Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56100
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

Abstract

Çok hücreli tüpler, tüm iç organları, temel birimleri polarize epitelyal veya endotel hücrelerinin apikal membranlar ile her diğer ve/veya hücre dışı matriks irtibata Lümen ve demiri membranlar astar oluşur. Nasıl bu farklı membran asimetrisi kurulan ve organ morfogenez sırasında tutulan hala bir çözümlenmemiş hücre biyolojisi meselesi. Bu iletişim kuralı sırasında apikal membran ve Lümen Biyogenez vurgu ile tüp morfogenez polarize membran dipnotlar analiz için bir model olarak C. elegans bağırsak açıklar. C. elegans yirmi-hücre tek katmanlı bağırsak epitel bir tek hücre düzeyinde çözümleme izin basit bir bilateral simetrik tüp içine yerleştirilmiştir. Membran polarizasyon kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve geçiş sırasında erken embriyogenez ama polarize de novo hücreleri artık çoğalırlar ve hareket membran Biyogenez larva büyüme devam eder oluşur. İkinci ayarı bir aynı anda farklı bu polarize süreçleri, çoğu polarite modellerinde ayırt etmek zor aracılık hücre altı değişiklikleri ayırmak izin verir. Apikal-, demiri membran-, bileske-, hücre iskeleti- ve endomembrane bileşenleri etiketli ve geliştirme GFP füzyon proteinler tarafından izlenen veya in situ antikor boyama tarafından değerlendirildi. Organizmanın genetik çok yönlülüğü ile birlikte, C. elegans bağırsak böylece benzersiz vivo içinde modeli için görsel, gelişimsel ve polarize membran ve tüp Biyogenez moleküler genetik analizi sağlar. Belirli yöntemler (tüm standart) burada açıklanan nasıl yapılır: bağırsak hücre altı bileşenleri etiket antikor boyama tarafından; genler polarize membran dipnotlar içinde yer alan işlev kaybı çalışmalar genellikle temel tubulogenesis genler için adapte tarafından analiz; farklı gelişim dönemleri sırasında polarite kusurları değerlendirmek; epifluorescence, fark girişim kontrast (DIC) ve confocal mikroskobu fenotipleri yorumlamak; görsel kusurları ölçmek. Bu iletişim kuralı epitel polarite, membran dipnotlar, tüp ve Lümen morfogenez herhangi ilgili kez son derece korunmuş moleküllerin analiz etmek için adapte edilebilir.

Introduction

Polarize membran etki alanları, oluşumu gibi hücresel ve hücre altı asimetriler nesil morfogenez ve hücre, doku ve organların1fonksiyonu için önemlidir. Hücre altı bileşenleri tahsisi yön değişiklikleri olan birden çok ardışık ve çakışık ekstraselüler ve hücre içi sinyalleri bağlıdır beri epiteli polarize membran Biyogenez üzerinde çalışmalar teknik bir sorun kalır zor çoğu modellerinde ayrı ve güçlü modeli sistemine bağlıdır. Tek katmanlı model burada - sunulan Caenorhabditis elegans bağırsak - zarif sadeliği bir doku olduğunu. Tek hücreli ile birlikte C. elegans boşaltım kanalı (bkz: kağıt polarize membran Biyogenez C. elegans boşaltım kanalı içinde eşlik)2, kimlik için birkaç benzersiz avantajlar sağlar ve molekülleri polarize membran dipnotlar için gerekli karakterizasyonu. Maya moleküler polarite ipuçları adama koruma yapmak bu basit omurgasız organ mükemmel bir"in vivo doku odası" hala çok şey insan sistemine doğrudan konu ile ilgili olan epitel polarite ilgili soruları için karmaşık görsel diseksiyon bu olayların tek izin düzeyi içinde vivohücre.

Birden çok korunmuş polarite İpuçları (1 extracelluar matris, (2) plazma zarı ve kavşak ve (3) hücre içi veziküler kaçakçılığı saptanan3, kendi entegrasyon süreci temel ilkeleri olmasına rağmen polarize epitelyal membran ve doku Biyogenez kötü anlaşılan4' tür. Klasik tek hücreli vivo içinde modelleri (e.g.S. cerevisiae ve C. elegans zigot), polarize hücre bölünmesi ve ön-arka polarite tanımlama vesile olmuştur ve kritik belirledik membran ilişkili polarite belirleyicileri (küçük GTPases/CDC-42, bölümleme arızalı PARs)5,6, ama onlar İpuçları (bud yara, sperm giriş) breaking eşsiz simetri bağlıdır ve kavşak güvenli eksikliği apicobasal membran etki alanları ve muhtemelen, makine sıralama karşılık gelen hücre içi apicobasal. Şu anki bilgilerimize polarize epiteli, kaçakçılığı organizasyonu hakkında ancak, öncelikle memeli 2D monocultures7, hangi membran konumlarını değiştirebilirsiniz fizyolojik ekstraselüler ve gelişimsel cues eksikliği dayanır etki alanları ve kaçakçılığı yörüngeleri yönleri (MDCK (Madin-Darby köpek böbrek) hücrelerde membran Polarite ters çevirmek için bir geçiş 2D 3D vitro kültür sistemleri tek başına yeterlidir)8. İn vivo gelişim çalışmaları epitel polarite omurgasız canlılar üzerinde başlangıçta düz epiteli, Drosophila melanogaster epidermis nerede kritik katkı tespit örneğin yapılmıştır birleşme dinamikleri polarize hücre göç ve hücre levha hareketi9için ve endositik için polarite bakım10ticareti. 3D vitro ve in vivo analizi Lümen morfogenez borulu epiteli MDCK hücreleri ve C. elegans bağırsak içinde anılan sıraya göre son zamanlarda hücre içi de için kaçakçılık zorunluluğu belirledik Novo (apikal) etki alanı ve Lümen Biyogenez ve11,12,13konumlandırma. Kalınlığı (düz karşı) borulu epitel hücreleri biridir bir avantaj hücre altı asimetriler 3D analizi için üstün bir görsel ayrım apikal lumenal membran, apico-lateral kavşaklar, yanal membran, izin verir bu yana ve Hücre içi organellerin pozisyonlar. Bu görsel avantajları, C. elegans model ekler vücut planı, sabit ve tanımlı hücre soy, analitik sadeliği içinde vivo ayarı, gelişimsel eksen, saydamlık (genetik) ve ek avantajlar aşağıda açıklanmıştır.

C. elegans kendisi olan şeffaflık ve basit mimarisi, aynı şekilde borulu iç organları doğrudan tüp ve Lümen morfogenez görsel analiz için erişilebilir duruma tübüler yapısının yuvarlak bir kurt var. Onun bağırsak (zaman zaman 21 ya da 22 hücreleri)14 yirmi hücreleri bir tek progenitör hücre (E) elde edilen ve bir çift katlı epitel tarafından bir enterkalasyon adım 9 INT yüzük bilateral simetrik bir tüp içine geliştirmek (dört hücreleri ilk halka; Şekil 1 şematik)14,15,16. Başlangıçta Nomarski optik nükleer kimlikleri17ile ve daha sonra Floresans mikroskobu etiketli membranlar yoluyla tarafından belirlenen bağırsak'ın soy ve doku analizi, onun morfogenez, kritik anlayışlar içinde sağlamıştır belirli hücre özerk ve hücre-sigara özerk gereksinimleri yönlü hücre bölünmeler ve hareketleri (örneğin, enterkalasyon, sağ-sol asimetriler, anterior ve posteiror tüp döndürme)14,18 . Erken endodermal hücre özellikleri ve bu klonal modeli organ gelişimi kontrol gen düzenleyici ağ de karakterize19,20vardır. Burada, ancak, polarize membran ve Lümen Biyogenez tek tübüler hücrelerde ve endomembranes, hücre iskeleti yapıları ve bu sürecine eşlik organellerin hücre içi asimetriler analizine odaklanmıştır. Analiz nerede tüm apikal membranlar (ultrastructural düzey microvilli tarafından ayırt edici) Lümen yüz ve tüm Bazal membran dış boru yüzey birbirlerine temas yanal membranlar ile yüz bu tüp sadeliği tarafından yönetilir, apikal membran kavşaklar tarafından ayrılmış (şekil 1 şematik; bkz: başvuruları (16,21) C. elegans-özel organizasyon sıkı ve adherens junction bileşenleri). Apikal membran Biyogenez böylece Lümen morfogenez ile çakışık olduğunu. Ayrıca, Yetişkin bağırsak hücreleri - en büyük bu küçük hayvan hücreleri (boşaltım hücrenin özel durumla) - boyutunu yaklaşık vivo içinde görsel izleme hücre altı öğe, örneğin izin bir memeli hücre boyutu genellikle vezikül yörüngeleri vitro kültür tabak içinde çalıştı.

Bu hücre ve hücre altı çözümleme amacıyla uygun etiketleme önemlidir. Bağırsak endo veya plazma zarı etki alanları, kavşaklar, hücre iskeletiyapıları, çekirdek ve hücre altı diğer organelleri belirli moleküler bileşenleri etiketleme tarafından görüntülenmiştir. Böyle birçok bileşenleri ile karakterize ve keşfedilmeyi devam (tablo 1 birkaç örnek verir ve kaynaklara anlamına gelir). Örneğin, çeşitli moleküller yolu ile plazma zarı için yazı-Golgi veziküller Golgi acil servise gelen bağırsak endomembrane sisteminin borulu ve/veya veziküler bölmeleri ayırt tanımlanan22olmuştur. Belirli proteinler (yanı sıra lipidler ve şeker) de doğrudan veya dolaylı olarak protein bağlayıcı üzerinden etiketli. Bu iletişim kuralı in situ antikor sabit örnekleri, iki standart etiketleme teknikten birini boyama üzerinde duruluyor (eşlik eden kağıt boşaltım kanalı tubulogenesis diğer tekniği2 - bir açıklaması için bkz: vivo etiketleme Floresan protein füzyon - bağırsak için doğrudan geçerli olduğu; Tablo 2 bağırsak için ifade gibi füzyon proteinlerin sürücü için kullanılan bağırsak özel Organizatör örnekleri sağlar). Çift - veya her iki yaklaşım, veya her iki artı ek kimyasal boyama, karışımı ile birden fazla etiketleme daha fazla derinlemesine görsel çözünürlüğünü ve co yerelleştirme kayma ve zamansal değişikliklerinin incelenmesi ve özel alımı sağlar molekülleri veya hücre altı bileşenlerinin (Şekil 2). Fiksasyon ve bu iletişim kuralı desteği korunması immunostaining işlemler sırasında etiketleme yeşil flüoresan protein (GFP) açıklanan yordamları boyama. Görüntüleme için anahtar noktaları algılama ve karakterizasyonu fenotipleri standart mikroskobik prosedürler (floresan diseksiyon ve confocal mikroskobu) ile olan tubulogenesis ()şekil 3, 4açıklanan). Bunlar daha yüksek çözünürlük örnek superresolution mikroskobu ve transmisyon elektron (burada açıklanmayan) mikroskopi için yaklaşımlar görüntüleme için genişletilebilir.

Bu sistem bir anahtar gücü embriyogenez yetişkinlik aracılığıyla gelen farklı gelişim aşamalarında polarite tek tek hücreleri içinde çözümlenecek yeteneğidir. Örneğin, apikal membran etki alanı ve Lümen Biyogenez geliştirme tek hücre düzeyinde boyunca ERM-1, Ezrin-Radixin-Moesin aile23,24 son derece korunmuş membran-aktin bağlayıcı ile etiketleme yoluyla izlenebilir . Kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve göç (Lümen enterkalasyon sırasında etrafında apically hücreleri hareket)15ile ortaya çıktığında ERM-1 sırasında embriyonik tüp morfogenez, apikal membran dipnotlar (1) görüntüler; (2) hücre bölünmesi veya geçiş yokluğunda gelirleri geç embriyonik ve larva tüp uzantısı sırasında; ve (3) Yetişkin bağırsakta nerede polarize membran etki alanları (şekil 1) korunur. Genişleyen sonrası Mitotik larva epitel içinde de novo polarize membran Biyogenez böylece ayrılabilir çoğu in vivo ve in vitro epitel polarite modellerinde mümkün değildir, polarize doku morfogenez Bu tek hücreli çözünürlük (örneğin 3D MDCK kist modeli8) dahil. Diğer bileşenler için etiketleme ile bu ayarı (hücreleri daha yüksek bir sitoplazma/çekirdek oranı varsa özellikle L1 larva aşamasında) fırsat sağlar özgü bu hücre içi değişiklikleri ayırt etmek için polarize membran dipnotlar () örneğin kaçakçılığı yörüngeleri hale gelmesini) bu kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve geçiş için gerekli.

C. elegans genetik çok yönlülük iyi bilinen25ve biyolojik herhangi bir soru moleküler analiz için güçlü modeli sistem yapar. Morfogenez, üzerine bir çalışma, bir vahşi tipi yük, faiz (örneğin bir membran) yapısını floresan bir marker ile veya bir kaybı veya kazanç-in-fonksiyonlu mutant bir üründe ile ile nerede etiketli bir transgenik yük ile başlayabilirsiniz yapısı. Tipik bir ters genetik çalışma germline (örneğin tarafından hedeflenen silme), mutagenesis (genellikle nokta mutasyonlar sonucu kaybı, azaltılması ya da kazanç fonksiyonu ile üreten değiştiren bir mutant gen ilgi silinmesi oluşturabilir Gen) veya nerede onun transkript RNAi tarafından düşürülür. C. elegans26 besleme tarafından RNAi kolaylığı da ilgi genlerin daha büyük bir grup incelemek hedeflenen ekranlar için tasarım oldukça rahat. Bir genetik model organizma'nın tartışmasız en güçlü bir fenotip moleküler nedeni tarafsız bir soruşturma izni vivo içinde ileri ekranlar (örneğin mutagenesis, sistematik veya genom geniş RNAi ekranlar) yapmak için yeteneğidir faiz. Örneğin, tarafsız bir görsel C. elegans RNAi tubulogenesis ekran, apikal membranlar, ERM-1 olarak etiketlenmiş transgenik bir hayvanla ile başlayan bir ilgi çekici tersinir bağırsak polarite dönüşüm ve Ektopik Lümen fenotip, kullanılan keşfetti Burada bu tür analiz için bir örnek olarak. Bu ekran glycosphingolipids (GSLs; onların GLS biyosentetik enzimler ile tanımlanan zorunlu membran lipidler) tükenmesi ve vezikül kat clathrin ve onun AP-1 adaptör bileşenleri bu polarizasyona neden belirli moleküler kusurlar tespit dönüşüm fenotip, böylece bunlar molekülleri in vivo kaçakçılığı karakterize apikal membran polarite ve Lümen12,13konumlandırma için ipuçları. Ayrıca belirli genetik mutasyon/morfogenez fenotip ile Başlarken, bu tür ekranları (veya tek genetik/RNAi etkileşim deneyler) iki veya daha fazla faiz (bkz: kağıt üzerinde boşaltım eşlik eden genler arasındaki işlevsel etkileşimler inceleyebilirsiniz Canal böyle bir analiz örneği için)2. Bu iletişim kuralı hangi ek olarak doğrudan kimin fenotip ileri ekranları kaybolmasına neden gen tanımlama yeteneği onun morfogenez çözümlemesi için belirli avantajlar sağlayan RNAi odaklanır. Gen ürünü morfogenez kez yönetmenlik bir doz bağımlı biçimde çalışır beri RNAi fenotipleri bir spektrum oluşturmak için genellikle başarılı olur. Bilgilendirici işlevi, kısmi kaybı fenotipleri oluşturma yeteneği de önemli tubulogenesis genler çoğunluğu gerekli ve onların kayıpları kısırlık ve erken embriyonik ölümcül neden sorunu çözmek için yardımcı olur. Bu iletişim kuralı bu zorluk üstesinden gelmek için koşullu RNAi stratejileri içerir ve fenotipleri, mutagenesis tarafından üretilen bir allelic serisi gibi daha geniş bir spektrum nesil optimize etmek için yollar önerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. C. elegans bağırsak etiketleme

Not: boşaltım kanalı tubulogenesis 2 doku belirli floresan marker inşası için analiz yazarlar tarafından eşlik eden kağıt görmek Plazmid ve Transjenik hayvanlar transkripsiyon ve çevirim füzyon protein (ikinci faiz molekülünün hücre altı yerelleştirme için gerekli) üzerine tartışmalar da dahil olmak üzere, nesil. Bu yordamları faiz molekülünün bağırsak için sürücü için belirli Organizatör kullanarak adapte edilebilir. Tablo 1 C. elegans bağırsak endo - ve plazma membran ve onların kavşak görüntülenmesi için yararlı kanıtlanmış molekülleri örnekleri için Tablo 2 ifade bağırsak için sürüş için Organizatör örnekleri için bkz., ve bağırsak işaretleri ve Organizatör daha kapsamlı koleksiyonları için kaynaklar için Tablo 3.

  1. C. elegans bağırsak antikor boyama 27 , 28
    1. fiksasyon
      1. temiz cam slayt al ve poli-L-lizin için kullanın Koruman gereken solucanlar için ince bir film oluşturur. Yer 30 µL 0,1-%0,2 Poli-L-lizin yer üstünde belgili tanımlık Poli-L-lizin damla yapmak için ikinci bir slayt ve slayt üzerinde bir " sandviç ". Slaytları her ikisi de tüm yüzeylerin ıslak ve kalem ile 30 dk. için etiket buzlu yan slaytların kurutma söylemeni yavaşça bir kaç kez rub.
        Not: % 0.2 Poli-L-lizin aliquots 200 µL, dH 2 O toz çözülerek yapılmıştır; Bu kurtlardan yapışmasını geliştirmek için-20 ° c kullanım yüksek molekül ağırlıklı Poli-L-lizin saklanabilir. Poli-L-lizin konsantrasyonu da önemlidir. Çok düşük konsantrasyonlarda solucanlar sopa izin vermez ancak çok yüksek konsantrasyonda floresan arka plan sinyal verebilir. Çok kalın bir film bütünüyle gevşetin.
      2. Sıvı azot ile dolu bir düz metal blokta sıkıca bir konteyner (örneğin polistirol bir kapsayıcı) alt yerleştirin.
        Not: Bir yerine kuru buz kullanabilirsiniz, ancak sıvı azot metal bir blok konteyner alt daha sabit tutar ve iyi titreme.
      3. Ödemeli solucanlar da ile yıkama onların plakaları M9 29 ile kapalı ya da farklı sahne solucanlar (her iki yumurta, L1, L2, L3 ve L4 larva sahne solucanlar) her slayt üzerine almak. Genellikle, ~ 100 larva ve embriyo veya ~ 20 yetişkin her slayt için Seç. Yer 10 µL yıkanmış solucanlar orta slaydın üzerine kapalı veya çekme yumurta/worms 10 µL M9 veya 10 µL 1 x PBS 27 (fosfat tamponlu tuz).
          Solucanlar topaklanma önlemek için çok sayıda yaymak için kullanın bir pipet
        1. .
          Not: nüfus-in karışık solucanlar yıkanmış, kalabalık nedeniyle ve farklı aşamaları, kalınlığı sopa değil iyi ve daha az etkili donma-kırık (aşağıya bakın) vardır, bu nedenle malzeme çekme sahne özel solucan (veya eşitlenmiş nüfus) üstün sonuçlar verir. Larva sopa yetişkin daha iyi ve daha fazla hayvan slayt yerleştirilebilir.
          2. Malzeme çekme slaytlar, solucanlar önce
        2. transfer OP50 bakteri olmadan Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) plaka 29. Aşırı bakteri yapışık solucanlar için Ayrıca yapışmasını ile etkileyebilir. Solucanlar kurumasına olduğunu dikkat.
      4. Yer (damla) 22 mm × 22 mm coverslip çapraz-alışkanlıklar üzerine toplanan öyle ki en az bir slayt tarafında kenarlarından telefonu hafifçe solucanlar. Düz nazikçe ama sıkıca bir ya da iki parmak ile coverslip bastırın. Bu doku bütünlüğü zarar verir kesme önlemek.
      5. Hemen ve yavaşça slayt sıvı azot metal blok ve transfer dondurmak yaklaşık 5 dakika oturmak izin. O zaman " kapalı fiske " bir swift coverslip hareket çıkıntılı kenarı kullanarak.
        Not: Bu adım kararlı yapılmalıdır ve slayt ulaşmak için dondurulmuş iken " çatlama " manikür. Dikkat: Lütfen sıvı azot ile çalışırken KKE (kişisel koruma araçları) yönergeleri izleyin.
      6. Sokmak içine bir metanol donma kırık slaytlar-Coplin cam-20 ° C'de 5 min için dolu O zaman transferi için bir aseton-Coplin cam -20, başka bir 5 min için dolu ° C.
        Not: Metanol ve aseton kullanmadan önce en az 30 dk-20 ° C'de muhafaza edilmelidir. Fiksasyon sonra -20 slaytlar depolanabilir ° C. dikkat: metanol ve aseton toksik.
      7. Kavanozdan slaytlar kaldırmak ve onları kullanmadan önce (RT) oda sıcaklığında kurutma.
    2. Staining
      1. Surround vazelin slayt üzerinde ince bir tabaka ile sabit Worms alanı. Spot işaretlemek için slayt alt Bu alan bir daire çizin.
        Not: Bu jöle daire boyama çözümleri kaçağı önlemek için boyama prosedürü bozulmadan kalır önemlidir.
      2. Hazırlama bir " ıslak odası " yerleştirerek Kapaklı plastik bir depo gözünde içine kağıt havlu ıslak. Slayt bir raf üzerine burayı " ıslak odası " boyama sırasında slaytlar kurutma önlemek için.
        Not: Su ile temas halinde veya birbirleri ile slaytlar olmamalı.
      3. Yavaşça yaklaşık 50 µL 1 x PBS alanı kapsayacak şekilde jöle çember içine, yeterince pipet. Yakın " ıslak odası " kapak ile. RT 5 dk. için kuluçkaya
        Not: Bu adım, solucanlar kaybetmemek için PBS doğrudan solucanlar pipet değil. Yavaşça çemberin kenarında pipet ucu yerleştirin ve sorunsuz solucanlar üzerinde dağıtmak için sıvı sağlar.
      4. Slayt eğilme ve yavaş yavaş bir pipet ile PBS Aspire edin. Slayt geri düz raf üzerine yerleştirin ve 50 µL (veya spot karşılamak için gerekli miktar) eklemek Çözüm engelleme dikkatle. Bu 15 dakika RT, ıslak odasında kuluçkaya. Beklerken, seyreltik çözüm kapatmaktır birincil antikorlar (Malzemeler tablo birincil antikorlar ve konsantrasyonları örnekleri için bkz:).
        Not: Taze engelleme çözüm 1 x PBS (10 mL), % 10 ara (50 µL) ve süt tozu (0.2 g) kullanarak hazırlayın. Deterjan ve konsantrasyonu süt miktarı kullanılan antikor bağlı olarak değişebilir ve ampirik olarak belirlenecek gerekebilir. Slayt sıvı aspirasyon kolayca solucanlar kaybedecek başka bir adımdır. Diseksiyon kapsamı altında slayt inceleyerek ilerleme kontrol ama Slayt kurumasına olduğunu dikkat.
      5. Slayt eğilme ve uzak yukarıda açıklandığı gibi aynı önlemler kullanarak engelleme çözüm Aspire edin. Slayt geri düz raf üzerine yerleştirin ve yavaş yavaş alacağınız önlemleri kullanarak 50 µL seyreltilmiş birincil antikor, ekleyin. Yakın " ıslak odası " ve 4 ° C'de gecede veya dik, kısa dönemler için kuluçkaya
        Not: Kuluçka süresi için spesifik bir antikor ampirik olarak belirlenecek gerekebilir.
      6. Aspiratı birincil antikor çözüm olarak diğer çözümleri için kapalı. Sonra 10 dk için engelleme çözüm ile slaytlar ekleme ve yukarıda açıklandığı gibi aynı şekilde çözüm kaldırma 3 kez yıkayın.
      7. Ekle ikincil (fluorescently etiketli) antikor engelleme çözümde seyreltilmiş kuluçkaya RT 1 h için. Malzemeler tablo ikincil antikorlar ve konsantrasyonları örnekleri için bkz:.
      8. Çıkarmak belgili tanımlık ikincil antikor ve yıkama, yukarıdaki gibi çözüm 2 kez engelleme ile ve açık uzakta engelleme Çözümle 10 min için 1 x PBS için.
      9. Uzağa kadar PBS mümkün olduğunca kurumasına ve jöle numune çevresinde dikkatli bir şekilde çıkarın için numune izin olmadan Aspire edin.
      10. Bir damla montaj orta örnek eklemek ve bir coverslip yavaşça üstüne yerleştirin. Coverslip tırnak cilası ile kenarlarını kapatın. Boyama korumak ve 4'te depolamak için bir karanlık slayt kutusunda slaytlar yer ° C.
        Not: Devam slaytlar karanlıkta ışık hassasiyeti nedeniyle (floresan zamanla fade) ve onları, aynı sebepten dolayı kapalı tutarak hava etkilenmemek. Slaytlar için uzun bir süre 4 ° C veya -20 saklanan ° C.

2. Temel tubulogenesis genler C. elegans bağırsak fonksiyonu ile müdahale. Örnek: RNAi.

Not: C. elegans suşları NGM plakaları göre standart protokolleri 29 numaralı seribaşı OP50 bakteri kültürlü. RNAi için HT115 RNAi bakteri RNAi plakaları ile 25 µg/mL carbenicillin ve 2 mM IPTG (izopropil beta-D-1-thiogalactopyranoside) üretir bakteriyel düzenleyicinin indüksiyon için takıma C. elegans beslenirler Çift RNA (dsRNA) tanıtılan mahsur C. elegans gen. Antibiyotik ve IPTG konsantrasyon RNAi klon/Kütüphane ve istenen RNAi gücü, solunum belirli klonlar piyasada bulunan genom çapında RNAi kitaplıkları (bkz: ( 26 , besleme elde edilebilir RNAi göre değişiklik gösterebilir 30 , 31) için geçmiş RNAi C. elegans ve Tablo malzemeleri malzemeler/reaktifler ve RNAi kitaplıklar için besleme üstünde).

  1. Besleme tarafından standart RNAi 26 , 31
    1. -80 ° C RNAi Kütüphane plaka çıkar ve kuru buza koy. Sızdırmazlık bandı çıkarın ve steril pipet ucu 100 µg/mL Ampisilin ve 15 µg/mL tetrasiklin LB (Luria suyu) Ağar kaplamalar 29 klonu ilgi yapisan bakteri aktarmak için kullanın. Çizgi bakteri agar plaka üzerine dışarı. RNAi Kütüphane plaka yeni sızdırmazlık bandı ile kapatın. Bakteri 37 at gecede büyümek ° C.
      Not: Bu Ağar kaplamalar birkaç hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Yeni bakteri-ebilmek var olmak doğrudan onları orijinal RNAi Kütüphane korumak için kültürlü.
    2. Ertesi gün, RNAi bakteri LB agar plaka 1 mL 50 µg/mL Ampisilin içeren LB sıvı orta 29 aşılamak ve (8-18) h 14 için sallamak veya bir gece 37 ° c
      Not: en iyi sonuçlar için her zaman taze bakteri kullanın. Bkz: farklı kültür koşulları (örneğin zamanlama kültür) karşılaştırılması için referans ( 30).
    3. Sonraki gün, tohum 200 µL klon ayrı RNAi plakaları kültürlü RNAi bakterilerin başına. Tabakları kuru ve RT gece bakteriyel organizatörü indüksiyon için bırakın izin.
    4. 4-6 L4-sahne larva her RNAi plaka üzerine aktarın. RT veya 22 ° C numaralı seribaşı RNAi plakaları 3-5 gün kuluçkaya.
      Not: L4 larvalar önce RNAi ile müdahale veya seri olarak onları yeni bir NGM plaka OP50 olmadan üç kez transfer yapışık OP50 kaldırmak için bakteri olmadan bir NGM plaka üzerine seçin. Bulaşıcı bakteri - kurt için-tercih edilen OP50 gıda gibi aynı zamanda RNAi ile engel olarak suşları kontamine değil, emin olun. Sıcaklık gerektiği şekilde ayarlayın: örneğin geliştirme hızlandırır yüksek sıcaklık ile; suşları sıcaklık duyarlı olabilir.
    5. Gelişim çalışmaları için 2 günden itibaren gelen F1 döl fenotipleri denetleyin.
      Not: Bu hayvanlar bir fenotip (örneğin marker deplasman) ilerlemesini veya görünümünü ne zaman eksik için sık sık kontrol etmek önemlidir polarize membran Biyogenez geliştirme sırasında değerlendirilmesi. Hafif-güçlü bir spektrum beri zenginleştirme güçlü fenotipleri (en güçlü onların döl orta bölümünü etkilenen seçmek için 2 günde bir yeni RNAi plakasına üst hünsa seçerek örneğin) için F2 nüfusunun nadiren gerekli olur fenotipleri arzu.
  2. Koşullu RNAi
    Not: şiddetli azaltmak veya hafif etkilere artışı veya sahne-özellikle girişimine RNAi koşulları değiştirilebilir; değişiklikler fenotipik etkileri tam değerlendirme için yararlı kez ölümcül tubulogenesis genler.
    1. Larva RNAi - RNAi değerlendirilmesi (hafif, sahne-özel RNAi) aynı nesilde etkileri
      Not: kısırlık veya embriyonik ölümcül üstesinden gelmek için veya gen fonksiyon için belirli sahne sonrası embriyo bozmaya, RNAi içinde indüklenen larvalar, posta embryonically. Tedavi edilmemiş yumurta (2.2.1.1), gravid yetişkin (2.2.1.2) yerleştirin veya L1 senkronize (veya, isterseniz daha sonra sahne) larva (2.2.1.3) RNAi plakaları; RNAi etkileri aynı nesilde, örneğin iki gün sonra ve ileriye doğru larva ve/veya yetişkin değerlendirin. RNAi plaka kenarına yerleştirilen Çözüm beyazlatma (1: 4 ve bir çözüm 10 M NaOH ev sodyum hipoklorit)
      1. Çekme 30-50 gravid yetişkin içine bir damla. Kuru ve L1s yumurtadan ve bakteriyel çim taşımak izin izin.
        Not: genellikle dekontaminasyon için kullanılan bir çözüm, ağartma embriyo yumurta kabuklarından dışında her şeyi öldürür. Bu nedenle, beyazlatma çözüm üzerine ya da yakınına RNAi bakteri koymayın.
      2. Almak veya ~ 20 genç gravid yetişkin RNAi plaka ve onları yatıyordu yumurta 2-3 h için tohum veya plaka üzerinde yaklaşık 300 yumurta kadar yetişkin seçin.
        Not: Bu yöntem OP50 RNAi bakterilerin bulaşma neden olabilir. Bu riski azaltmak için ilk yetişkin bakteri olmadan NGM plaka üzerine OP50 yapışık solucanlar için kaldırmak için transfer. Yetişkin embriyo üzerinde RNAi etkisi önlemek için RNAi Tabaklarda çok uzun kalmayın dikkat.
      3. Almak veya doğrudan RNAi Tabaklarda L1 sahne solucanlar yerleştirin (bkz: başvurusu ( 29)-eşitleme iletişim kuralları için).
        Not: Bir tek yumurta kalıncaya kadar solucanlar için M9 ile yoğun nüfuslu plakalar üzerinden birkaç kez yıkayarak bir kısaltılmış eşitleme Protokolü (örneğin bir orta büyük ölçekli kurulumu için) kullanabilirsiniz. 2-3 h L1s yumurtadan sonra M9 içinde bu plakalar toplanabilir bakteri M9 (3 x) kaldırmak için ek yıkama tarafından temizlenir sonra RNAi plakalar numaralı seribaşı.
    2. Boş vektör RNAi bakteri (hafif RNAi) ile seyreltme RNAi bakteri
      Not: RNAi bakteri miktarı sulandrarak tarafından dsRNA miktarında azalma daha hafif etkileri ikna etmek için yeterli ve ayrıca embriyonik ölümcül azaltabilir Tüm embriyonik etkileri olmadan kaldırılması. Seyreltme RNAi bakterilerin de Çift Kişilik RNAi deneyler için ve koşullar genetik etkileşim deneyler (geliştirme değerlendirilmesi için hafif etkilere ve bastırma değerlendirilmesi için güçlü efektleri oluşturmak için örneğin) için titre için kullanılır.
      1. Grow up RNAi ve emPty vektör ile 50 µg/mL Ampisilin, 1 mL LB orta HT115 RNAi bakteri için standart RNAi koşulları gibi.
      2. Farklı konsantrasyonları, örneğin, %5, %15, % 30, % 50, % 70 bir aralığı elde etmek için boş vektör RNAi bakteri RNAi bakterilerle sulandırmak. Bakteri de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. 200 µL bakteri bir RNAi plaka üzerine karışık pipet.
      3. 4-6 L4 larva her RNAi tabağa alın. Fenotip günün 2 itibaren kontrol.
    3. RNAi hassas suşları (güçlü RNAi)
      1. kullanılabilir RNAi duyarlı suşları, örnek, eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) veya eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (ikinci supersensitive) kullanın ve izleyin 2.1 31 , 32 , 33 olarak açıklanan standart RNAi yordamları.
        Not: RNAi hassas suşları (rrf-3 örneğin ve eri-1) vahşi-türü hayvanların daha düşük damızlık boyutları ve olabilir 25 ° C'de steril Onlar da kendi fenotipleri düşük bir arka plan olabilir, örneğin belirli RNAi etkileri değerlendirilirken dikkate alınacak olan penetrant embriyonik ölümcül düşük.

3. Vivo görüntüleme C. elegans bağırsak Floresans mikroskobu dissekan tarafından

  1. hayvanlar floresan ışığı altında görselleştirme önce RNAi plakaları üzerinde herhangi bir diseksiyon mikroskop parlak ışık altında kontrol edin. Değerlendirmek (ve potansiyel olarak kayıt) fenotipleri analizi, ölümcül, kısırlık (döl daha düşük sayısı), gibi etkileyebilir parlak ışık altında görünür gelişimsel (örneğin larva tutuklama) ve yardımcı olabilecek diğer görünür fenotipleri bir gen polarize membran Biyogenez ve Lümen morfogenez ilgili işlev karakterize.
    Not: Bu değerlendirme (en az 50) için yeterli döl, aksi takdirde alternatif RNAi koşulları deneyin tek skor tabaklar. Kantitatif değerlendirilmesi için tabak değil kontamine emin olun ya da (yani RNAi ile müdahale) OP50 çıkarır.
    2. Hayvanlar floresan ışığı altında görselleştirmek için
  2. kapağı çıkarın ve parçalara floresan mikroskop altında doğrudan RNAi plaka yerleştirin.
    Not: ince bağırsak fenotipleri algılamak için bir diseksiyon mikroskop büyütme yeterli bir aralığı sağlar daha yüksek bir güç stereo Floresans eki olan gerekir. Bu iletişim kuralı bir 1,5 ve amaç ve 3,5 odak uzaklık 45 x 10 bir kapsamla açıklar.
  3. İlk olarak hayvanlar için odak parlak ışık altında bulabilirsiniz. Sonra hayvanlar (örneğin 1.5 x amaç altında), düşük büyütmede Floresan ışık altında inceleyin uygun filtre kullanarak. Üst soldan sistematik olarak plakasına fenotipleri için tüm plaka taramak için sağ alt inceleyin.
  4. Hayvan ilgi seçin ve 10 x amaç için değiştirin. Bağırsak üzerinde odaklanmak ve tubulogenesis/Lümen morfogenez fenotip değerlendirmek için zoom özelliğini kullanın. Fenotipleri puanlama için 5 bölümüne bakın. İlk olarak, düşük büyütme oranında görüntüleri alır. Sonra geçiş için yüksek büyütme.
    Not: sağlıklı hayvanlar hızlı hareket olduğundan, hızla, bir yandan Öte yandan mikroskopla odaklanan sırasında resim alma için bilgisayar fare ile çalışırlar. Tubulogenesis fenotipleri çoğunlukla çalışma embriyo ve erken larva tutukladığında hayvanlar (örneğin 4 ° c plakaların geçici yerleşim tarafından) yavaşlama gerekli olmayabilir. Görüntüleri bir mikroskop monte CCD kamera tarafından çekilen ve resim yakalama yazılımı.

4. C. elegans bağırsak daha yüksek çözünürlükte görüntüleme confocal mikroskobu 34 , 35 tarama lazerle

  1. montaj ve immobilizasyon
    1. kullanımı ince yağ veya vazelin bir daire içinde az miktarda bir cam slayt (mm içinde çap ~ 6-8) üzerinde yaymak için parmak ucu.
      Not: Yağ daire kalınlığı montaj için önemlidir. En iyi sonuçları görüntüleme, bir defada yalnızca bir veya birkaç larva görüntü ve hayvan doğrudan cam slayt ve kapak kayma arasında sıkışmış şekilde bir ultrathin yağ daireyle mümkün olduğunca küçük sıvı olarak kullanmak (mükemmel yapılırsa, hayvan olmadan immobilize Anestezi). Yumurta ve büyük hayvanların montaj kapak notu ekleme örnek imha önlemek için biraz daha kalın bir daire gerektirir.
    2. Çemberin ortasına genellikle 3,5 µL 10 mM sodyum azid çözüm bir damla ekleyin ve içine o solucanlar diseksiyon mikroskop altında seçin.
      Not: Bir 1 M sodyum azid hisse senedi çözüm 65.01 mg NaN3 1 ml dH 2 O çözülerek hazırlamak; Bu 1 M çözümün 200 µL 20 mL M9 arabellek ekleyin. Solucanlar hızlı kurumasına çözüm önlemek için sodyum azid çözüm damla içine almak. Yaklaşık 20 larva ve slayt başına yaklaşık 50 embriyolar daha büyük nüfus incelerken yönelik ayrı ayrı en uygun montaj aşamaları seç. Bir sodyum azid çözüm yerine embriyo seçilmesinde M9 kullanabilirsiniz. Sodyum azid kullanılıyorsa, bu toksik kimyasal doku hasarı önlemek için 30 dk içinde hayvanlar yansıması gerekir.
      Dikkat: sodyum azid zehirlidir.
    3. Yavaşça slayt üzerinde 22 mm × 22 mm coverslip yerleştirin. Solucanlar ezmek değil dikkatli olun. Hafif bir basınç uygulayın ve altında diseksiyon mikroskop solucanlar sabit de slayt ve kapak notu arasında emin olmak için kontrol edin. Slayt etiket.
      Not: Basınç doğru miktarda numune (çok fazla baskı) zarar ve de tamir değil önlemek için önemlidir (çok az basınç: hayvanlar float için slayt yapışmasını yerine). Yüzen hayvanlar aslında uygun görüntüleme engel.
  2. Görüntü
    1. yer slayt confocal mikroskop altında. Arama için 10 x amaç ve odak Kurtlarla.
      Not: odak parlak ışığa photobleaching önlemek mümkünse kullanın.
    2. Değişiklik 60 x veya 100 x için objektif ve bağırsak odaklanmak.
      Not: Bağırsak kolayca parlak ışık altında onun Lümen hayvandan yutak anüs kuyruk ucuna yakın orta aracılığıyla çalışan tarafından belirlenebilir. Petrol 60 x veya 100 x petrol amaç için uygularken dikkatli olun. Farklı yağlar türleri karıştırma daha fazla Imaging ile girişime neden olabilir. Yer küçük damla yağı bir dik mikroskobu kullanırken bir slayda veya diğer hedefleri veya mikroskop parçalarını kirletmek değil dikkat çekici bir ters kapsam kullanırken amaç üzerine.
    3. Kurmak Kohler DIC/Nomarski aydınlatma 36 taramak için kullanılmak üzere amaç için. Hayvan uygun kanal bağırsak etiketleme kontrol ve/veya görüntüleme için uygun örnek seçmek için fenotip, kontrol ile Floresan ışık altında inceleyin. İş hızla ağartma önlemek için.
      4. Sınırları onun dorsal ve ventral tarafta tarama ayarlayarak bağırsak için potansiyel görüntü kısıtlamak için tarama lazer için anahtar
    4. .
      Not: Eğer fluorophore da bağırsak yapıları Etiketler bağırsak bu şekilde poz tarama önemlidir. Av için hızlı tarama koşulları bu pilot tarama sırasında çalışmakOID photobleaching.
    5. Deney için tarama parametreleri seçmek için taramayı durdur. Soruşturma, hayvan ve/veya teknik konuları aşamasına bağlı olarak 0.2 µm aralıklarla 6-20 bölümleri bağırsak z ekseni boyunca tarama, örneğin için ayarlayın. Çerçeve resim etiketleme karmaşıklığına bağlı olarak başına ortalama ayarla ve gerekli gürültüyü azaltmak için çözünürlük.
      Not: Ayar ayrıntıları mikroskop bağlı olarak değişir ve deneme. Bir sıralı üç farklı fluorophores tarama gerçekleştirmek eğer beyazlatma önlemek için bölümleri azaltmak gerekebilir. Çerçeveler (olmalıdır görüntü bozulmalarını önlemek için bölümleri sayısından daha düşük; Ayrıca photobleaching artış tartmak) bölüm sayısı'sayısını ayarlayın. 4-6 çerçeveleri genellikle yeterlidir.
    6. Kesin (yavaş) lazer koşullar tarama tarama için geri dönün ve ayarlayın: Parlaklık (arka plan azaltmak için kullanmak en az kazanç); lazer güç (yüksek olarak gerekli, gibi düşük mümkün - artar photobleaching; genellikle en az ayardır yeterli); iğne deliği (açılış önlemek yoksa, çözünürlük sağlamak için gereken).
      Not: koşullar tarama ve numune üzerinde bağlı tarama oturumun başlangıcında ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Parlaklık (yetenek görüntü daha sonra disk görüntüsü oluşturma yazılımı değiştirmek için sınırlar) doygunluk geçmediği emin olun. Koşullar tarama ayarlandığında, ayrıca aynı koşullar deneysel hayvan kontrolleri ile karşılaştırmak deneylerde tüm görüntüleme için kullanılması gerekir karar.
    7. Yakalama görüntü serisi. Bir tek projeksiyon görüntü içine görüntüleri birleştirme.
      Not: projeksiyon görüntüleri ve/veya bindirmeleri mikroskop bağlı olarak ayrı ayrı kaydetmek gerekebilir.
      8. Taşma payı üzerinden kanal (eş yerelleştirme çalışmaları için kritik) arasındaki önlemek için sıralı tarama kullanın çok kanallı görüntüleri çekerken
    8. .
      Not: Görüntü ayarları artık bağlı artan photobleaching göz önüne alındığında değiştirilmesi gerekebilir zaman scanning.
    9. Her zaman kazanmak için simge ve taranan hayvan morfolojisi genel durumunu karşılık gelen DIC/Nomarski görüntüleri (bölümler).

5. C. elegans bağırsak quantification polarize membran dipnotlar kusurları

Not: örnek: demiri deplasman apikal ERM-1::GFP ve Ektopik yanal Lümen oluşumu let-767 tarafından indüklenen ve APS-1 RNAi.

    1. Puanlama için tanımla kategoriler ( şekil 5 A, D, E) diseksiyon mikroskop altında fenotipleri puanlama. Örnek: (i) vahşi-türü (WT), (ii) demiri deplasman (geliştirir demiri deplasman sonraki) ERM-1::GFP (polarite kusur) ve (III) Ektopik Lümen oluşumu.
      Not: Düşük büyütme görsel analiz numaraları veya belirli bir fenotip olmadan hayvanların puanlama için oldukça rahat. Burada, bir analiz edilir polarite fenotip kötüleşmesine, aynı saat göstergesi üç farklı fenotipik kategorilerde örneği seçilmiş. Ancak, farklı nitel ve nicel fenotipleri çeşitli, lumen morfogenez kusurları, devamsızlık/varlığı (veya numaraları) GFP olumlu sitoplazmik çarpıtmanın, Lümen çapı ve boyutu veya numaralarını intralumenal kistleri gibi toplam (bkz < güçlü sınıfı "xfig" = > şekil 3 örnekler için).
    2. Bağlı beklenen farklılıklar, büyüklüğü üzerinde Puan edinildi yaklaşık 100 canlı solucanlar diseksiyon mikroskop altında onların agar plakaları üzerinde deneyler yinelenen veya onaylatılacak kümesindeki.
      Not: Bir görünüme plakaları sistematik olarak, tarama yaparken örneğin plaka alt sağa üst soldan geliyor her hayvan Puan gerekir (solucanlar eşit plakaları doldurulan emin olun).
    3. Deneyleri 3 bağımsız kümeleri için bu işlemi yineleyin. Çubuk grafik oluşturmak ve sonuçları önemini değerlendirmek.
  2. Puanlama fenotipleri ( şekil 5 B) confocal mikroskop altında
    1. puanlama, örneğin hayvan başına Ektopik Lümen sayısı için kategori tanımlamak
      Not: yüksek büyütme görsel analiz ölçülebilir marker veya hayvan başına fenotip puanlama için oldukça rahat ve mikroskopi dissekan tarafından fark edilebilir olmayabilir hücre altı işaretlerinin puanlama sağlar. Solucanlar daha önce mikroskobu (5.1.1, Kategori 3) anatomi tarafından değerlendirilen aynı deneme alt kümesinde hayvan başına Ektopik Lümen sayma mevcut örnek burada muayene kötüleşen polarite fenotip değerlendirilmesi iyileştirir. Ancak, çeşitli diğer fenotipleri veya parametreleri attı, örneğin veziküller, varlığı/devamsızlık veya çok sayıda hücre altı bileşeni Yerelleştir, floresan yoğunluğu ortak sayısı (ikinci ImageJ tarafından sayılabilir; kağıt üzerinde eşlik eden bakın boşaltım kanalı) 2.
    2. Fenotipik işaret beklenen farklılıklar büyüklüğü bağlı olarak ölçmek (burada, Ektopik lümen) yinelenen veya onaylatılacak birtakım deneyler confocal mikroskop altında yaklaşık 20 hayvanlarda.
    3. Deney tekrar 3 bağımsız için ayarlar. Çubuk grafikler oluşturmak ve sonuçları önemini değerlendirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu iletişim kuralı, tatlı analiz ve polarize membran Biyogenez ve Lümen morfogenez C. elegans bağırsakta tek hücre ve hücre altı düzeyde görselleştirmek açıklar. Yirmi-hücre tek katmanlı C. elegans bağırsak yönlendirilmiş hücre bölünmesi ve geçiş sırasında orta embriyo tarafından oluşturulur. Etki alanları kurulan haline bu zaman, polarize membran, yine de novo , polarize membran Biyogenez olgun içinde devam eder ancak epitel dört larva aşamaları boyunca yetişkinliğe kadar genişleyen, analiz odaklanmak için izin polarize membran dipnotlar (şekil 1A).

C. elegans hücresel ve hücre altı bileşenleri görselleştirmek için iki strateji yaygın olarak kullanılır: ayirt (ayrıntılı bu protokol için Bölüm 1; Resim 2 , Şekil 4 d -F) ve floresan füzyon protein (eşlik eden kağıt boşaltım kanalı polarize membran Biyogenez2üzerinde; ayrıntılı ifade Şekil 1B, Şekil 2, şekil 4, şekil 5C). Çift ve birden fazla etiketleme, yöntemlerden her veya her iki farklı Etiketler birleştirerek çözmek membran asimetriler gibi apikal ve demiri membran etki alanları ve farklı hücre altı bileşenleri (Şekil 2, birbirleriyle ilişkisi Şekil 4 d-E). Membran-sitoiskeleti bağlayıcı ERM-1::GFP gösterilen burada Lümen morfogenez içinde bu tek katlı epitel ile çakışacak apikal membran dipnotlar bir göstergesi olarak. Bu işaretleyici kullanarak, bağırsak apikal membran/Lümen Biyogenez kusurları ve onların sorumlu gen hataları bir dizi işlev kaybı çalışmaları tarafından örneğin RNAi kullanarak tarafsız genom geniş ekranlar tarafından belirlenebilir (RNAi yaklaşımları kabul için Böyle fenotipleri nesil bu protokolün 2 bölümünde açıklanmıştır). Şekil 3 ve şekil 4 apikal membran/Lümen düşük orta büyütme görüntülerin Biyogenez fenotipleri yüksek güç amacı ile donatılmış diseksiyon floresan mikroskop tarafından alınan örnekler; ve daha yüksek büyütme oranını confocal lazer tarafından alınan görüntüleri (mikroskobik bu yaklaşımlar 3 ve 4 bölümlerde açıklanmıştır) mikroskobu tarama. Polarize membran Biyogenez kusurları, RNAi etkileri (steroid dehidrogenaz/3-ketoasil-CoA redüktaz kodlama) let-767 ile miktarının örnek olarak ve aps-1 (kodlama clathrin AP-1 sigma altünitesi adaptör) ERM-1::GFP Yerelleştirme ve Lümen konumlandırma şekil 5' te gösterilen.

Figure 1
Şekil 1 : Hücre ve hücre altı yapısı ve morfogenetik vahşi türü C. elegans bağırsak. (A) C. elegans bağırsak geliştirme, hücresel kompozisyon ve endo - ve plazma membran şematik. C. elegans bağırsak clonally 8 hücreli aşamada d. E blastomere oluşturulur. Hücre bölünmesi dört tur sonra onun 16 (E16 sahne) formu15radially simetrik iki katına katlı epitel hücreleri. Bu aşamada, her hücrenin sitoplazma polarizes, tam tersi doğru hareket gelecekteki apikal ve sitoplazmik bileşenleri taşıma çekirdeği ile (gelecek Bazal), membran etki alanları. Bir enterkalasyon adımda sol ve sağ ventral hücreler (paralel olarak) dorsal hücre katmanı bilateral simetrik tüp 9 INT halkaları oluşturmak için geçiş yapar. Her hücre yüzleri ve apikal/lumenal, membran ile Lümen oluşturur (yeşil; yapısal olarak ayırt edici belirli membran microdomains, microvilli tarafından) ve hücreleri veya vücut boşluğu ile onun demiri membranlar (mavi), ilki dışında komşu kişiler Dört hücreleri tarafından kurulan INT yüzüğü. Apikal kavşak (kırmızı) apikal ve demiri membran etki alanlarına ayırın. Enterkalasyon sonra de novo membran Biyogenez bağırsak yetişkinlik, büyüme sırasında geç embriyo ve dört larva evreleri ile birlikte sadece minimum daha fazla büyüme (polarize membran bakım aşaması oluştuğu devam ediyor ). Büyütülmüş tek hücre çekirdeği (N) ve endosomal veziküller yukarıda ER ve Golgi endomembrane sistemini gösterir. (B) DIC/Nomarski ve confocal örtüşme Filmler apikal membran-sitoiskeleti işaretçisiyle ERM-1::GFP etiketli gelişmekte olan C. elegans bağırsak. Beyaz bir çizgiyle bağırsak virgülle aşamada özetlenen (ERM-1::GFP zaten hafifçe enterkalasyon başında apikal membran ifade edilir ancak bu görüntüde takdir). Hayvanlar aşağı burada ve misin gösterilen anterior (kafası) sol, arka (kuyruk) değil, sırt yukarıya, ventral. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Çift ve Üç Kişilik geliştirme wild-türü etiketleme örnekleri C. elegans antikorlar ve füzyon protein kullanarak bağırsak. (a, B) Embriyo. (A)virgülle sahne. PAR-6::GFP (yeşil; apikal PAR polarite karmaşık bileşenidir), Sub-par-3 antikor (kırmızı/TRITC (tetramethyl rodamine isothiocyanate); başka bir bileşeni apikal PAR polarite karmaşık olan) ve MH33 (mavi/Cy5 (Cyanine5); anti-IFB-2/Orta filaman). PAR-6::GFP ve PAR-3 antikor (bracketed) C. elegans bağırsak apikal membran etiketleyin. IFB-2, başka bir apikal daha sonraki aşamalarında belirtecidir bu erken aşamada lokalize panmembraneously. Ayrıca etiket (sol); farenks PAR-6::GFP ve sub-par-3 bağırsak tüp mavi anti-IFB-2 tarafından (sağ) ana hatlarıyla ve intestinal Lümen onların örtüşme IFB-2 (Turkuaz) ile belirtilir. (B) logosuna 2 kat sahne. AJM-1::GFP (yeşil; kavşak bileşen), ICB4 antikor (kırmızı/Alexa, ICB4 bilinmeyen membraneous bağırsak antijeni algılar). AJM-1::GFP etiketleri apikal kavşak C. elegans bağırsak, peri lumenal merdiven desen olarak görünür (Ayrıca hypodermal kavşaklar Etiketler; görünmez beri görüntü bağırsak üzerinde odaklanmıştır; bkz: 4, confocal görüntüleme). ICB4 C. elegans bağırsak tüm membranlar lekeleri. Oklar demiri membranların anti-ICB4 tarafından lekeli üzerine gelin. (C, D) L2 larvaları. (C) LET-413::GFP (yeşil), phalloidin (kırmızı/Texas-kırmızı, F-aktin için bağlayıcı bir phallotoxin) ve MH33 (mavi/Cyanine5, anti-IFB-2). LET-413/karalama Bazal polarite karmaşık bir bileşenidir ve demiri membranlar (bracketed) C. elegans bağırsak için yerelleştirir. Phalloidin ve IFB-2 antikor apikal submembraneous sitoiskeleti C. elegans bağırsak (mor) etiketleyin. Phalloidin da güçlü beden duvarı kasları, bağırsak boyama ezici lekeleri. İç metin kutulu alanının yüksek büyütme gösterir. (E) L3 larva. SLCF-1::GFP (yeşil; ayrılmaz MehmRane bileşen/şeker taşıyıcı), ERM-1::mCherry (kırmızı) ve MH27 antikor (mavi/Cyanine5, anti-AJM-1). ERM-1::mCherry (bracketed); C. elegans bağırsak apikal membran etiketleri ise SLCF-1::GFP demiri membran etiketleri AJM-1, apikal kavşak Etiketler. (F-F''') L2 larva. (F, F') Tek renkli görüntüler. SLCF-1::GFP (yeşil) demiri membran (yanal membranlar ince beyaz oklarla gösterilen) Etiketler. MH27 (mavi/Cyanine5) etiketleri apikal kavşak (kısa sarı oklar). (F''F''') Görüntüleri ile ve aktin olmadan yerleşimi. İnsets kutulu alanların daha yüksek büyütme göster. Not açık ayrım apicolateral açının bağırsak hücreleri tarafından yüzeysel tek renkli resimleri (F, F') benzer görünür bu farklı membran/Kavşağı işaretleri. Fkalın beyaz okları'''tarafından phalloidin (aksi takdirde kas aktin tarafından bunalmış) etiketli apikal/lumenal aktin sitoiskeleti üzerine gelin. Tüm resimler confocal projeksiyonlar (z-yığınları 0.2 µm), taşma payı ile kanallar arasında önlemek için sıralı tarayarak satın vardır. Ölçek çubukları (için A-E, F-F'' ' ve tüm insets): 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Örnekleri C. elegans bağırsak polarize membran ve Lümen morfogenez kusurları düşük orta büyütme (floresan Filmler anatomi). Tüm görüntüleri bir ısmarlama yüksek güçlü stereo Floresans eki (Malzemeler tablo) ile donatılmış diseksiyon floresan mikroskop tarafından alındı. Farklı büyüklüklerde gösterilir. Tüm fenotipleri RNAi tarafından farklı genler ERM-1::GFP (bağırsak ve boşaltım kanalı apikal/lumenal membranlar burada gösterilen embriyonik ve erken larva aşamasında, yerelleştirilmiş) etiketlenmiş bir yük ile elde edilmiştir. İntestinal Lümen ve polarite fenotipleri vardır: (A, B) vahşi türü embriyo(a)ve larva (B); ERM-1::GFP (C, D) demiri deplasman; bağırsak hücreleri genişlemiş ve davul gibi şişmiş görünür bu embriyo içinde (C, ok bağlantısı için tek bağırsak hücreleri), ama vahşi-türü boyut ve düzenlemede bu larvaların (D, INT II ve III arasında yanal membranlar noktalarına ok); (E) genişledi ve üç embriyo Lümen kıvrık; (F) ERM-1::GFP yanal birleşim alanı (zikzak lümen) ve GFP negatif boşluklar (oklar); içerir bağırsak sitoplazma içine genişletti (G) lumenal kistleri inbetween intralumenal yapışıklıklar (iki kistler okları gelin). (H) Cytoplasmic ve demiri ERM-1::GFP öteleme ile Ektopik Lümen (oklar); GFP pozitif puncta (oklar) sitoplazmada için deplasman (ben) ERM-1::GFP. Boşaltım kanallar ve boşaltım kanalı fenotipleri burada açıklanmıştır değil (kanal tüm görüntüleri sağa sola, bağırsak gösterilir). Ölçek çubukları: 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Örnekleri Polarize C. elegans bağırsak zarı ve Lümen morfogenez kusur daha yüksek büyütmede (confocal resim). (A, C, E, G, ı, K) Embriyo. (B, D, F, H, J, L) Larvaları. Tüm fenotipleri RNAi tarafından farklı genler ERM-1::GFP (yeşil tüm görüntülerde) etiketlenmiş bir yük ile elde edilmiştir. Görüntüleme bağırsak üzerinde odaklanmıştır. Embriyo görüntülerini de (sol tarafında görüntü) boşaltım kanallar, kanal fenotipleri (tarif) dahil olmak üzere gösterir. (A, B) Vahşi türü embriyo(a)ve (B) larva. (C) demiri deplasman apikal ERM-1::GFP (Virgülle sahne; geç enterkalasyon). (D) polarite dönüşüm: demiri deplasman apikal ERM-1::GFP ve apikal demiri ICB4, çift etiketleme tarafından ortaya birikimi. F-aktin (phalloidin-TRITC tarafından etiketli) boyuna kas demetleri (etiketli üçlü bir hayvandır) Boyama hayvanlar özetliyor. (E) ERM-1::GFP demiri deplasman geç 3 kat embriyo içinde. Apikal IFB-2 antikor (mavi/Cyanine5) sağlam Lümen ve peri lumenal ara filamentler gösterir. (F) Ektopik Lümen Anti-IFB-2 tarafından (mavi/Cyanine5) etiketli. (G) ERM-1::GFP negatif çarpıtmalardan bağırsak sitoplazma içinde. (H) ERM-1::GFP olumlu çarpıtmalardan bağırsak sitoplazma içinde. (I, J) Lümen embriyo ve larva, yokluğu anılan sıraya göre. (K) geniş gut. (L) Kistik ve kıvrık gut. (A, D, H, ı, J, K, L) confocal projeksiyonları vardır. (B, C, E, F) confocal bölümler vardır. Parlaklık sitoplazmik GFP negatif çarpıtmalardan vurgulamak için G yükseltilmiştir. Ölçek çubukları: 10 µm (aynı tüm embriyo ve larva, sırasıyla). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Bağırsak polarite dönüşüm ve reversion: bir örnek polarize membran ve Lümen Biyogenez kusurları miktar için. (A, B, C) Let-767ve aps-1RNAi her iki neden ERM-1::GFP demiri deplasman (BL) ve Ektopik Lümen oluşumu (EL), ama farklı gelişim aşamalarında. Mikroskop dissekan tarafından(a)miktar: embriyo (sol) ve larva (sağ) polarite fenotipleri ile solucanlar RNAi plakalar üzerinde tohum sonra 2 gün sayıyor. Not: tüm sahte ve let-767(RNAi) hayvanlar bu zamanda yumurtadan (böylece orada vardı, ancak, tüm vahşi tipi polarite; hiçbir embriyo satır sütunların kırık). APS-1 Let-767RNAi onları larva indükler ise RNAi embriyolar, zaten polarite hataları neden olmaktadır. Ektopik Lümen (vs demiri deplasman) aps-1RNAi embriyo larva karşı daha yüksek Ektopik Lümen ile embriyo tutuklanması nedeniyle yüzdesidir. (B) miktar confocal mikroskobu tarafından: hayvan larva geliştirmede Ektopik Lümen başında başına Ektopik Lümen sayma. Let-767 RNAi larva içinde daha Ektopik Lümen aps-1("değil arres var escapers"aps-1RNAi larvaları vardır RNAi'den neden olmaktadır.«««ted) embriyo. (C) Confocal imge için vahşi tipi larva ve larva ERM-1::GFP demiri deplasman (BL) ve Ektopik Lümen (EL); Ölçek çubuğu: 5µm. (D, E) polarite reversion let-767RNAi hayvanlarda (sayma ve polarite kusur [BL/EL] olmayan hayvanların mikroskop dissekan tarafından). hafif Ektopik Lümen fenotipleri 20 let-767(RNAi) hayvanlarla bir RNAi tabaktan bir OP50 plakasına 4 gün transfer ve 40 saat sonra değerlendirilir. (D) % 50 larva vahşi tipi polarizasyon (apikal membran, ERM-1) için yayıncısıysanız daha. (E) % 20'si hayvanlar büyüyen L1 larva sahne (L1 tutuklamalet-767(RNAi) sonuçlarında) ötesinde. Tüm veriler ortalama SEM, +/-olarak gösterilir n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Örnek olarak işaretler C. elegans larva ve yetişkin bağırsak membran sistemi için1.
Protein adı Hücre altı yerelleştirme Protein yapısı/işlevi Piyasada bulunan C. elegans belirli antikor (DSHB2) Suşları CGC kullanılabilir örnekleri
OPT-2/PEPT-1 apikal transmembran protein chowing ışınlama KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412)::
GFP) + pha-1(+)])
AQP-4 apikal transmembran protein su kanal
ERM-1 apikal brushborder membran-sitoiskeleti bağlayıcı ERM1
ACT-5 apikal brushborder sitoplazmik aktin (3)
IFB-2 apikal brushborder ara filaman bileşen MH33
EPS-8 apikal brushborder Human-Epidermal-growth-Factor-receptor-kinase-substrate-8 ortholog
PAR-6 apikal membran apikal polarite karmaşık bileşen
SLCF-1 demiri transmembran protein monocarboxylate taşıyıcı
AQP-1 demiri transmembran protein su kanal
LET-413 demiri membran Homologue, adaptör ve polarite belirleyici karalamak LET413
HMP-1 apikal Kavşağı (CCC4) Α-catenin, cadherin-catenin karmaşık bileşen FT1609 (unc-119(ed3) III; xnIs528 [hmp-1p::hmp-1::
GFP + unc-119(+)])
HMR-1 apikal Kavşağı (CCC) E-cadherin, cadherin-catenin karmaşık bileşen HMR1
AJM-1 apikal Kavşağı (DAC5) bağlantı bütünlüğü molekül, DLG-1/AJM-1complex bileşen MH27 SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
DLG-1 apikal Kavşağı (DAC) Diskler büyük homologue, MAGUK protein, DLG-1/AJM-1complex bileşen DLG1
RAB-11 endosomal veziküller kaçakçılık6 RT311 (unc-119 (ed3) III; pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
RAB-5 endosomal veziküller ticareti RT327 (unc-119 (ed3) III; pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
RAB-7 endosomal veziküller ticareti RT476 (unc-119 (ed3) III; pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
RAB-10 endosomal veziküller ticareti RT525 (unc-119 (ed3) III; pwIs206 [pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
MANS Golgi Α-mannosidase II RT1315 (unc-119 (ed3) III; pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1 Örnekler üzerinden Table3 içinde listelenen kaynaklar seçilir.
2 Gelişim çalışmaları Hibridoma banka.
3 Omurgalı aktin karşı antikor cross-react.
4 CCC: cadherin-catenin kompleksi; apikal kavşak apikal parçası yerelleştirir; adherens kavşak (AJ) karşılık gelen.
5 DAC: DLG-1/AJM-1complex; apikal kavşak Bazal parçası yerelleştirir; sıkı bağlantı (TJ) karşılık gelen.
6 Ek vezikül ilişkili moleküllerin bağırsaklarda ifade için ref (22) bkz.
Not: tüm molekülleri füzyon protein kendi rehberleri ya da antikor olarak test edilmiştir.
Tablo 2 : Örnekleri C. elegans bağırsak özel Organizatör ve saat ifade1.
Organizatör İfade sahne
ELT-2 ifade 2 E hücre aşamasında başlar ve yetişkinlik devam ediyorsa
vha-6 ifade içinde geç embriyo başlar ve yetişkinlik devam ediyorsa
GES-1 ifade yaklaşık 4E hücre aşamasında başlar ve yetişkinlik devam ediyorsa
son-1 ifade 1E hücre aşamadan sonra başlar ve daha sonra embriyo sırasında azalır
1 Örnek tablo 3'te listelenen kaynaklardan seçilir.
Tablo 3: Kaynakları bulmak için C. elegans bağırsak özgü molekülleri, etiketleme reaktifler/suşları ve antikorlar.
1. Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC)42 kullanılabilir reaktifler ve suşları için
2. Wormbase43 bağırsak özgü molekülleri, soy ve antikorlar hakkında bilgi için
3. Informa
Tion bağırsak özgü molekülleri20,44 hakkında 4. Transgeneome Web sitesi45 translasyonel GFP füzyon yapıları için 5. C. elegans ifade deseni46 transkripsiyon GFP füzyon yapıları için 6. ulusal BioResource Projesi (NBRP)::C.elegans47 bağırsak özel rehberleri hakkında bilgi için 7. gelişimsel çalışmalar Hibridoma banka (DSHB)48 C. elegans karşı antikorlar 8. ikincil antikorlar ve boyalar için bkz: başvuru27,28

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı standart fonksiyon kaybı genetik/RNAi ve C. elegans bağırsak epitel görsel ve moleküler diseksiyon içinde vivo için bir model olarak yararlanmak için (etiketleme ve mikroskobik) yaklaşımlar Imaging birleştirmek açıklar polarize membran ve Lümen Biyogenez.

Etiketleme

Bu iletişim kuralı antikor boyama üzerinde duruluyor. Situ antikorlar tarafından etiketleme floresan füzyon (eşlik eden gazetede boşaltım kanalı membran Biyogenez açıklanan) proteinler2tarafından etiketleme için alternatif bir çok özel yaklaşımdır. Her ne kadar antikor boyama canlı görüntüleme izin vermez, ilgi bir protein lokalizasyonu (Ben de etiketleme olmadan başarısız yöntemdir) onay sağlayabilir. Ayrıca, morfogenez ve/veya bir proteinin hücre altı yerelleştirme ile ilgili sorunlar genellikle sabit hayvanlarda tespit edilebilir. Immunostaining çift ve birden fazla etiketleme için yararlıdır ve bunlar gerekli fiksasyon ve permeabilization işlemleri yoluyla korunabilir Eğer floresan füzyon proteinler tarafından etiketleme ile birleştirilebilir. Burada anahatları belirlenmiş iletişim kuralı genellikle bu (Şekil 2) izin verir. Antikorlar veya kimyasal lekeleri tarafından sabit hayvanların in situ etiketleme de avantajları için superresolution gibi fırtına (Stokastik optik imar mikroskobu) mikroskobik teknikler sağlayabilir. Ayirt endojen antijen algılar ve, örneğin, belirli ardından protein değişiklikleri ayırt etmek için adapte edilebilir. Antikorlar bir kez varsa in situ boyama teknikleri hızlı sonuçlara yol açabilir - C. elegans basit olarak değil olduğu gibi hücre kültürü - örnekler kurulmuştur.

(Burada açıklanmayan) yeni bir antikor üretimi, ancak, zaman alır. Ne yazık ki, seçim piyasada bulunan C. elegans birincil antikorlar oldukça küçük kalır ve tüm antijen in situ tespit etmek mümkün değildir (antikor örnekleri için gösterilen tablo 1 bakın bağırsak antijenleri in situve tablo 3 başka kaynaklar tespit). Omurgalı antijenlere karşı oluşturulan çoğu antikorlar ile onların C. elegans homologs cross-react değil. İkincil antikorlar yelpazesi (genel ayirt protokolleri27,28' de anlatılacak) ilk antikor tür dikkate almak gerekir. Büyük seçimleri ticari floresan boyalar (örneğin Alexa Fluor boyalar) sürekli olarak iyileştirilmesi ile mevcuttur. Boyama optimize için boyalar, örneğin confocal mikroskop lazer görüntüleme için kullanılan mikroskop eşleştirmek yeteneklerini için seçilebilir ya da süper çözünürlük mikroskobu Ayrıca, yeteneklerini "blink37için" planlanmaktadır. Doğrudan etiketli birincil antikorlar veya kimyasal lekeleri (fluorescently etiketli phalloidinörneğin ) are da elde edilebilir ve çift boyama için özellikle yararlıdır.

Situ antikor C. elegans içinde boyama için zor embriyo'nın yumurta kabuğu ve her ikisi de doku için antikor erişime izin vermek için kimyasal ve/veya mekanik bozulma gerektiren larva/yetişkin kütikül sızdırmazlık olmasıdır. Her ne kadar karmaşık sıvı antikor boyama iletişim kuralları bu sorun27,28üstesinden gelmek için geliştirilmiştir, çoğu hedef dokusuna zarar eğilimi permeabilization için collagenase içerir. Buna ek olarak, burada açıklanan donma-çatlamak yöntem solucan'ın cuticles veya yumurta kabuğu açmak için basit bir yoludur. Doğrudan üzerinde gerçekleştirilen cam slayt numuneler toplanan nerede (ve boyama geri kalanını da yapılacağı yeri) ve İnşaat özellikle de için yumurta ve larva sopa bu en iyi cam slaytlara (ağırlıklı olarak aşamalar incelendiğindeYani tubulogenesis çalışmaları). Ayrıca fluorophore etiketli füzyon protein korunması ile müdahale değil. Teknik olarak (flicking önce) coverslip doğru baskıyı biraz el becerisi gerektirir ve yamultma basınç kaçınma (nazik kullanım ve tüm boyama işlemi sırasında pipetting olarak) numune koruma için kritik.

Fiksasyon koşulları ampirik olarak belirlenecek ve (27' tartışılan) lekeli etmektir yapısı/antijen için ayarlanmış gerekebilir. Her ne kadar bu doku Morfoloji, morfogenez analiz için kritik korumanıza gerek ile dengelenmelidir daha hafif (örneğin formaldehit tabanlı) fiksasyon teknikleri antigenicity, daha iyi korumak. Daha hafif fiksasyon da floresan füzyon protein çift etiketleme deneylerde korumak için yardım koşulları. Benzer şekilde, engelleme aracı (örneğin süt ya da sığır serum albümin/BSA) ve yıkama çözüm içinde deterjan miktarı belirli boyama ile arka plan dengelemek için ampirik ayar gerektirir. Ayirt teknikleri genel özellikleri, örneğin tartışma farklı boyama teknikleri, uygun denetimleri ve bu yordamları solucan bağırsaklar (bağırsak minimizeörneğin için en iyi duruma getirme ipuçları tasarımı ile ilgili ayrıntılar autofluorescence) genel ve C. elegans belirli ayirt protokolleri, başvurulan boyunca bulunabilir.

Gen fonksiyon ve tubulogenesis fenotipleri değerlendirilmesi ile girişim

Bu iletişim kuralı genlerin çoğu tubulogenesis genler (bizim genom-geniş için olduğu gibi olan kısmi (yerine tam) kaybı en bilgilendirici, erken, temel ve her yerde işlevleriyle değerlendirirken yararlıdır belirli RNAi yaklaşımları vurgular ERM ekranda-1::GFP-etiketli bağırsak önerdi Bu genler nedenleri ile bu girişim > tüm bilgilendirici tubulogenesis fenotipleri bu belirli ayar%1290'ı). C. elegans genetik manipülasyon için sunan pek çok avantajı (örneğin , kısa oluşturma süresi) ve gen işlev (fonksiyon/fenotip ile başlayan) ileri tarafından huzursuz ve tersine çevirmek için farklı yaklaşımlar (ile başlayan Gen) genetik yaklaşımlar genel olarak ele alınmıştır C. elegans edebiyat31,38. Bu ters genetik teknik ileri genetik tarama aracı olarak kullanmak üzere kitaplıkları da beslenme piyasada bulunan genom çapında RNAi kullanılabilirliğini sağlar (bkz: Malzemeler tablo kaynakları için). RNAi belirli avantajları tubulogenesis çözümlenmesi için onun yetenek şunlardır: fenotipleri mutant allelic serisi (Bu genellikle işleri doz bağımlı morfogenez genler için iyi); için eşdeğer bir dizi oluşturmak için Anne RNA'lar (genellikle erken morfogenez/tubulogenesis içinde yer); kaldırmak için sahne-özellikle (polarize membran Biyogenez üzerindeki etkileri postmitotic larva büyüme sırasında değerlendirmek için yararlı) müdahale etmek.

RNAi yordamlar genel özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi refs (26, ele alınmıştırs = "xref" > 31). RNAi koşulları fenotipleri spektrum artırmak için modüle yeteneği öldürücü tubulogenesis fenotipleri analizi için anahtardır. Bilgilendirici tubulogenesis fenotipleri genellikle vahşi tipi arka planda bağırsak özgü RNAi suşları39gerek kalmadan oluşturulur. Ancak, bu tür suşları kullanılabilmesi için bu başarısız olur ve hücre-özerk özerk olmayan etkileri ayırt etmek için de kullanılabilir. RNAi gücünü oransal için farklı yaklaşımlar bildirilmiştir, örneğin IPTG konsantrasyonları dsRNA,30en tekrarlanabilir sonuçlar üretebilir bir yaklaşım indüksiyon için titrasyon. Ancak, kantitatif tam titrasyon farklı fenotipleri bir spektrum üreten hedefleyen zaman gerekli olabilir. Genel olarak, bu analiz başarısı fenotipleri bilgilendirici bir spektrum oluşturmak RNAi koşulları belirleme olduğu gibi RNAi etkisini en üst düzeye çıkarma üzerinde bu kadar bağlı değildir (kez suboptimal (örneğin daha hafif) sonucu olabilir RNAi koşullar).

RNAi tarafından indüklenen tubulogenesis fenotipleri görsel değerlendirilmesi için en uygun pencere fenotipik değerlendirme için belirlemek önemlidir. Plakayı erken (örneğin iki onların RNAi plakaları standart RNAi koşullar altında hayvanlarla toplama sonra gün) değerlendirmeye başlayabilirsiniz ve olası geç etkileri için yeterince uzun onları takip etmek en iyisidir. Bir gelişimsel zaman tabii ki kötüleşen bir polarizasyon kusur, örneğin, 3-7 gün içinde genellikle tutuklandı larva kapsamalıdır. Polarize membran dipnotlar larva bağırsak olmayan bölme postmitotic hücrelerdeki analizi için koşulları daha da mutantlar veya RNAi hayvanlar (olarak, örneğin, let-767(RNAi) veya mutant hayvanlar yavaşlatılmış büyüme ile kullanırken geliştirilmiş olabilir 12, şekil 5). F2 hayvanlar görünüyorsa var olmak çocuk düşürmek herhangi bir zaman ders vardır (L4s deneyler nerede tüm hayvanlar ama çoğu tutuklama larva kaldırabilirsiniz). Her deneme uygun pozitif ve negatif denetimleri (tanımlanmış tubulogenesis fenotip teşvik ve vektör veya şifreli RNAi klonlar, sırasıyla boş bakteriyel RNAi klonlarörneğin ) eşlik eden değerlendirilmesi gerekir. Başka bir değerlendirme için yeterli damızlık boyutu (en az 50) gereklidir. Karşılanmazsa, diğer (örneğin koşullu) RNAi koşulları denenebilir. Son olarak, özellikle ilginç bazı tubulogenesis fenotipleri düşük alellerle ortaya böylece hayvanlar yeterli sayıda değerlendirilecek gerekir.

Mikroskobu

Düşük orta büyütme floresan mikroskopi ve yüksek büyütme confocal mikroskobu, burada, açıklanan iki standart görüntüleme yordamları anatomi bir tüp ya da Lümen fenotip temel yönlerini tanımlamak genellikle yeterli C.elegans bağırsak ve görsel olarak daha büyük setleri ileri ekranlarda hayvanların ekran için de kullanılabilir. Floresans mikroskobu dissekan izin verir: onların plakaları üzerinde hayvanların vivo içinde görüntüleme (ancak, canlı hayvan, geçici anestezi tarafından immobilize Ayrıca bağlar sonra üzerinden elde edilebilir confocal veya DIC görüntüleme); hayvanların büyük kümeleri Eleme; izleme gelişimsel olaylar (örneğin yer değiştirme ve değiştirilmesi polarize bir işaretleyici membran genişleme sırasında); (bazı desenler ve asimetriler daha iyi daha düşük büyütme oranında ayrılır) belirli ifade kalıplarının izleme; Seçme ve floresan solucanlar daha fazla analiz (örneğin confocal mikroskobu) veya extrachromosomal transgenes bakımı için uygun malzeme çekme. Görselleştirme tarafından confocal mikroskobu yüksek büyütmede fenotip tek hücre ve hücre altı düzeyde karakterize etmek için izin verir. Bu iletişim kuralı en iyi confocality üzerinden dönen disk confocal mikroskop gibi alternatifleri sunar confocal mikroskobu tarama bir lazer ile görüntüleme açıklar. Dönen disk confocal mikroskop olduğunu, ancak, seçim mikroskop dinamik ve hızlandırılmış Etütler beri daha az fototoksisite neden olmaktadır (refs (34,35) daha fazla düşük ve yüksek büyütme tartışma için bkz. mikroskopi C. elegansiçinde). Roman gibi geleneksel mikroskobik teknikler ek avantajlar sunuyor ve Nano aralığı (örneğin transmisyon elektron ve süper çözünürlük mikroskobu; ele37, içine daha yüksek çözünürlükte görüntüleme izni 40).

C. elegans bağırsak confocal mikroskop altında Imaging zaman, montaj ve immobilizasyon önemlidir. Tarama derhal yapılırsa immobilizasyon için farklı kimyasallar arasında sodyum azid - toksik ne kadar - en güvenilir bir şekilde çalışır. Levamisole, her ne kadar değil zehirli, bazen morfogenez fenotipleri değerlendirilmesi ile müdahale hypercontraction üretir. Bazı anestezikler floresan proteinler membran ilişkili ile girişime neden olabilir ve polarite kusurları gibi görünebilir eserler üreten. C. elegans kalın bir örnektir ve böylece 3D analiz (kesit) mükemmel görselleştirme apikal kavşaklar ve yanal membran (değil kolayca sağlar borulu bağırsak epitel belirli gücünü yararlanmak için önemlidir düz epiteli içinde erişilebilir). Confocal ayarları her slayt ve objektif braketi, ortalama, lazer gücü, kazanç, iğne deliği ve parlaklık gibi parametreleri de dahil olmak üzere kaliteli görüntü elde etmek için ayarlanması gerekir. Bir belirli bağırsak görüntüleme bir sorundur bu organı'nın içeriği Yeşil/Sarı autofluorescent granül (lysosome ilgili organelleri (LROs)) bu-müdahale sonuçları, yorumu ile özellikle deplasman değerlendirirken Endo ve plazma zarı ilişkili bileşenleri GFP etiketli. Bu sorun alanında iyi tanınan ve DAPI dışlama, spektral parmak izi ve ampirik tarayıcı ayarları13,41de dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar tarafından (mikroskop), bağlı olarak ele alınması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Mario de teşekkür ediyoruz Bono (Moleküler Biyoloji laboratuarında, Cambridge, İngiltere), Kenneth J. Kemphues (Cornell Üniversitesi, Ithaca, ABD), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, Fransa), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Fransa) ve suşları ve antikorlar için araştırma altyapı programları (P40 OD010440), NIH ofisi tarafından finanse CGC. Bu eser NIH GM078653, MGH olduğunu 224570 ve SAA 223809 V.G. için hibe tarafından desteklenmiştir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
  2. Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE. , (2017).
  3. Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).
  4. Mellman, I., Nelson, W. J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).
  5. Nelson, W. J. Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 422, 766-774 (2003).
  6. Goldstein, B., Macara, I. G. The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization. Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).
  7. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Organization of vesicular trafficking in epithelia. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).
  8. Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).
  9. Tepass, U. The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).
  10. Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. Polarity and endocytosis: reciprocal regulation. Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).
  11. Bryant, D. M. A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).
  12. Zhang, H. Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).
  13. Zhang, H. Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis. Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).
  14. Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes. PLoS Genet. 12 (4), e1005950 (2016).
  15. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).
  16. Altun, Z. F., Hall, D. H. Alimentary system, intestine. WormAtlas. , (2009).
  17. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  18. Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract. Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).
  19. Maduro, M. F. Gut development in C. elegans. Seminars in cell & developmental biology. , (2017).
  20. McGhee, J. D. The Caenorhabditis elegans intestine. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).
  21. Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  22. Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  23. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  24. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  25. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  26. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  27. Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).
  28. JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  29. T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  30. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  31. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  32. Simmer, F. Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).
  33. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  34. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  35. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  36. Netherlands, S. Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , Springer. Netherlands. (2008).
  37. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).
  38. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).
  39. Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions. Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).
  40. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).
  41. Shi, A., Grant, B. D. In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).
  42. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  43. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  44. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2007).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , http://dshb.biology.uiowa.edu (2017).
  49. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  50. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  51. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

Gelişim biyolojisi sorunu 128 Tubulogenesis epitel polarite membran biyoloji gelişimsel genetik tek hücre analizi in situ görüntüleme
<em>C. elegans</em> bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve <em>In Vivo </em>polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, N., Khan, L. A., Membreno,… More

Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter