmen på detta sätt är avgörande om fluorophore etiketter också strukturer utanför tarmen. Under denna pilot scan, arbeta med snabb skanning villkor till avOID fotoblekning.
    5. Stoppa skanning för att välja genomsökningsparametrar för experimentet. Ställ in 6-20 avsnitt för intestinal scanning längs z-axeln, e.g. med 0.2 µm mellanrum, beroende på förfrågan, skede av animaliska och/eller tekniska överväganden. Ställ ramen snitt per bild beroende på komplexiteten i märkning och krävs resolution bullerminskning.
      Obs: Inställningen Detaljer varierar beroende på mikroskopet och experimentera. Man kan behöva minska mängden sektioner att undvika blekning om utföra sekventiella skanning av tre olika fluorophores. Justera antalet ramar till antal sektioner (bör vara lägre än antalet sektioner att undvika bildstörningar; också väga in ökningen av fotoblekning). 4-6 ramar är vanligen tillräckligt.
    6. Gå tillbaka till skanning med slutgiltig (långsam) laserscanning villkor och justera: ljusstyrka (Använd minsta vinst att minska bakgrunden); laser power (så högt som krävs, så låg som möjligt - ökar fotoblekning, vanligtvis minimuminställningen är tillräckliga); Pinhole (undvika öppning om inte krävs, för att upprätthålla resolution).
      Obs: Scanning villkor beror på preparatet och behöver fastställas empiriskt i början av scanning sessionen. Se till att ljusstyrkan inte överstiger mättnad (begränsar förmågan att ändra bilden därefter genom bildprogram). När du skannar villkor ska också överväga att identiska förhållanden måste användas för alla imaging i experiment som jämför försöksdjur med kontroller.
    7. Capture image-serien. Koppla bilder till en enda projektionsbild.
      Obs: Kan behöva spara projektion bilder och/eller överlägg separat beroende på mikroskopet.
    8. När du tar bilder med flera kanal använda sekventiell skanning för att undvika genomlysningseffekten mellan kanaler (kritisk för samtidig lokaliseringsutredningar).
      Obs: Bildinställningar kan behöva ändras med tanke på ökad fotoblekning ansluten till längre söktiden.
    9. Alltid förvärva motsvarande DIC/Nomarski bilder (avsnitt) för sevärdheter och övergripande delstaten morfologi av skannade djur.

5. Kvantifiering av polariserade membran biogenes defekter i C. elegans tarmen

Obs: exempel: Basolateral förskjutning av apikala ERM-1::GFP och ektopisk laterala lumen bildandet induceras av Låt-767 och APS-1 RNAi.

  1. Scoring fenotyper under mikroskopet dissekera ( figur 5 A, D, E)
    1. definiera kategorier för poängsättning. Exempel: a vildtyp (WT), (ii) basolateral förskjutning av ERM-1::GFP (polaritet defekt), och (iii) ektopisk lumen bildandet (framkallar efter basolateral förskjutning).
      Obs: En låg förstoring visuell analys lämpar sig till scoring antalet djur med eller utan en specifik fenotyp. Här, valt vi ett exempel på tre kvalitativt olika fenotypiska kategorier som är på den samma tid som tyder på en försämring av den polaritet fenotyp som analyseras. Dock en mängd olika kvalitativa och kvantitativa fenotyper kan vara poängsätts, såsom lumen morfogenes defekter, frånvaro/närvaro (eller siffror) av GFP positiva cytoplasmiska vakuoler, lumen diameter och storlek eller antal intralumenal cystor (se < stark klass = ”xfig” > figur 3 för exempel).
    2. Beroende på omfattningen av förväntade skillnader, Poäng ungefärligt 100 levande maskar på deras agarplattor under mikroskopet dissekera i en dubblett eller tre exemplar uppsättning experiment.
      Obs: Måste en poäng varje djur som kommer in i vyn när du skannar plattor systematiskt, e.g. från övre vänstra till nedre högra av plattan (kontrollera att maskar har befolkat plattor jämnt).
    3. Upprepa detta för 3 oberoende uppsättningar med experiment. Generera stapeldiagram och utvärdera betydelsen av resultat.
  2. Scoring fenotyper under mikroskopet confocal ( figur 5 B)
    1. definiera kategorier för scoring, t.ex antal ektopisk lumen per djur
      Obs: en högre förstoring visuell analys lämpar sig till scoring en kvantifierbar markör eller fenotyp per djur och tillåter poängsättning av subcellulär markörer som inte kan skönjas genom att dissekera mikroskopi. Det aktuella exemplet räknar ektopisk lumen per djur i en delmängd av avmaskar av samma experiment tidigare utvärderats av dissekera mikroskopi (5.1.1, kategori 3) förfinar utvärderingen av den förvärra polaritet fenotyp som undersöks här. Dock en mängd andra fenotyper eller parametrar kan vara poängsätts, t.ex antal blåsor, närvaro/frånvaro eller antal subcellulära komponenter som tillsammans lokalisera, fluorescensintensiteten (den senare kvantifieras i ImageJ; Se medföljande papper på den utsöndringsorganen canal) 2.
    2. Beroende på omfattningen av förväntade skillnader, kvantifiera fenotypiska markör (här, ektopisk lumen) i cirka 20 djur i en dubblett eller tre exemplar av experiment under mikroskopet confocal.
    3. Upprepa för 3 oberoende uppsättningar med experiment. Generera grafer bar och utvärdera betydelsen av resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det här protokollet beskriver hur molekylärt analysera och visualisera polariserade membran biogenes och lumen morfogenes i C. elegans tarmen, den enda cell och subcellulär nivå. Den tjugo-cell singel-skiktad C. elegans tarmen bildas av riktad celldelning och migration under mitten av embryogenes. Vid denna tid, polariserade membran domäner blivit etablerad, men de novo polariserade membran biogenes fortsätter i den mogna men expanderar epitel i hela fyra larval arrangerar förrän i vuxen ålder, gör det möjligt att fokusera analysen på polariserat membranet biogenes (figur 1A).

För att visualisera C. elegans cellulär och subcellulär komponenter, används vanligen två strategier: immunofluorescens (detaljerad i detta protokoll, avsnitt 1. Figur 2 , Figur 4 d -F) och uttrycket av fluorescens fusionsproteiner (detaljerad i medföljande papperet på utsöndringsorganen canal polariserade membran biogenes2; Figur 1B, figur 2, figur 4, figur 5 c). Dubbel och flera märkning, kombinera olika etiketter av varje eller båda metoder, kan lösa membran asymmetrier som apikala och basolateral membran domäner, och relationen mellan olika subcellulära komponenter till varandra (figur 2, Figur 4 d-E). Membran-cytoskelettet länkaren ERM-1::GFP visas här som en indikator på apikala membran biogenes som sammanfaller med lumen morfogenes i denna enda lager epitel. Genom att använda denna markör, en array av intestinala apikala membran/lumen biogenes defekter och deras orsakande genen brister kan identifieras genom förlust-av-funktion studier, till exempel av opartisk genome-wide skärmar med hjälp av RNAi (RNAi strategier antagits till den generation av sådana fenotyper beskrivs i avsnitt 2 i detta protokoll). Figur 3 och figur 4 visar exempel på låg till måttlig förstoring bilder av apikala membran/lumen biogenes fenotyper förvärvats av dissekera fluorescens Mikroskop utrustat med en hög effekt mål; och av högre förstoring bilder som förvärvats av en confocal laser skanning Mikroskop (dessa mikroskopiska metoder beskrivs i avsnitten 3 och 4). Som ett exempel att kvantifiera polariserade membran biogenes defekter, effekterna av RNAi med Låt-767 (kodning en steroid dehydrogenas/3-ketoacyl-CoA-reduktas) och aps-1 (kodning den sigma subuniten av clathrin AP-1 adapter) på ERM–1::GFP lokalisering och lumen placering framgår av figur 5.

Figure 1
Figur 1 : Cellulär och subcellulär struktur och morfogenes av vild-typen C. elegans tarmen. (A) Schematisk av C. elegans intestinal utveckling, cellulära sammansättningen, och endo- och plasma membran. C. elegans tarmen genereras klonalt från den E blastomerer född i 8-cellstadie. Efter fyra rundor av celldelning, dess 16 celler (E16 Stadium) form en radially symmetrisk fördubblats-skiktad epitel15. I detta skede polariserar cytoplasman i varje cell, med kärnor flyttar till framtida apikala och cytoplasmiska komponenter går mot motsatsen (framtid basal), membran domäner. I ett interkalation steg flytta vänster och höger ventrala celler (parallellt) till det dorsala celllagrar bildar bilateralt symmetriska röret 9 INT ringar. Varje cell ansikten och bygger lumen med dess apikala/lumenal membran (grön, strukturellt kännetecknas av specifika membran microdomains, Mikrovilli) och kontakter angränsande celler eller organ hålighet med dess basolateral membran (blå), utom först INT ring som bildas av fyra celler. Apikala korsningar (röd) separata apikala och basolateral membran domäner. Efter interkalation fortsätter de novo membran biogenes tillsammans med tillväxten av tarmen under sena embryogenes och de fyra larval stegen in i vuxenlivet, där endast minimal ytterligare tillväxt uppstår (fas av polariserade membran underhåll ). Den förstorade enda cellen anger endomembrane systemet med ER och Golgi ovanför kärna (N) och endosomal blåsor. (B) DIC/Nomarski och confocal överlappning micrographs av utveckla C. elegans tarmen märkt med den apikala membran-cytoskelett markören ERM-1::GFP. Tarmen i comma skede beskrivs av en vit linje (ERM-1::GFP redan svagt uttrycks på det apikala membranet i början av interkalering men kan inte uppskattas i denna bild). Djur nedåt här och nedan är visad med främre (huvud) vänster, bakre (svans) rätt, dorsala upp, ventrala. Skalstapeln: 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Exempel på dubbel- och Trebäddsrum märkning av framkallningen vildtyps- C. elegans tarmen med hjälp av antikroppar och fusionsproteinerna. (A, B) Embryon. (A) Comma scenen. PAR-6::GFP (green; komponent av den apikala PAR polariteten komplexa), anti-PAR-3 antikropp (röd/TRITC (tetrametyl rodamin isothiocyanat), en annan komponent av den apikala PAR polariteten komplexa) och MH33 (blå/Cy5 (Cyanine5), anti-IFB-2/intermediär filament). PAR-6::GFP och PAR-3 antikroppen etikett apikala membranet i C. elegans tarmen (och avslutas). IFB-2, en annan apikala markör på senare stadier är panmembraneously lokaliserade i detta tidiga skede. PAR-6::GFP och anti-PAR-3 också etikett svalget (vänster); intestinala lumen indikeras av deras överlappning med IFB-2 (turkos) och intestinal röret är beskrivs av blå anti-IFB-2 (höger). (B) 2-faldig scenen. AJM-1::GFP (grön, korsningen komponent), ICB4 antikropp (röd/Alexa, ICB4 upptäcker okända membraneous intestinal antigen). AJM-1::GFP etiketter apikala korsningar av C. elegans tarmen, synliga som peri-lumenal stege mönster (det också etiketter hypodermal korsningar inte synlig sedan bilden är fokuserad på tarmen; se avsnitt 4, confocal imaging). ICB4 fläckar alla membran av C. elegans tarmen. Pilarna pekar på basolateral membran färgas av anti-ICB4. (C, D) L2-larver. (C) Låt-413::GFP (grön), phalloidin (röd/Texas-röd, en phallotoxin bindande till F-aktin) och MH33 (blå/Cyanine5, anti-IFB-2). Låt-413/Scribble är en komponent i basal polariteten komplexa och lokaliserar till basolateral membran av C. elegans tarmen (och avslutas). Phalloidin och IFB-2 antikroppen etikett apikala submembraneous cytoskelettet i C. elegans tarmen (lila). Phalloidin fläckar också starkt kroppen väggen musklerna, överväldigande intestinal färgningen. Infälld visar högre förstoring av boxed område. (E) L3-larven. SLCF-1::GFP (grön, integrerad membRane komponent/socker transportör), ERM-1::mCherry (röd) och MH27 antikropp (blå/Cyanine5, anti-AJM-1). SLCF-1::GFP etiketter basolateral membranet, medan ERM-1::mCherry etiketter apikala membranet i C. elegans tarmen (och avslutas); AJM-1 etiketter dess apikala korsningar. (F-F''') L2 larv. (F, F') Enstaka färgbilder. SLCF-1::GFP (grön) Etiketter basolateral membranet (laterala membran anges med tunna vita pilar). MH27 (blå/Cyanine5) Etiketter apikala korsningar (korta gula pilar). (F''F''') Överlagra bilder med och utan aktin. Inläggningar visar högre förstoring av boxed områden. Obs tydlig åtskillnad av apicolateral vinkel av intestinala celler av dessa olika membran/korsningen markörer som visas ytligt sett liknande i enstaka färgbilder (F, F'). Tjocka vita pilarna i F'''peka på apikala/lumenal aktin cytoskelettet märkt av phalloidin (annars överväldigad av muscle aktin). Alla bilder är confocal projektioner (z-stackar på 0,2 µm), förvärvas av sekventiell skanning för att undvika genomlysningseffekten mellan kanalerna. Skala barer (för A-E, F-F'' ' och alla inläggningar): 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Exempel på C. elegans intestinal polariserade membran och lumen morfogenes defekter vid låg till måttlig förstoring (dissekera fluorescens micrographs). Alla bilder är förvärvade genom att dissekera fluorescerande Mikroskop utrustat med en skräddarsydd high-power stereo fluorescens-bilaga (Tabell för material). Olika förstoringar visas. Alla fenotyper erhölls av RNAi med olika gener i en stam som heter med ERM-1::GFP (lokaliserad på tarm och utsöndringsorganen canal apikala/lumenal membran på embryonala och tidig larval arrangerar, visas här). De intestinala lumen och polaritet fenotyperna är: (A, B) Wild type embryo (A) och larva (B). (C, D) basolateral förskjutning av ERM-1::GFP; intestinala celler förstoras och visas uppsvälld i detta embryo (C, pilarna pekar på enda intestinala celler), men är av vildtyp storlek och arrangemang i dessa larver (D, pilen pekar på laterala membran mellan INT II och III); (E) vidgade och invecklad lumen i tre embryon. (F) ERM-1::GFP breddning till laterala junction område (sicksack lumen) och intestinal cytoplasman som innehåller GFP-negativ vakuoler (pilar); (G) lumenal cystor emellan intralumenal sammanväxningar (pilarna peka på två cystor). (H) Cytoplasmic och basolateral ERM-1::GFP förskjutning med ektopisk lumen (pilar); (jag) ERM-1::GFP förskjutning till GFP-positiv puncta (pilar) i cytoplasman. Utsöndringsorganen kanaler och utsöndringsorganen canal fenotyper beskrivs inte här (canal visas till vänster, tarmen till höger i alla bilder). Skala barer: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Exempel på C. elegans intestinal polariserade membran och lumen morfogenes defekter på högre förstoring (confocal bilder). (A, C, E, G, I, K) Embryon. (B, D, F, H, J, L) Larverna. Alla fenotyper erhölls av RNAi med olika gener i en stam som heter med ERM-1::GFP (grön i alla bilder). Imaging är inriktad på tarmen. Bilder av embryon visar också utsöndringsorganen kanaler (vänster sida av bilden), inklusive canal fenotyper (inte beskrivs). (A, B) Vildtyp embryo (A) och larva (B). (C) Basolateral förskjutning av apikala ERM-1::GFP (comma scenen; sen interkalation). (D) polaritet konvertering: basolateral förskjutning av apikala ERM-1::GFP och apikala ansamling av basolateral ICB4, avslöjade av dubbel märkning. F-aktin (märkt av phalloidin-TRITC) beskriver djuren genom färgning längsgående muskelbuntar (djur är trippel märkt). (E) Basolateral förskjutning av ERM-1::GFP i sent 3-faldig embryo. Den apikala IFB-2 antikroppen (blå/Cyanine5) indikerar intakt lumen och peri-lumenal mellanliggande glödtrådar. (F) ektopisk lumen märkt av anti-IFB-2 (blå/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP negativa vakuoler i intestinal cytoplasman. (H) ERM-1::GFP positiva vakuoler i intestinal cytoplasman. (I, J) Avsaknad av lumen i embryot och larver, respektive. (K) brett gut. (L) cystisk och invecklade gut. (A, D, H, I, J, K, L) är confocal projektioner. (B, C, E, F) är confocal sektioner. Ljusstyrka ökades i G att belysa cytoplasmiska GFP-negativ vakuoler. Skala barer: 10 µm (samma för alla embryon och yngel, respektive). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Intestinal polaritet konvertering och återgång: ett exempel för kvantifiering av polariserade membran och lumen biogenes defekter. (A, B, C) Låt-767och aps-1RNAi båda orsakar ERM-1::GFP basolateral förskjutning (BL) och ektopisk lumen bildandet (EL), men i olika utvecklingsstadier. (A) kvantifiering av dissekera Mikroskop: räkna av embryon (vänster) och larver (höger) med polaritet fenotyper 2 dagar efter sådd maskar på RNAi tallrikar. Obs: alla mock och let-767(RNAi) djur har kläckts och vid denna tid (det finns således inga embryon, som hade, men alla vildtyp polaritet; bruten linje kolumner). APS-1 RNAi inducerar polaritet brister redan i embryon, medan Låt-767RNAi inducerar dem i larver. Den högre andelen ektopisk lumen (vs basolateral förskjutning) i aps-1RNAi embryon kontra larver är på grund av gripandet av embryon med ektopisk lumen. (B) kvantifiering av konfokalmikroskopi: räkna av ektopisk lumen per djur i början av ektopisk lumen utveckling i larver. Låt-767 RNAi inducerar mer ektopisk lumen i larver än aps-1RNAi (aps-1RNAi larverna är ”utplanterade” som har inte arresTed som embryon). (C) Confocal bilder för vildtyp larver och yngel med ERM-1::GFP basolateral deplacement (BL) och ektopisk lumen (EL); skalstapeln: 5µm. (D, E) polaritet återgång i Låt-767RNAi djur (räkna djur med och utan polaritet defekt [BL/EL] genom att dissekera Mikroskop). 20 let-767(RNAi) djur med mild ektopisk lumen fenotyper var överförs från en RNAi plattan till en OP50 plattan på dag 4 och utvärderas efter 40 timmar. (D) mer än 50% larver har återgått till vildtyp polaritet (ERM-1 på det apikala membranet). (E) 20% av djur växer upp bortom den L1 larvstadium (let-767(RNAi) resultat i L1 arresteringsorder). Alla data visas som medelvärde +/-SEM, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Exempel på markörer för C. elegans larver och vuxna intestinal membran system1.
Protein namn Subcellulär lokalisering Protein struktur och funktion Kommersiellt tillgängliga C. elegans specifika antikroppar (DSHB2) Exempel på stammar tillgängliga på CGC
OPT-2/PEPT-1 apikala transmembrane protein Oligopeptide transportör KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412)::
GFP) + pha-1(+)])
AQP-4 apikala transmembrane protein vattenkanal
ERM-1 apikala brushborder membran – cytoskelettet linker ERM1
ACT-5 apikala brushborder cytoplasmiska aktin (3)
IFB-2 apikala brushborder mellanliggande glödtråden komponent MH33
EPS-8 apikala brushborder Human-epidermal-Growth-Factor-receptor-Kinase-substrate-8 ortholog
PAR-6 apikala membran apikala polaritet komplex komponent
SLCF-1 basolateral transmembrane protein monocarboxylate transportör
AQP-1 basolateral transmembrane protein vattenkanal
LÅT-413 basolateral membran Klotter homologt, adapter och polaritet determinant LET413
HMP-1 apikala junction (CCC4) Α-catenin, cadherin-catenin komplex komponent FT1609 (unc-119(ed3) III; xnIs528 [hmp-1p::hmp-1::
GFP + unc-119(+)])
HMR-1 apikala junction (CCC) E-cadherin, cadherin-catenin komplex komponent HMR1
AJM-1 apikala junction (DAC5) korsningen integritet molekyl, DLG-1/AJM-1complex komponent MH27 SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
DLG-1 apikala junction (DAC) Skivor-stora homologt, MAGUK protein, DLG-1/AJM-1complex komponent DLG1
RAB-11 endosomal blåsor människohandel6 RT311 (unc-119 (ed3) III; pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
RAB-5 endosomal blåsor människohandel RT327 (unc-119 (ed3) III; pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
RAB-7 endosomal blåsor människohandel RT476 (unc-119 (ed3) III; pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
RAB-10 endosomal blåsor människohandel RT525 (unc-119 (ed3) III; pwIs206 [pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
MANS Golgi Α-mannosidase II RT1315 (unc-119 (ed3) III; pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1 Exempel är utvalda från resurser listade i tabell3.
2 Utvecklande studier Hybridomteknik Bank.
3 Antikroppar mot ryggradsdjur aktin korsreagerar.
4 CCC: cadherin-catenin komplex; lokaliserar den apikala delen av apikala korsningen; motsvarande adherens junction (AJ).
5 DAC: DLG-1/AJM-1complex; lokaliserar den basala delen av apikala korsningen; motsvarande åtsittande föreningspunkt (TJ).
6 Se ref (22) för ytterligare vesikler-associerade molekyler uttryckt i tarmen.
Obs: inte alla molekyler har testats som fusionsproteinerna under deras egna initiativtagare eller av antikroppar.
Tabell 2 : Exempel på C. elegans tarmen-specifika initiativtagare och tid uttryck1.
Initiativtagare Uttrycket scenen
ELT-2 uttryck inleds etapp 2 E cell och kvarstår in i vuxenlivet
VHA-6 uttryck börjar i sena embryot och kvarstår in i vuxenlivet
ges-1 uttryck börjar ungefär i 4E cellstadie och kvarstår in i vuxenlivet
slutet-1 uttryck börjar efter 1E cellstadie och försämras vid senare embryogenes
1 Exempel är utvalda från resurser som anges i tabell 3.
Tabell 3: Resurser för att hitta C. elegans tarmen-specifika molekyler, märkning reagenser/stammar och antikroppar.
1. Caenorhabditis genetik Center (CGC)42 för tillgängliga reagenser och stammar
2. Wormbase43 information om tarmen-specifika molekyler, stammar och antikroppar
3. Informa
om tarmen-specifika molekyler20,44 4. Transgeneome hemsida45 för translationell GFP fusion konstruktioner 5. C. elegans uttryck mönster46 för transkriptionell GFP fusion konstruktioner 6. nationella BioResource Project (NBRP)::C.elegans47 information om tarmen-specifika initiativtagare 7. utvecklande studier Hybridomteknik Bank (DSHB)48 för C. elegans antikroppar 8. för sekundära antikroppar och färgämnen se referens27,28

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det här protokollet beskriver hur man kombinerar standard förlust-av-funktion genetiska/RNAi och imaging (märkning och mikroskopiska) metoder för att dra nytta av C. elegans intestinal epitel som modell för visuella och molekylär dissektion av i vivo polariserade membran och lumen biogenes.

Märkning

Detta protokoll fokuserar på antikropp färgning. In situ märkning av antikroppar är en mycket specifik alternativa förhållningssätt till märkning av fluorescerande fusion proteiner (beskrivs i det medföljande papperet på utsöndringsorganen canal membran biogenes)2. Även om antikroppar färgning inte tillåter levande imaging, kan det ge bekräftelse för lokalisering av ett protein av intresse (varken märkning metoden är utan att misslyckas). Frågor gällande morfogenes eller subcellulär lokalisering av ett protein kan dessutom ofta bedömas i fasta djur. Immunfärgning är användbart för flera vertyg och dubbel och den kan kombineras med märkning av fluorescerande fusionsproteinerna om dessa kan bevaras genom förfarandena som krävs fixering och permeabilisering. Här beskrivs protokollet tillåter vanligtvis detta (figur 2). In situ märkning av fasta djur av antikroppar eller kemiska fläckar kan också ge fördelar för superupplösning mikroskopiska tekniker såsom STORM (stokastiska optiska återuppbyggnad microscopy). Immunofluorescens upptäcker det kroppsegna antigenen och kan anpassas, till exempel för att skilja specifikt posttranslationell protein ändringar. Det kan ge snabba resultat om antikroppar är tillgängliga, en gång i situ färgning tekniker - inte som okomplicerad i C. elegans exemplar som i cellkultur - har fastställts.

Generering av en ny antikropp (inte beskrivs här) är dock tidskrävande. Tyvärr, valet av kommersiellt tillgängliga C. elegans primära antikroppar är fortfarande ganska liten, och inte alla är kunna upptäcka det antigen i situ (se tabell 1 för exempel på antikroppar påvisas att upptäcka intestinal antigener i situoch tabell 3 ytterligare resurser). De flesta antikroppar genereras mot ryggradsdjur antigener kommer inte korsreagerar med deras C. elegans homologs. Valet av sekundära antikroppar måste beakta arten av den första antikroppen (diskuteras i allmänna immunofluorescens protokoll27,28). Stora val är kommersiellt tillgängliga med att kontinuerligt förbättra fluorescerande färgämnen (t.ex. Alexa-Fluor färgämnen). För optimerad färgning, färgämnen kan väljas för deras förmåga att matcha mikroskopet används för imaging, t ex laser av confocal Mikroskop, eller, om super upplösning mikroskopi planeras också, för sin förmåga att ”blinka”37. Direkt märkt primära antikroppar eller kemiska fläckar (t.ex. fluorescently märkt phalloidin) finns också tillgängliga och är särskilt användbara för dubbel färgning.

Svårigheten för i situ -antikropp färgning i C. elegans är ogenomtränglighet av embryots äggskal och larver/vuxen nagelbanden att båda kräver kemiska eller mekaniska störningar att tillåta åtkomst av antikropp till vävnaden. Även om komplexa flytande antikropp färgprotokollen har utvecklats för att övervinna detta problem27,28, innehåller de flesta kollagenas för permeabilisering, som tenderar att skada målvävnaden. Däremot är den frysa-spricka metod som beskrivs här ett enkelt sätt att öppna maskens nagelband eller äggskal. Det utförs direkt på glaset Skjut där exemplaren samlas (och där resten av färgningen utförs också) och fungerar särskilt bra för ägg och larver som fastnar bäst objektglas (dvs stadier behandlas huvudsakligen i tubulogenesis studier). Det också stör inte bevarandet av fluorophore-märkt fusionsproteinerna. Tekniken kräver en del fingerfärdighet, som det rätta trycket på täckglaset (före snärta) och undvikande av skjuvning trycket är kritiska för att bevara preparatet (som är varsam hantering och pipettering under hela förfarandet vid färgning).

Fixering villkor kan behöva empiriskt bestämmas och justerat för struktur/antigenet som ska färgas (diskuteras i27). Mildare (t.ex. formaldehyd-baserade) fixering tekniker kan bättre bevara antigenicitet, även om detta måste vägas mot behovet av att upprätthålla vävnad morfologi, kritiska för analys av morfogenes. Mildare fixering villkorar också hjälp att bevara fluorescerande fusionsproteinerna i dubbel märkning experiment. Likaså kräver mängden blockera agent (t.ex. mjölk eller bovint serum albumin/BSA) och rengöringsmedel i tvättlösningen empiriska justering att balansera bakgrund med specifik färgning. Information om allmänna aspekter av immunofluorescens tekniker, t.ex. diskussion av olika färgning tekniker, utformning av lämpliga kontroller och tips för att optimera dessa förfaranden för mask tarmar (t.ex. minimera intestinal autofluorescens) kan hittas i allmänhet och C. elegans specifika immunofluorescens protokoll, som det hänvisas till i hela.

Interferens med geners funktion och utvärdering av tubulogenesis fenotyper

Detta protokoll belyser specifika RNAi-metoder som är användbara när du utvärderar gener med tidiga, väsentliga och allestädes närvarande funktioner, vars partiell (snarare än komplett) förlust är mest informativa, som är fallet för de flesta tubulogenesis gener (vår genome-wide skärmen på ERM-1::GFP-märkta tarmar föreslog att störningar med sådana gener orsakar > 90% av alla informativa tubulogenesis fenotyper i detta viss inställning12). De många fördelar som C. elegans erbjuder för genetiska manipulationer (t.ex. dess kort generationstid) och de olika synsätten stör geners funktion av framåt (start med den funktion/fenotypen) och omvända (börjar med den genen) genetiska metoder diskuteras i allmänna C. elegans litteratur31,38. Tillgängligheten av kommersiellt tillgängliga genome-wide RNAi utfodring bibliotek också gör att man kan använda omvänd genetiska tekniken som ett framåt genetisk screening-verktyg (se Tabell av material för resurser). De specifika fördelarna med RNAi för analys av tubulogenesis omfatta dess förmåga: att generera en rad fenotyper motsvarar en mutant alleliska serie (detta oftast fungerar bra för dosberoende morfogenes gener); ta bort moderns RNAs (vanligtvis inblandade i tidig morfogenes/tubulogenesis); scenen-specifikt ingripa (användbart för att utvärdera effekter på polariserade membran biogenes under postmitotic larver tillväxt).

Information om allmänna aspekter av RNAi förfarandena diskuteras i refs (26,s = ”xref” > 31). Nyckel för analys av dödliga tubulogenesis fenotyper är förmågan att modulera RNAi villkor att öka spectrumen av fenotyper. Informativa tubulogenesis fenotyper kan vanligtvis genereras i en vildtyp bakgrund utan behov av tarmen-specifika RNAi stammar39. Dock sådana stammar är tillgänglig om detta misslyckas och kan också användas för att skilja cell-självständiga från icke-självständiga effekter. Olika metoder för modulerande styrkan av RNAi har rapporterats, t.ex. titrering av IPTG koncentrationer för induktion av dsRNA, en strategi som kan producera de mest reproducerbara resultat30. Quantitatively exakt titrering kan dock inte vara nödvändigt när syftar till att generera ett spektrum av olika fenotyper. Övergripande, framgången för denna analys är inte så mycket beroende av att maximera RNAi effekten som det är på fastställande RNAi villkoren som genererar en informativ spektrum av fenotyper (som ofta kan vara resultatet av suboptimal (e.g. mildare) RNAi villkor).

För visuell bedömning av tubulogenesis fenotyper induceras av RNAi är det viktigt att fastställa optimala fönstret för fenotypisk utvärdering. Det är bäst att börja utvärdera plattorna tidigt (t.ex. två dagar efter plockning djuren till deras RNAi tallrikar standard RNAi villkor) och att följa dem tillräckligt länge för eventuella sena effekter. En utvecklande tid kurs en förvärrad polaritet defekt, exempelvis bör omfatta 3-7 dagar i vanligtvis arresterade larver. Villkor för analys av polariserade membran biogenes i postmitotic icke-dela celler av larval tarmen kan förbättras ytterligare när mutanter eller RNAi djur med långsammare tillväxt (som, till exempel let-767(RNAi) eller mutant djur 12, figur 5). Någon tid kurs har till vara avbruten om F2 djur visas (kan ta bort L4s i experiment där de flesta men inte alla djur arrestera som larver). Varje experiment kräver samtidig utvärdering av lämpliga positiva och negativa kontroller (t.ex. bakteriell RNAi kloner som inducerar en definierad tubulogenesis fenotyp och Töm vektor- eller kodade RNAi kloner, respektive). Ett annat krav för utvärdering är en tillräcklig barnaskara storlek (minst 50). Om inte uppfylls, kan andra (t.ex. villkorlig) RNAi villkor prövas. Slutligen några särskilt intressanta tubulogenesis-fenotyper uppstå vid låga penetrans, således ett tillräckligt antal djur måste utvärderas.

Mikroskopi

Låg till måttlig förstoring dissekera fluorescerande mikroskopi och hög förstoring konfokalmikroskopi, de två imaging standardförfaranden som beskrivs här, är vanligtvis tillräckligt att karakterisera de grundläggande aspekterna av en tub eller lumen fenotyp i den C.elegans tarmen och kan också användas för att visuellt skärm större uppsättningar av djur i framåt skärmar. Dissekera fluorescensmikroskopi tillstånd: i vivo imaging av djur på sina tallrikar (levande djur, övergående orörlig med bedövningsmedel, kan dock också återvinnas från fästen efter confocal eller DIC imaging); screening stora uppsättningar av djur. spåra utvecklande händelser (t.ex. förskjutningen och ersätta en polariserad markör vid membran expansion); spårning av specifika uttrycksmönster (vissa mönster och asymmetrier bättre skiljs vid lägre förstoring); att välja och plocka fluorescerande maskar lämplig för vidare analys (t.ex. konfokalmikroskopi) eller för underhåll av extrachromosomal transgener. Visualisering vid hög förstoring av konfokalmikroskopi tillåter för att karakterisera fenotypen vid enskild cell och subcellulär nivå. Det här protokollet beskriver imaging med laser skanning confocal Mikroskop som erbjuder den bästa confocality över alternativ såsom en snurrande skiva confocal mikroskopet. En snurrande skiva confocal Mikroskop är dock mikroskopet val för dynamiska och time-lapse studier eftersom det framkallar mindre fototoxicitet (se refs (34,35) för vidare diskussion av låg och hög förstoring mikroskopi i C. elegans). Roman och konventionella mikroskopiska tekniker erbjuder ytterligare fördelar samt tillåta imaging med högre upplösning in i nanoskala spänner (e.g. transmission electron och super-resolution mikroskopi, diskuteras i37, 40).

När imaging C. elegans tarmarna under en confocal Mikroskop, är det viktigt att montering och immobilisering. Bland olika kemikalier för immobilisering fungerar natriumazid - även om giftiga - de flesta tillförlitligt om skanning görs omedelbart. Levamisol, producerar även om inte giftiga, hypercontraction som ibland stör utvärderingen av morfogenes fenotyper. Vissa bedövningsmedel kan störa membran-associerade fluorescerande proteiner och kan producera artefakter som kan se ut som polaritet defekter. C. elegans är en tjock exemplar och således 3D analys (snittning) är viktigt att utnyttja den specifika styrkan av tubulär intestinal epitel som gör utmärkta visualisering av apikala korsningar och laterala membranet (inte enkelt tillgänglig i platt epitel). Confocal inställningar måste justeras för varje bild och målet att uppnå god kvalitetsbilder, inklusive parametrar som bracketing, i genomsnitt, lasereffekt, viktökning, pinhole och ljusstyrka. Ett speciellt problem för intestinal imaging är detta en orgel innehåll grön/gul autofluorescent granulat (Lysosomen relaterade organeller (LROs)) som kan störa tolkningen av resultaten, särskilt vid bedömningen av förskjutning av GFP-märkta endo - och plasma-membran associerade komponenter. Problemet är välkänd i fältet och kan lösas med olika metoder (beroende på Mikroskop), inklusive DAPI utslagning, spektrala fingeravtryck och empiriska skannerns inställningar13,41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Mario de Bono (MRC laboratorium för molekylärbiologi, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, USA), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, Frankrike), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Frankrike) och CGC, finansierad av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440), för stammar och antikroppar. Detta arbete stöds av bidrag NIH GM078653, MGH är 224570 och SAA 223809 till V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
  2. Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE. , (2017).
  3. Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).
  4. Mellman, I., Nelson, W. J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).
  5. Nelson, W. J. Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 422, 766-774 (2003).
  6. Goldstein, B., Macara, I. G. The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization. Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).
  7. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Organization of vesicular trafficking in epithelia. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).
  8. Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).
  9. Tepass, U. The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).
  10. Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. Polarity and endocytosis: reciprocal regulation. Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).
  11. Bryant, D. M. A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).
  12. Zhang, H. Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).
  13. Zhang, H. Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis. Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).
  14. Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes. PLoS Genet. 12 (4), e1005950 (2016).
  15. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).
  16. Altun, Z. F., Hall, D. H. Alimentary system, intestine. WormAtlas. , (2009).
  17. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  18. Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract. Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).
  19. Maduro, M. F. Gut development in C. elegans. Seminars in cell & developmental biology. , (2017).
  20. McGhee, J. D. The Caenorhabditis elegans intestine. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).
  21. Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  22. Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  23. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  24. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  25. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  26. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  27. Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).
  28. JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  29. T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  30. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  31. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  32. Simmer, F. Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).
  33. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  34. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  35. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  36. Netherlands, S. Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , Springer. Netherlands. (2008).
  37. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).
  38. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).
  39. Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions. Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).
  40. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).
  41. Shi, A., Grant, B. D. In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).
  42. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  43. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  44. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2007).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , http://dshb.biology.uiowa.edu (2017).
  49. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  50. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  51. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 128 Tubulogenesis epitelial polaritet membran biologi utvecklingsmässiga genetik encelliga analys i situ imaging
<em>C. elegans</em> tarmen som en modell för intercellulära Lumen morfogenes och <em>In Vivo </em>polariserade membran biogenes på Single-cell nivå: märkning av antikropp färgning, RNAi förlust-av-funktion analys och Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, N., Khan, L. A., Membreno,… More

Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter