Summary
인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.
Abstract
Xeno-free 및 완전 정의 된 조건은 균질 한 사람 유도 pluripotent stem (hiPS) 세포의 강력하고 재현성있는 생성을위한 핵심 매개 변수입니다. 피더 세포 또는 정의되지 않은 매트릭스상의 hiPS 세포의 유지는 배치 차이, 병원성 오염 및 면역 원성의 위험에 취약하다. 제노 프리 및 정의 된 배지 배합물과 조합하여 정의 된 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스를 사용하면 변이가 감소하고 hiPS 세포의 일관된 생성이 가능해진다. 센다이 바이러스 (SeV) 벡터는 비 통합 RNA 기반 시스템이므로 벡터 통합 벡터가 가질 수있는 게놈 무결성에 대한 파괴적인 효과와 관련된 우려를 회피 할 수 있습니다. 또한, 이들 벡터는 진피 섬유 아세포의 재 프로그래밍에서 비교적 높은 효율을 입증 하였다. 또한, 세포의 효소 단일 세포 passaging은 줄기 세포의 실질적인 사전 경험없이 hiPS 세포의 균질 유지를 용이하게합니다문화. 여기서는 재현성과 사용 용이성에 중점을두고 광범위하게 시험하고 개발 한 프로토콜을 기술하여 섬유 아세포에서 정의되고 이종없는 인간 hiPS 세포를 생성하는 강력하고 실질적인 방법을 제공합니다.
Introduction
다카하시 (Takahashi) 등에 의한 hiPS 세포주의 일차 유도 이후, 1 , 2 , hiPS 세포는 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학 3 에서 세포 치료법을 생성하기위한 원료 물질로서 유용한 도구를 제공합니다. hiPS 세포 배양은 오랫동안 섬유 모세포 피더 세포 4 , 5 또는 Matrigel 6 및 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 배합물과 함께 공 배양에 의존 해왔다. 일괄 배치 (batch-to-batch) 편차는 이러한 배양 조건의 정의되지 않은 특성의 공통적 인 결과이며 예측할 수없는 변형을 가져 오며 이는 이러한 프로토콜의 신뢰성을 저해하는 주요 원인입니다. Essential 8 (E8) 8 및 정의 된 세포 배양 기질, 예를 들어 LN-521 9 와 같은 한정 배지의 개발은재현성있는 프로토콜을 확립하고 homogenous hiPS cell 7 , 8 , 9 , 10 의 강력한 생성 및 유지를 돕습니다.
통합 자유 재 프로그래밍 기술의 개발은 도약을 가져 왔습니다. 원래 재 프로그램은 레트로 바이러스 벡터에 의존하여 무작위로 게놈에 통합되어 게놈 무결성에 파괴적인 영향을 미쳤습니다. 리 프로그래밍 방법의 발전에는 RNA 기반 벡터의 개발이 포함됩니다. RNA 벡터는 게놈 재조합을 통한 의도하지 않은 통합이 가능하지 않기 때문에 DNA 기반 재 프로그램 방법보다 이점이 있습니다 12 . SeV 벡터는 DNA- 상 11 없이 단일 가닥 RNA를 통해 외인성 인자를 과도하게 높게 발현한다. SeV에 의해 전달 된 재 프로그래밍 벡터세포 배양 전반에 걸쳐 희석되고 궁극적으로 배양 물로부터 흘려 발판 인쇄 방법으로 재 프로그램 할 수 있습니다. 그 후, pluripotency의 유지는 pluripotency 유전자 2 의 내인성 발현에 의존합니다.
선구적인 hiPS 세포 기반 치료법이 임상 시험으로 옮기기 시작함에 따라 표준화 된 배치, 재현성 및 안전성에 대한 요구가 13을 해결하는 데 필수적인 문제입니다. 그러므로 동물 기원의 제품은 피해야한다. 예를 들어, 이종 생산물의 사용은 비인간 병원균 오염의 위험과 관련되어있다. 또한, 동물 유래 배양 성분의 존재 하에서 배양 된 세포는 비인간 실리아 산을 세포막 내로 도입시켜 유도 된 세포를 면역 원성으로 만드는 위험이있다. 따라서 이종 제품을 제거해야 할 필요성은 앞으로의 임상 적 진료에 필수적입니다. 이 프로토콜은 xe를 적용합니다.세포를 임상 순응에 더 가깝게 이동시키는 hiPS 세포의 유지에 자유롭고 정의 된 배양.
이 프로토콜은 섬유 아세포에서 표준화 된 hiPS 세포를 생성하는 일관되고 재현성 있고 사용하기 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 기존의 hiPS 세포를 유지 관리 할 수있는 친숙한 배양 시스템을 제공합니다. 이 프로토콜은 Karolinska Institutet의 스웨덴 국가 인체 iPS 코어 시설에서 300 줄 이상의 hiPS 세포주를 추출하는데 사용되어 왔으며이 중 일부 줄은 이미 15 , 16 에 기술되어있다.
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Protocol
환자 물질의 수집 및 hiPS 세포의 유도는 2012 년 3 월 28 일 스톡홀름 윤리 검토위원회 (Statics Review Board)에서 승인합니다. 등록 번호 : 2012 / 208-31 / 3. 달리 명시되지 않는 한 세포 배양 단계는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행되어야합니다. 세포 작업시 항상 멸균 취급 기술을 연습하십시오. 시작하기 전에 미디어, 플레이트 및 시약이 실온에 도달하도록하십시오. 고습도에서 37 ° C, 5 % CO 2 에서 세포를 배양하십시오.
1. 피부 생검에서 인간 섬유 아세포의 분리
- 배양 배지, 소화 효소, 접시 코팅 및 해부 도구.
- Fibroblast 배지 준비 : Iscoove 수정 된 둘 베코 배지 (IMDM) 44.5 mL, 태아 소 혈청 (FBS) 5 mL 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEST) 500 μL ( 표 1 참조)를 4 ° C에서 보관하십시오.
- 1 mg / mL의 작업 농도에서 소화 효소를 준비하십시오 : wei4ml의 디스 페아 제 및 콜라게나 제 I 형 파우더를 별도의 15-mL 튜브에 분주하고 4 mL의 DMEM / F12 + 1 % PEST에 용해시켰다. 0.22 μm 여과기를 통과시켜 효소 용액을 소독합니다. 매번 신선한 효소 용액을 준비하십시오.
- 인산염 완충 식염수 (DPBS) 0.1 % 젤라틴 1 ML로 해부 당 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35 mm 조직 문화 요리)에 하나 잘 코트. 실온에서 30 분 동안 품어 낸다.
- 해부를 위해 생검 당 1 세트의 외과 용 가위 및 집게를 고압 멸균합니다.
- 생검 처리
참고 : 생검 후 가능한 한 빨리 생체 조직을 처리하십시오. 4 ° C에서 48 시간 동안 PBS + 1 % PEST에 보관하십시오. 생검은 크기가 2 - 4 mm이고 윤리적 허용 기준에 따라야합니다.- 35 mm 접시에 생검을 옮깁니다. 생검을 새로운 35 mm 접시로 옮기고 30 초 동안 70 % 에탄올 2 mL에 생검을 잠수시킵니다.
- 생검을 세 번째 위치로 옮깁니다.35 mm 접시와 멸균 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 % 해소 보충 1 ML로 씻으십시오.
- 생검을 네 번째 35 mm 접시에 옮기고 새로 준비한 0.1 % 디스 페스 용액 1 mL를 넣으십시오.
- 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 접시에서 1 - 2 mm 3 조각으로 피부 생검을 잘라 낸 다음 dispase 용액을 포함한 생검 조각을 15 mL 튜브에 옮깁니다. 추가 2 mL의 디스펜서를 첨가한다.
- 35 mm 접시를 1 mL 디스펜스 용액으로 헹구고 15 mL 튜브로 옮긴다.
- 밤새 4 ° C에서 생검을 품어.
- 37 ℃에서 4 시간 동안 튜브에 0.1 % 콜라게나 아제 I 4 mL를 넣고 부화시킨다.
- 3 분 동안 300xg의 소화 세포를 원심 분리하고 상층 액을 흡인하고 섬유 아세포 2mL에 다이제스트를 resuspend.
- 6 잘 조직 문화 플레이트에서 젤라틴 솔루션을 제거합니다. 나머지 조각을 포함하여 세포 현탁액을 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35mm 조직 배양 접시)를 DPBS 중의 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅 하였다.
- 3 일마다 매체를 교체하십시오.
- 인간 섬유 아세포의 팽창
참고 : 80 % 합류 ( 그림 2B ) 때 섬유 아 세포는 T25 (25cm 2 ) 조직 배양 플라스크에 passaged 준비가되었습니다. 섬유 아세포는 일반적으로 7 일 이내에 80 %의 confluency에 도달합니다. 그러나 필요한 시간은 크게 다를 수 있지만 4 주를 넘지 않아야합니다.- 매체를 기음과 2.5 ML의 DPBS로 한 번 씻으십시오.
- DPBS를 제거하고 Trypsin-EDTA (0.05 %) 1 mL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 둥근 모서리를 표시 할 때까지 배양하여 분리를 시작하십시오.
- 필요한 경우 세포의 적절한 분리를 보장 세포 씻어 섬유 아세포 2 ML을 추가합니다. 3 분 동안 300 XG에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 세포 솔루션을 전송합니다.
- 상청액을 버리고 세포 펠렛을 5 mL의 섬유 아세포 배지 및 플레이트 섬유 아세포에코팅 된 세포 조직 배양 T25 플라스크. 이 단계 후에 섬유 아 세포를 확장하면 위에 설명한대로 해리하고 종자 12 X 10 3 셀 / cm 2 .
- 일단 융합 세포가 냉동 준비가되면 재 프로그램을 위해 팽창 시키거나 플레이트하십시오. 모든 재 프로그램이 시작되기 전에 섬유 아세포의 두 라운드를 동결하십시오 (동결 절차는 다음 섹션 참조). 재 프로그래밍 효율은 일반적으로 낮은 통과 섬유 아세포의 경우보다 높으며, 2-4의 세포가 최적이다. 그러나,이 프로토콜을 사용하여 10 번까지 섬유 아세포의 성공적인 재 프로그램 화가 수행되었다.
- 섬유 아세포의 동결 및 해동
- 신선한 fibroblast 냉동 매체를 준비하십시오 : 90 % FBS + 10 % dimethylsulfoxide (DMSO). 4 ° C에서 유지하십시오 ( 표 1 ). 일단 합류되면 T25 조직 배양 플라스크를 3 개의 냉동 보관실로 동결시킬 수 있습니다. 냉동 약병 당 섬유 아세포 냉동 매체 500 μL를 준비합니다.
- 세포를 동결시키기 위해 c단계 1.3에서 설명한대로 혈구 계수계를 사용하여 세포 수를 계산하고 3 x 105 세포의 일부를 15 mL 튜브로 옮긴다. 300xg에서 3 분간 튜브를 회전시킵니다. 뜨는을 대기음.
- 4 ˚C의 섬유 아세포 동결 배지 500 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 cryovials로 전송하십시오. 냉동 용기에 유리 병을 넣고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오.
- 세포를 해동 시키려면 37 ° C의 물에 냉동고의 바닥 부분을 담그십시오. 액화되면 세포 현탁액을 15 mL 튜브에 옮기고 5 mL의 섬유 아세포 배지를 첨가하십시오. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀.
- 뜨는을 제거하고 fibroblast 매체 5 ML에서 세포 펠렛을 resuspend. 비 코팅 T25 조직 배양 플라스크에 세포를 옮기고 37 ° C에 품어 라.
2. 섬유 아세포의 SeV 벡터 재 프로그램
- 벡터 분취 량의 준비 주의 : 바이오 안전성 레벨 2의 밀폐하에있는 SeV를 다루십시오. 제조업체의 프로토콜 및 현지 지침 17을 참조하십시오. 바이러스 역가는 배치마다 다릅니다.
- aliquots을 준비하기 전에 제조 업체의 프로토콜 ( 예 : CytoTune 2.0)에 따라 5 X 10 4 세포에 필요한 벡터의 양을 계산합니다. 바이러스 역가는 일반적으로 8 x 107 ~ 1.5 x 108 입니다. 벡터 5 : 5 : 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 및 hKlf4 = MOI 3) 벡터를 분해하고 결합하십시오. 오토 클레이브 1.5 ML 튜브에 5 X 10 4 세포의 재 프로그램을 위해 계산 된 금액. 재 프로그램을 위해 바이러스 부피를 섬유 아세포 배지로 희석하여 최종 부피 250 μL로 만듭니다.
참고 : 각 유리 병은 5 x 10 4 섬유 아세포가있는 24- 웰 조직 배양 플레이트의 한 개의 웰을 다시 프로그래밍 할 때 유효합니다. 바이러스 분주를 -80 ° C에 보관하십시오.
- aliquots을 준비하기 전에 제조 업체의 프로토콜 ( 예 : CytoTune 2.0)에 따라 5 X 10 4 세포에 필요한 벡터의 양을 계산합니다. 바이러스 역가는 일반적으로 8 x 107 ~ 1.5 x 108 입니다. 벡터 5 : 5 : 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 및 hKlf4 = MOI 3) 벡터를 분해하고 결합하십시오. 오토 클레이브 1.5 ML 튜브에 5 X 10 4 세포의 재 프로그램을 위해 계산 된 금액. 재 프로그램을 위해 바이러스 부피를 섬유 아세포 배지로 희석하여 최종 부피 250 μL로 만듭니다.
- SeV 벡터 전달
- 흡인 세포 cu배지를 가하고 1 mL의 DPBS로 씻는다. DPBS를 대기음으로하고 트립신 - EDTA (0.05 %) 1 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 인큐베이션한다.
- fibroblast 매체 2 ML을 추가하고 세포를 resuspend하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 3 분 동안 300 XG를 원심 분리하십시오.
- 뜨는을 기음과 fibrosblast 매체 2 ML에 펠렛을 resuspend.
- hemocytometer를 사용하여 섬유 아 세포를 계수하고 24 - 웰 조직 배양 판의 하나의 우물에 5 x 10 4 개의 세포를 시드하십시오. 하룻밤 37 ° C에서 세포를 품어.
- 세포 배양 배지를 대기음으로하여 SeV 용액 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
- 매일 매체를 신선한 섬유 아세포로 바꿉니다. LN - 521 코팅 플레이트로 passaged하기 전에 transduced 세포가 7 일 동안 성장할 수 있습니다. 통과하기 하루 전 LN-521 판을 준비하십시오. 코팅 절차는 2.3.1을 참조하십시오.
- 형질 도입 된 섬유 아세포의 재조합
- LN-521 코팅 된 접시 : DPBS에서 LN-521을 최종 농도 0.63 μg / cm 2로 희석하십시오. 60mm 조직 배양 접시 당 LN - 521 솔루션 2 ML 피펫. parafilm을 사용하여 60mm 조직 배양 접시를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
- 보다 쉬운 취급을위한 Essential 8 medium (E8) 분취 량을 준비하십시오 : E8 배지 48.5 mL, E8 보충액 1 mL 및 PEST 500 μL ( 표 1 ).
- 형질 도입 7 일 후, 세포를 LN-521로 코팅 된 60mm 조직 배양 접시에 옮긴다. Trypsin-EDTA (0.05 %) 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 배양하십시오. 300 x g에서 3 분간 섬유 아세포 배지 2 mL와 원심 분리 세포를 첨가한다.
- 뜨는을 대기음. hemocytometer에서 fibroblast 매체와 카운트 셀 2 ML의 Resuspend 펠렛. 사전 코팅 판에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 LN - 521 precoated 60mm 요리에 섬유 아세포 매체의 5ml에 4 X 10 4 셀을 시드. Rho 키나아제 억제제 Y-27632를 첨가하십시오(ROCKi)를 5 μM의 최종 농도로 첨가 하였다. 37 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
- 중요하게, 다음날, 매체를 E8 매체로 변경하십시오. 매일 E8 매체를 교체하십시오. hiPS 세포 콜로니가 2 ~ 3 주 이내에 나옵니다.
3. 콜로니 선택 및 hiPS 세포의 확대
참고 : 다음 단계는 스테레오 현미경으로 바이오 안전성 캐비닛 외부에서 수행됩니다. 헤어넷과 절차 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양 물을 오염시키지 않도록 조심스럽게 작업하십시오.
- 피킹하기 전날 LN-521 코팅 조직 배양 24- 웰 플레이트를 준비하십시오. DPBS 0.63 μg / cm 2 에서 LN-521 희석. 250 - LN - 521 솔루션의 피펫 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 잘. parafilm을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
참고 : 식민지는 직경이 1mm를 초과하면 집어 낼 준비가됩니다. 식민지는 날카로운 모서리를 나타내고 균질 한 mon으로 자라야한다.olayers ( 그림 2D ). - LN - 521 솔루션을 대기음하고 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 E8 500 μL를 추가합니다.
- stereomicroscope 아래 패턴과 같은 격자에 메스와 작은 조각으로 식민지를 잘라. 기계적으로 접시에서 세포 시트를 긁어 준비 잘 ( 그림 2D -2E ) 200 μL 피펫을 사용하여 시트를 전송할 수 있습니다. 콜로니를 별도의 우물로 선택하십시오.
- 48 시간 동안 배지를 바꾸지 않고 세포가 부착되도록하십시오. 그 후, 매일 E8 배지로 교환하십시오.
- 콜로니의 크기가 5 mm를 초과하면 LN-521 코팅 판의 새 우물에 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과시킵니다.
- 세포에서 세포 배양 매체를 대기음과 DPBS 250 μL로 씻으십시오.
- DPBS를 기음. 해리 시약 250 μL를 추가하고 37에서 3 분 품어 ° C.
- 세포가 반올림되기 시작했는지 관찰하십시오. 떼다세포를 해리 시약으로 몇 번 헹구어 플레이트에서 제거한다.
- 15 ML 튜브에 E8 매체 500 μL를 추가합니다. 해리 시약의 세포를 튜브에 옮기고 300 x g에서 3 분간 원심 분리한다.
- LN - 521 precoated 우물에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 500 μL 실내 온도 E8 매체를 추가합니다.
- 뜨는을 대기음과 E8 매체 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- hemocytometer를 사용하여 세포를 계산하고 준비 LN - 521 precoated 잘 (1.25 X 10 4 - 2.5 X 10 4 셀 / cm 2 )에서 2.5 X 10 4 - 5 X 10 4 세포를 시드. 세포 배양 양식은 의도 한 목적에 맞게 쉽게 확대 할 수 있습니다.
- ROCKi를 10 μM의 최종 농도에 첨가하십시오. 37 ° C에서 세포를 품어.
- 매일 E8 매체를 교체하십시오. 세포는 보통 4-6 일 후에 통과 할 준비가됩니다. 상기에서 기술 한 바와 같이 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과 시키며, 약 90 % 융합.
참고 : 재 프로그램 벡터는 hiPS 세포 확장 도중 점진적으로 희석되고 통과 12 후에는 검출되지 않습니다. 공평하게 재 프로그램 된 세포는 일반적으로 6 ~ 10 번 통로에서 증식을 멈추거나 특징적인 다 능성 줄기 세포 형태를 잃습니다 ( 그림 3B ). - hiPS 세포의 동결 및 해동
- 세포를 동결하려면, 위에서 설명한대로 효소로 단일 세포로 세포를 해리하고, hemocytometer에서 세포를 계산하고 E8 매체의 1 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 2.5 X 10 5 세포를 전송합니다. 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하십시오. 뜨는을 대기음.
- 4 μC PSC cryomedium 250 μL에 Resuspend 세포 펠렛과 cryovial로 전송합니다. 냉동 보관 용기에 유리 병을 놓고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오.
- 세포를 녹이기 위해서는 미리 코팅 한 24- 웰 조직 배양의 LN-521 웰을 준비하십시오플레이트를 LN-521 용액을 흡입하고 250 ㎕의 E8 배지를 첨가함으로써 배양 하였다. 작은 고드름이 남아있을 때까지 37 ° C의 물에서 냉동 보관함의 바닥 부분을 잠급니다.
- cryovial에 E8 매체 250 μL를 추가하고 세포 현탁액을 15 ML 튜브에 전송하고 E8 매체 1 ML을 추가합니다. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀.
- 뜨는을 제거하고 상온 E8 매체 250 μL의 세포 펠렛을 resuspend. 준비된 우물에 세포 현탁액을 전송하고 1 % 세포 생존 보충 또는 10 μm의 록키를 추가합니다. 37에서 조직 문화 플레이트를 품어 ° C.
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Representative Results
생검에서 hiPS 세포로
생체 검사부터 확립 된 hiPS 세포에 이르는 전체 과정은 재 프로그램 벡터가 없으며 특성화를 위해 준비되며 약 16 주 소요됩니다 ( 그림 1 ). 보다 자세한 타임 라인은 그림 2A에 명시되어 있습니다. 섬유 아세포 배양을 확립하고 확장시키기 위해서는 약 4 주가 소요됩니다. 첫 번째 hiPS 세포 콜로니는 센다이 벡터 형질 도입 후 약 3 주 후에 나타났다. 콜로니는 첫 번째 통로에서 기계적으로 골라내어 효소 적으로 단일 세포로 퍼지게된다.
인간 섬유 아세포 배양 물의 확립
사람의 섬유 아세포 배양 물이 confluency로 성장하여 받아 들여진 형태를 나타낼 때, 그들은 처음에 두 개의 passag( 그림 2B ).
SeV 벡터를 이용한 인간 섬유 아세포의 재 프로그램
SeV 형질 도입 후 세포 죽음의 증가 된 수준이 발견되었고 섬유 아세포의 형태에 약간의 변화가 관찰되었다. 첫 번째 hiPS 콜로니의 출현은 형질 도입 후 12 일째부터 발견되었다 ( 그림 2A , 2C ). 집을 잡을 준비가 된 식민지는 형질 도입 후 약 3 ~ 4 주일이 걸릴 것으로 예상되었다 ( 그림 2A , 2D ). 이 프로토콜에 명시된 양의 세포를 시딩하면 풍부한 콜로니가 나타납니다 (<20). 유리한 형태를 나타내는 콜로니를 선택적으로 따는 것이 좋습니다. 식민지 특징 선호 평평한 소형 세포 질량, 균질 monolayers로 성장, 구별 indi 주변 섬유 모세포쪽으로 날카로운 가장자리를 가진 다발성 세포 ( 도 2D ). hiPS 세포 콜로니를 메스를 사용하여 그리드 형 패턴으로 절단하고 기계적으로 통과시켰다 ( 도 2E ). 픽업 된 hiPS 클론을 중간 정도의 변화없이 플레이트에 부착시키기 위해 48 시간 동안 두었다. hiPS 세포 클론은 매우 균질 하였지만, 재 프로그래밍 플레이트에서 유래 된 소수의 섬유 아세포는 처음 두 계대 동안 허용되었다 ( 도 2F ). 까다로운 국경과 큰 불균일 한 이종 세포 덩어리로 식민지를 선택하는 것은 피해야한다 ( 그림 2G ). 획득 된 hiPS 세포주는 핵 - 세포질 비율이 높고 발광 테두리를 정의한 고밀도 단일 층으로 자랐다. 대조적으로, 이러한 기준을 충족시키지 못한 부착 된 비 균질 콜로니는 버려졌으며 ( 그림 2H ), 혼합 세포 집단의 배양을 피했다.
p ": keep-together.within-page ="1 "> hiPS 세포 클론의 검증파생 세포의 다 능성의 특성화는 SeV 벡터가 소실 된 후 수행되었으며 다 능성 상태의 유지는 내인성 인자의 발현에 의해 유도되었다. hiPS 세포 검증을 진행하기 전에 SeV 벡터 표현이 손실되었는지 확인하십시오. 이 프로토콜에 따라 SeV 벡터 RNA는 우리의 경험에 따라 12 번 통로에서 더 이상 검출 할 수 없으므로 특성화의 적절한 출발점이됩니다 ( 그림 3A ). 다 능성 마커에 대한 면역 세포 화학 염색 OCT4, SSEA4 및 NANOG는 균질 양성 결과를 가져와야합니다 ( 그림 3B ). 다 능성 인자를 발현하지 않은 부분적으로 재 프로그램 한 세포를 함유 한 세포 배양 물은 폐기되었다 ( 도 3C ). 내인성 다 분화 유전자의 mRNA 발현은 실시간 PC 도 3D의 R (RT-PCR).
Pluripotent 줄기 세포는 쉽게 3 개의 세균으로 분화 할 수 있어야합니다. hiPS 세포 분화 가능성은 배아 체 (EB) 18의 형성에 의해 평가되었다. hiPS 세포로부터 생성 된 자유 부동 EB를 도 3E에 나타내었고 21 일 후의 EB 분화 후 배아 층 특이 마커의 mRNA 발현을 도 3F에 나타내었다.
그림 1 : 피부 생검에서 hiPS 세포까지의 흐름 차트.
프로토콜의 주요 단계 개요. 이 그림에는 생검 수집, 섬유 아세포의 분리, SeV 전달, 식민지 따기 및 hiPS 세포의 클론 성 확장이 포함됩니다.e.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : hiPS 세포 생성의 중요한 단계.
(A) 시간 선은 섬유 아세포, SeV 전달, 중간 변화 및 코팅을 포함하여 프로토콜에서 중요한 시점을 강조한다. hiPS 세포의 통로 12는 특성화 실험의 시작으로 강조 표시됩니다. (B) 일반적인 형태와 문화에서 합류 섬유 아 세포의 밝은 필드 이미지. (C) 형질 도입 된 섬유 아세포로부터의 hiPS 세포 콜로니의 출현. (D) 주위의 섬유 아세포 (날갯짓 0)쪽으로 날카로운 모서리를 가진 구별 가능한 개별 세포를 평평하게하는 우점 특징을 나타내는 식민지를 선택할 준비가 됨. (E) hiPS세포 콜로니는 그리드 형 패턴으로 절단되고 기계적으로 계승된다 . (F) 성장 며칠 후 식민지를 준수. 부착 된 hiPS 세포는 재 프로그램 염색 플레이트에서 기원 한 비정상적으로 많은 수의 섬유 아세포로 둘러싸여있다. 섬유 아세포는 플레이트를 긁어 낼 수 있으며 이후의 단일 세포 구절 (통로 1)에서 사라질 가능성이 큽니다. (G) 완전히 재 프로그램 된 세포를 연상시키지 않는 형태를 나타내는 콜로니; 까다로운 국경, 큰 비 압축 이종 세포 덩어리. (H) 밝기 필드 이미지는 매우 이질적인 세포주에 비해 균질 한 완전히 재 프로그램 된 hiPS 세포주를 조기 통과시키는 것을 예시한다. 스케일 바는 100 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : hiPS 세포의 특성.
(A) SeV 벡터 특정 마커의 RT-PCR. 통로 3에서의 hiPS 세포는 재 프로그래밍 벡터 1에 대한 양성 대조군으로서 사용된다. 12 번 관절에서 바이러스 특이 마커 Sendai specific backbone (SeV B), Sendai specific KLF4 (KLF4 SeV), 센다이 특이 cMYC (cMYC SeV), PCR control (GAPDH) 및 template 없음 (-) (B) 통로 12에서 완전히 재 프로그램 된 균일 한 hiPS 세포주의 대표적인 예. hiPS 세포의 명 시야 이미지는 날카로운 발광 단 가장자리 및 큰 핵 및 작은 세포질을 갖는 단단한 단일 층에서 세포가 자라는 것을 나타낸다. 다 능성 마커 OCT4, NANOG, SSEA4 및 핵 염색 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)의 면역 세포 화학 염색은 균질 양성 발현을 입증한다. (C) pluripotency 마커 NANOG에 대한 이질적인 표현을 전시 세포주. 문화e는 부분적으로 재 프로그램 된 셀을 포함하므로 폐기해야합니다. (D) 다 능성 마커의 발현을 나타내는 다 능성 마커 NANOG, OCT4, PCR 대조군 (GAPDH) 및 주형 (-)의 mRNA 발현의 RT-PCR. (E) hiPS 세포로부터 생성 된 자유 부동 배아 체. (F) 21 일 배아 체 차별화 후 RT-PCR은 파생 된 hiPS 세포가 3 개의 세균 층으로의 분화가 가능하다는 것을 보여준다. 내배엽 마커 AFP 및 GATA4, 중피종 마커 RUNX 및 HAND1, 외배엽 마커 NCAM 및 NESTIN, PCR 대조군 (GAPDH) 및 형판 없음 (-). 스케일 바는 100 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 예상 결과는 여러 clonally derived hiPS 세포 라인의 성공적인 생성입니다. 중요하게, 여기에 기술 된 확립 된 hiPS 세포의 유지 및 확대를위한 방법은 신뢰성이 있고 줄기 세포 배양의 경험이 거의없이 수행 될 수있다. LN-521 매트릭스와 함께 ROCKi와 함께 효소 단클론 항체는 식민지 기반의 구강이 10 , 19 , 20을 자극 할 수있는 유도 이질성을 피하면서 핵형 적으로 정상, 다 능성 및 쉽게 분화 할 수있는 것으로 세포를 유지하는 것으로 알려져있다. LN-521에서 배양 된 hiPS 세포는 ROCKi 10을 첨가하지 않고 단일 세포로 계대 할 수 있지만, ROCKi를 첨가하면 경험이 적은 핸들러가 쉽게 프로토콜을 수행 할 수 있으며 hiPS 세포 유도에 필요한 시간이 단축됩니다.
재 프로그래밍 효율은 GE입니다.이 프로토콜에 대한 전반적인 문제는 아닙니다. SeV 벡터는 섬유 아세포 11에 대해> 1 %의 비교적 높은 재 프로그램 효율을 갖는다. 풍부한 식민지 출현 (<20)이 예상됩니다. 필요한 콜로니 수의 3 배를 선택하는 것이 좋습니다. 픽킹 된 클론 중 일부는 따기 후에 고착되지 않음이 관찰되었습니다. 부분적으로 재 프로그램 된 콜로니를 보충하기 위해서는 여분의 콜로니가 필요할 수도 있습니다. 부분적으로 재 프로그램 된 콜로니는 경우에 따라 SeV 벡터에 의한 다 능성 유전자의 외인성 발현에 의해지지 및 성장할 수있다. SeV 벡터가 희석됨에 따라이 세포들은 증식과 해리를 멈추게되며, 일반적으로 6-8 번 주변에서 명백해진다. 배양 물의 이질성 (heterogeneity)은 또한 부분 재 프로그램의 징조이며 이질적인 균주는 폐기되어야한다 ( 그림 2H ).
재 프로그램 벡터 및 배양 조건의 최적 선택은생성 된 세포의 목적. 그러나 결과에 영향을주는 배치 별 변동을 피하려면 정의 된 조건을 사용하는 것이 좋습니다. 재조합 세포의 게놈 무결성을 보존하기 위해 비 통합 벡터 시스템을 선택하는 것이 좋습니다. SeV 벡터는 견고성, 상대적으로 높은 효율 및 낮은 수위 시간으로 인해이 프로토콜에서 선택되었습니다. SeV 벡터는 세포 분열 동안 희석되고 통로 12 주위에서 검출되지 않으므로, 생성 된 데이터가 외인성 발현에 의해 영향을받지 않도록 보장한다. 임상 목적으로 의도 된 세포에 대한 세심한 요구 때문에 SeV 재 프로그램은 모든 벡터 물질의 완전한 제거가 어렵다는 것을 입증하기 때문에 임상 번역의 장벽이 될 수 있습니다. mRNA 매개 재 프로그램은 세포 치료 12 에서 의도 된 사용으로 세포를 도출하는 경우에 유리할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 훨씬 더 노동 집약적이며 21 을 사용하기가 더 복잡합니다. 여기 방법은 de섬유 아세포 배양에 대한 스크라이브 (scribe)는 또한 임상 적 적용에 부적합하다. FBS와 젤라틴 모두 이종이면서 정의되지 않았기 때문에 정의 된 이종 프리 제품 22로 바꾸는 것이 좋습니다.
어떤 형태의 세포 배양으로 작업하는 동안 멸균 처리 기술과 정기적 인 마이코 플라스마 감염 검사가 권장됩니다. 인간의 피부에는 제대로 처리되지 않으면 배양되는 환경에서 번식 할 수있는 많은 미생물이 포함되어 있습니다. 그러므로 피부 생검의 처리 및 생체 검사 과정을 거친 배양 첫 일 동안 특별한주의를 기울이는 것이 좋습니다. 피부 생검에서 섬유 아세포 배양 물의 수립은 실제로 시간이 많이 소요되는 과정입니다. 피부 생검을 처리 한 후 초기에는 섬유 아세포 세포의 약한 징후가 나타나기 때문에 문화에 예상되는 형태를 나타내는 소수의 섬유 아세포를 찾기 위해 적어도 일주일 정도 기다려야합니다. 섬유 아 세포의 형성에 필요한 시간생체 내 생체 외 체외 배양 검사는 생검의 크기, 기증자의 연령, 그리고 생검이 취해진 이후의 생체 내 검사 방법 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 최적의 재 프로그램 효율 23을 위해 조기 통과 섬유 아세포를 재 프로그램하는 것이 바람직합니다.
요약하면, 우리는 매우 균일 한 hiPS 세포를 생성하기 위해 확고하고 사용하기 쉬운 방법을 확립했습니다.
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Disclosures
저자는보고 할 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 SSF (B13-0074)와 VINNOVA (2016-04134) 자금 지원 기관에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 mL tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 mL | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Sealing plates for storage |
References
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