Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56146
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

Summary

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

Abstract

Xeno ללא תנאים מוגדרים לחלוטין הם פרמטרים מרכזיים עבור הדור חזק לשחזור של הומוגני האדם המושרה גזע pluripotent (hiPS) תאים. תחזוקה של תאים hiPS על תאים מזין או מטריצות לא מוגדר רגישים הבדלים אצווה, זיהום פתוגני הסיכון של immunogenicity. ניצול המוגדר רקומביננטי האנושי laminin 521 (LN-521) מטריצה ​​בשילוב עם פורמטים ללא xeno ו מוגדרים התקשורת מפחית השתנות ומאפשר את הדור עקבי של תאים hiPS. וירוס סנדאי (SeV) הוא וקטור שאינו שילוב מערכת RNA, ובכך לעקוף את החששות הקשורים השפעה משבשת פוטנציאלית על שלמות הגנום שילוב וקטורים יכול להיות. יתר על כן, אלה וקטורים הוכיחו יעילות גבוהה יחסית תכנות מחדש של fibroblasts עורי. בנוסף, אנזימטית תא יחיד passaging של תאים מקלה אחזקה הומוגנית של תאים hiPS ללא ניסיון קודם משמעותי של גזע ceLl תרבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול זה נבדק בהרחבה ופיתח עם דגש על reproducibility וקלות השימוש, מתן דרך מעשית ויציבה כדי ליצור מוגדר ו xeno ללא תאים hips האדם מן fibroblasts.

Introduction

מאז הגזירה הראשונה של שורות תאים hiPS ידי טקהאשי et al. 1 , 2 , תאים hiPS סיפקו כלי שימושי עבור דוגמנות המחלה, גילוי סמים כחומר המקור להפקת טיפולי התא ברפואה רגנרטיבית 3 . תרבות hiPS התא כבר זמן רב תלוי תרבות שיתוף עם תאים מזין fibroblast 4 , 5 או על Matrigel 6 ו עם ניסוחים התקשורת המכיל בסרום שור עוברית (FBS). שינויי אצווה אל אצווה הם תוצאה נפוצה של הטבע הבלתי מוגדר של תנאי תרבות אלה, וכתוצאה מכך וריאציות בלתי צפויות, המהווה תורם מרכזי האמינות של פרוטוקולים אלה 7 . פיתוח של בינוני מוגדר כגון Essential 8 (E8) 8 ו מטריצות תרבות מוגדר תא למשל LN-521 9 , לאפשרS להקמת פרוטוקולים לשחזור מאוד וסיוע הדור החזקה ותחזוקה של תאים hiPS הומוגני 7 , 8 , 9 , 10 .

פיתוח של אינטגרציה חינם תכנות מחדש טכניקות כבר זינוק קדימה. במקור, תכנות מחדש היה תלוי על וקטורים retroviral אשר משולבים באופן אקראי לתוך הגנום עם השפעות משבשות על שלמות גנומית 11 . ההתקדמות במתודולוגיות של תכנות מחדש כוללת את הפיתוח של וקטורים מבוססי RNA. RNA וקטורים יש יתרון על פני שיטת ה- DNA מבוסס תכנות מחדש כמו אינטגרציה לא מכוונת באמצעות רקומבינציה גנומית אינו אפשרי 12 . SEV וקטורים לספק ביטוי גבוה וחולף של גורמים אקסוגניים באמצעות RNA יחיד תקועים ללא שלב ה- DNA 11 . את וקטורים תכנות מחדש שנמסר על ידי SEVהם מדולל ברחבי הרחבת התא ובסופו של דבר לשפוך מהתרבות לספק דרך הדפסה חופשית של תכנות מחדש. לאחר מכן, תחזוקה של pluripotency תלויה ביטוי אנדוגני של גנים pluripotency 2 .

כמו טיפולים חלופיים מבוססי תאים hiPS מתחילים לעבור ניסויים קליניים, הדרישות עבור אצווה סטנדרטית, reproducibility, ובטיחות הם נושאים חיוניים כדי לענות על 13 . לכן, מוצרים בעלי חיים יש להימנע. לדוגמה, השימוש במוצרים קסנוגניים קשור לסיכון לזיהום פתוגן לא אנושי. כמו כן, תאים מתורבת בנוכחות של בעלי חיים מרכיבים התרבות הנגזרים הוכחו לשלב חומצות siliac לא אנושיים לתוך קרום התא המאיים להבהיר תאים נגזרים immunogenic 14 . לפיכך, הצורך לחסל מוצרים xenogeneic הוא הכרחי על כל עיסוקים קליניים עתידיים. פרוטוקול זה חל על xeללא חופשי ומוגדר התרבות תחזוקה של תאים תאים hiPS נעים קרוב יותר תאימות קלינית.

פרוטוקול זה מתאר שיטה עקבית, לשחזור מאוד וקל לשימוש, שיוצר תאים hiPS סטנדרטי מ fibroblasts. הוא גם מציע מערכת ידידותית למשתמש תרבות עבור תחזוקה של תאים hiPS הוקמה. פרוטוקול זה שימש כדי להפיק יותר מ 300 שורות תאים hiPS ב שבדיה האדם הלאומי iPS מתקן הליבה בבית Institutet Karolinska אשר כמה שורות בעבר תוארו 15 , 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

האוסף של חומר המטופל ו הגזירה של תאים hiPS מאושר על ידי מועצת המנהלים של סקירה אתית, שטוקהולם, 28 מרס 2012, מספר רישום: 2012 / 208-31 / 3. צעדים תרבות תאים צריך להתבצע בארונות biosafety אלא אם כן צוין אחרת. תמיד תרגול טכניקות טיפול סטרילית בעת עבודה עם תאים. אפשר מדיה, צלחות ריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר לפני שמתחילים. דגירה התאים ב 37 ᵒC, 5% CO 2 בלחץ גבוה.

1. בידוד של פיברובלסטים אנושיים מ ביופסיה דרמל

  1. תכשירים של אנזימים בינוניים של תרבות, עיכול, ציפוי של כלים וכלים לנתח.
    1. הכן בינוני פיברובלסטים: 44.5 מ"ל Iscove השתנה של Dulbecco בינוני (IMDM), 5 מ"ל בסרום שור העובר (FBS) ו 500 μic פניצילין / סטרפטומיצין (PEST) (ראה טבלה 1 ), חנות ב 4 ° C.
    2. הכן אנזימים העיכול בריכוז עבודה של 1 מ"ג / מ"ל: WeiAliquots gh של 4 מ"ג dispase ו collagenase סוג אני אבקה צינורות נפרדים 15 מ"ל ו להתמוסס 4 מ"ל של DMEM / F12 + 1% PEST. לעקר את הפתרון האנזימטי על ידי העברת אותו דרך מסננת 0.22 מיקרומטר. הכן פתרונות אנזים טרי בכל פעם.
    3. מעיל אחד טוב צלחת 6-רקמה תרבותית (או 35 מ"מ צלחת רקמה תרבות) לכל ביופסיה גזור עם 1 מ"ל של ג'לטין 0.1% ב פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    4. החיטוי קבוצה אחת של מספריים כירורגי ו מלקחיים לכל ביופסיה לנתיחה.
  2. טיפול ביופסיה
    הערה: תהליך ביופסיות מהר ככל האפשר לאחר נלקח. חנות PBS + 1% PEST עד 48 שעות ב 4 ° C. ביופסיה צריכה להיות בגודל של 2 מ"מ בקוטר ובהתאם לאישורים אתיים.
    1. מעבירים את הביופסיה לתוך צלחת 35 מ"מ. להעביר את הביופסיה לצלחת 35 מ"מ חדש לצלול הביופסיה ב 2 מ"ל של 70% אתנול במשך 30 s.
    2. להעביר את הביופסיה לשליש35 מ"מ צלחת לשטוף עם 1 מ"ל של תמיסת מלח איזון סטרילי של האנק (HBSS) בתוספת 1% PEST.
    3. מעבירים את הביופסיה לצלחת רביעית 35 מ"מ, מוסיפים 1 מ"ל של פתרון טריז מוכן 0.1% טרי.
    4. חותכים את ביופסיה העור לתוך 1 - 2 מ"מ 3 חתיכות בצלחת באמצעות מספריים כירורגי מלקחיים ולאחר מכן להעביר ביופסיה חתיכות כולל פתרון dispase לתוך צינור 15 מ"ל. הוסף 2 מ"ל נוספים של dispase.
    5. שוטפים את צלחת 35 מ"מ עם פתרון 1 מ"ל dispase ולהעביר את צינור 15-מ"ל.
    6. דגירה ביופסיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    7. הוסף 4 מ"ל של 0.1% collagenase אני הצינור ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    8. צנטריפוגה תאים מתעכל 300 xg במשך 3 דקות, לשאוב supernatant ו resuspend העיכול ב 2 מ"ל של מדיום fibroblast.
    9. הסר את הפתרון ג'לטין מהצלחת 6-רקמת התרבות. מעבירים את ההשעיה התא כולל כל החלקים הנותרים כדי 6-היטב צלחת תרבות רקמה (או 35 מ 'מ 'תרבות רקמה צלחת) precoated עם 0.1% ג'לטין DPBS.
    10. שנה מדי יום מדי יום.
  3. התרחבות של fibroblasts האדם
    הערה: Fibroblasts מוכנים להיות passaged כדי T25 (25 ס"מ 2 ) בקבוקון תרבות רקמה כאשר 80% confluent ( איור 2 ב ). Fibroblasts בדרך כלל להגיע confluency 80% בתוך 7 ימים. עם זאת, הזמן הנדרש יכול להשתנות במידה רבה, אבל צריך להיות לא יותר מ 4 שבועות.
    1. לשאוב בינוני לשטוף פעם עם 2.5 מ"ל של DPBS.
    2. הסר DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין- EDTA (0.05%) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד לתאים להציג קצוות מעוגלים ולהתחיל לנתק.
    3. הוסף 2 מ"ל של מדיום fibroblast, אם יש צורך לשטוף את התאים הבטחת disassociation תקין של תאים. מעבירים את הפתרון התא לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב XG 300 במשך 3 דקות.
    4. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 5 מ"ל של fibroblast בינוני fibroblasts צלחת בעל מצופה רקמת התא T25 בקבוק. כאשר הרחבת fibroblasts לאחר שלב זה, לנתק כמתואר לעיל זרע 12 x 10 3 תאים / ס"מ 2 .
    5. לאחר תאים confluent מוכנים להיות קפואים, להרחיב או צלחת עבור תכנות מחדש. להקפיא שני סיבובים של fibroblast לפני כל תכנות מחדש הוא התחיל (עיין בסעיף הבא עבור הליך הקפאת). יעילות תכנות מחדש היא בדרך כלל גבוהה יותר עבור fibroblasts מעבר נמוך יותר, תאים במעבר 2 - 4 הוא אופטימלי. עם זאת, תכנות מחדש מוצלח של fibroblasts עד מעבר 10 נעשה באמצעות פרוטוקול זה.
  4. הקפאה והפשרה של fibroblasts
    1. הכן טרי פיברובלסטים טמפרטורה בינונית: 90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO). שמור על 4 מעלות צלזיוס ( טבלה 1 ). לאחר confluent, T25 רקמה תרבות תרבות יכול להיות קפוא לתוך שלושה cryovials. הכן 500 μL של פיברובלסטים בינוני הקפאה לכל בקבוקון קפוא.
    2. כדי להקפיא תאים, לנתק גElls כמתואר בשלב 1.3, לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהעביר חלקים של 3 x 10 5 תאים צינורות 15 מ"ל. ספין צינורות ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב supernatant.
    3. Resuspend תא כדורי 500 μL של 4 ˚C fibroblast הקפאת בינוני ולהעביר cryovials. מניחים את צלוחיות במיכל מקפיא תאים דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת אותם חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    4. כדי להפשיר את התאים, לצלול את החלק התחתון של cryovial ב 37 מעלות צלזיוס מים. לאחר מעובה, להעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום fibroblast. תאים ספין 300 xg במשך 3 דקות.
    5. הסר את supernatant ו resuspend תא גלולה ב 5 מ"ל של מדיום fibroblast. העברת תאים שאינם מצופים T25 רקמה תרבות תרבות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.

2. SEV וקטור תכנות מחדש של פיברובלסטים

  1. הכנה של aliquots וקטור זהירות: ידית את ה - SEV מתחת למיכל הביולוגי. עיין בפרוטוקול היצרן ובהנחיות המקומיות. טמפרטורת הווירוסים משתנה בין קבוצות.
    1. לפני הכנת aliquots לחשב את כמות וקטור הצורך 5 x 10 4 תאים על פי פרוטוקול של היצרן ( למשל , CytoTune 2.0). הווירוס titer בדרך כלל משתנה מ 8 x 10 7 - 1.5 x 10 8 . הפשרה ושילוב וקטורים 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 ו- hKlf4 = משרד הפנים 3). חלק הסכום מחושב עבור תכנות מחדש של 5 x 10 4 תאים לתוך autoclaved 1.5 צינורות מ"ל. לדלל aliquots וירוס עם בינוני fibroblast כדי נפח סופי של 250 μL עבור תכנות מחדש.
      הערה: כל בקבוקון תקף עבור תכנות מחדש של באר אחת של 24 גם צלחת רקמה תרבות עם 5 x 10 4 fibroblasts. חנות aliquots וירוס ב -80 מעלות צלזיוס.
  2. סיומת וקטור
    1. לשאוב תאים cuLture בינוני לשטוף עם 1 מ"ל של DPBS. לשאוב DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין- EDTA (0.05%). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד התאים מנותקים.
    2. הוסף 2 מ"ל של בינוני fibroblast ו resuspend התאים ולהעביר צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה 300 xg במשך 3 דקות.
    3. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 2 מ"ל של מדיום fibroblast.
    4. ספירת fibroblasts באמצעות hemocytometer וזרע 5 x 10 4 תאים היטב אחד של 24 גם צלחת תרבות רקמה. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    5. לשאוב בינוני בתרבית תאים, להוסיף 250 μL של פתרון SEV ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    6. שינוי בינוני מדי יום כדי בינוני fibroblast טריים. אפשר תאים transduced לגדול במשך 7 ימים לפני passaged ל LN-521 צלחות מצופה. הכן LN-521 צלחות יום לפני המעבר. עיין 2.3.1 עבור הליך ציפוי.
  3. החזרת fibroblasts transduced
    1. הכנת LN-521 מנות מצופה: לדלל LN-521 ב DPBS לריכוז סופי של 0.63 מיקרוגרם / 2 ס"מ. פיפטה 2 מ"ל של פתרון LN-521 לכל 60 מ"מ צלחת רקמה תרבות. חותם 60 מ"מ צלחת רקמה תרבות באמצעות parafilm. דגירה לילה ב 4 ° C.
    2. הכן Essential 8 בינוני (E8) aliquots לטיפול קל יותר: 48.5 מ"ל של מדיום E8, 1 מ"ל של E8 בתוספת 500 μL של PEST ( טבלה 1 ).
    3. 7 ימים לאחר התמרה, מעבר התאים LN-521 מצופה 60 מ"מ צלחת רקמה תרבותית. הוסף 250 μL של טריפסין- EDTA (0.05%) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד התאים מנותקים. הוסף 2 מ"ל של fibroblast בינוני תאים צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
    4. לשאוב את supernatant. Resuspend גלולה ב 2 מ"ל של מדיום fibroblast ו לספור תאים hemocytometer. לשאוב LN-521 פתרון מן הצלחת precoated וזרע 4 x 10 4 תאים 5ml של בינוני fibroblast ב LN-521 precoated 60 מ"מ צלחת. הוסף מעכב Rho-kinase Y-27632(ROCKi) לריכוז סופי של 5 מיקרומטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    5. חשוב לציין, למחרת, לשנות בינוני בינוני E8. שנה E8 בינוני מדי יום. מושבות תאים hiPS יגיחו בתוך 2 - 3 שבועות.

3. בחירת מושבות והרחבת תאי HiPS

הערה: השלבים הבאים נעשים מחוץ לארון biosafety תחת מיקרוסקופ סטריאו. השימוש במסכות שיער ומסיכות מומלץ. לעבוד בזהירות לא לזהם את התרבות התא.

  1. הכן LN-521 תרבות רקמה מצופה 24-גם צלחות יום לפני בחירת. מדולל LN-521 ב DPBS 0.63 מיקרוגרם / ס"מ 2 . פיפטה 250 μL של פתרון LN-521 לתוך באר אחת של 24 גם צלחת רקמה תרבות. חותמות צלחות באמצעות parafilm. דגירה לילה ב 4 ° C.
    הערה: המושבות מוכנים להיבחר כאשר הם מגיעים לגודל 1 מ"מ קוטר. המושבות צריך להציג קצוות חדים לגדול הומוגני מוןOlayers ( איור 2 ד ).
  2. לשאוב את הפתרון LN-521 ולהוסיף 500 μL של E8 לתוך באר אחת של 24 גם צלחת רקמה תרבות.
  3. גזור מושבות לחתיכות קטנות יותר עם איזמל ברשת כמו דפוס תחת stereomicroscope. מכני לגרד את הסדינים התא מהצלחת ולהעביר את הסדינים באמצעות פיפטה 200 μL היטב מוכן ( איור 2D -2E ). בחר מושבות לתוך בארות נפרדות.
  4. אפשר תאים לצרף ללא שינוי בינוני עבור 48 שעות. לאחר מכן, לשנות E8 בינוני מדי יום.
  5. כאשר המושבות הגיעו בגודל של 5 מ"מ, תאים אנזימטית המעבר כתאים בודדים לבאר חדשה של צלחת LN-521 מצופה.
  6. לשאוב את התרבות בינוני התא מהתאים לשטוף עם 250 μL של DPBS.
  7. לשאוב DPBS. הוסף 250 μL של מגיב disociation ו דגירה במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  8. שימו לב כי התאים החלו להסתדר. לנתקתאים מן הצלחת על ידי שטיפת התאים עם מגיב ניתוק כמה פעמים.
  9. הוסף 500 μL של מדיום E8 לצינור 15-מ"ל. מעבירים את התאים ריאגנט disociation לצינור צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
  10. לשאוב את הפתרון LN-521 מן LN-521 precoated היטב ולהוסיף 500 μL טמפרטורת החדר E8 בינוני.
  11. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה התא μL 500 של מדיום E8.
  12. ספירת התאים באמצעות hemocytometer וזרע 2.5 x 10 4 - 5 x 10 4 תאים מוכן LN-521 precoated היטב (1.25 x 10 4 - 2.5 x 10 4 תאים / ס"מ 2 ). תבנית התרבות התא יכול בקלות להיות upscaled כדי להתאים את המטרה המיועדת.
  13. הוסף ROCKi לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס.
  14. שנה E8 בינוני מדי יום. תאים בדרך כלל מוכנים לעבור לאחר 4-6 ימים. תאים מעבר אנזימטית כמו תאים בודדים כמתואר לעיל כאשר כ 90% confluent.
    הערה: וקטורים תיכנות מחדש הם מדולל בהדרגה במהלך הרחבת התא hiPS ולא ניתן לגילוי לאחר המעבר 12. תאים שאינם מתוכנתים מחדש באופן נפוץ להפסיק לשגשג סביב מעבר 6-10 או לאבד את האופייני pluripotent תא גזע מורפולוגיה ( איור 3 ב ).
  15. הקפאה והפשרה של תאים hiPS
    1. כדי להקפיא תאים, אנזימטית לנתק תאים כמו תאים בודדים כמתואר לעיל, לספור תאים hemocytometer ולהעביר 2.5 x 10 5 תאים צינור 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מדיום E8. צנטריפוגה ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב את supernatant.
    2. Resuspend תא גלולה μL 250 של 4 ° C cryomedium PSC ולהעביר cryovial. מניחים את הבקבוקון במיכל מקפיא תאים דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת אותם חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    3. כדי להפשיר תאים, להכין מראש LN-521 היטב של תרבות רקמות 24-היטבצלחת על ידי aspirating פתרון LN-521 והוספת 250 μL של E8 בינוני. לצלול את החלק התחתון של cryovial ב 37 מעלות צלזיוס מים עד רק נטיף קטן נשאר.
    4. הוסף 250 μL של E8 בינוני כדי cryovial ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום E8. תאים ספין 300 xg במשך 3 דקות.
    5. הסר את supernatant ו resuspend תא גלולה μL 250 של טמפרטורת החדר E8 בינוני. מעבירים את ההשעיה תא היטב מוכן להוסיף 1% תאי הכדאיות התא או 10 מיקרומטר ROCKi. דגירה צלחת תרבות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מ ביופסיה לתאי hiPS

התהליך כולו מביופסיה לתאי hiPS הוקמה, ברור של וקטור תכנות מחדש מוכן לאפיון, לוקח בערך 16 שבועות ( איור 1 ). ציר זמן מפורט יותר מצוין באיור 2 א . כ 4 שבועות יש צורך להקים ולהרחיב fibroblast תרבויות. מושבות תאים hiPS הראשון התחיל לצאת כשלושה שבועות לאחר התמרה וקטור סנדאי. המושבות נבחרו מכנית עבור המעבר הראשון ולאחר מכן passaged אנזימטית כמו תאים בודדים.

הקמת תרבויות fibroblast האדם

כאשר תרבויות fibroblast האדם גדל כדי confluency והציג מורפולוגיה מקובלת, הם הורחבו לראשונה קפוא עבור שני passagEs לפני להיות מצופה עבור התמרה ( איור 2 ב ).

תכנות מחדש של fibroblasts האדם באמצעות וקטורים SEV

רמות מוגברות של מוות התא נמצאו בימים שלאחר התמרה SeV ושינויים קלים למורפולוגיה fibroblast נצפו. הופעתה של המושבות hiPS הראשון זוהה מיום 12 שלאחר התמרה ( איור 2 א , 2C ). המושבות מוכן להיבחר היו צפויים על שלושה עד ארבעה שבועות שלאחר התמרה ( איור 2 א , 2D ). תאים זורעים בכמויות המפורטות בפרוטוקול זה הביא שפע של מושבות המתעוררים (<20). בחירה סלקטיבית של מושבות המציגות מורפולוגיה חיובית מומלץ. המושבה תכונות העדיפו כלל מרובד תאים קומפקטי שטוח, צמיחה כמו monolayers הומוגנית, אינדי אינדיבידואלית תאים vidual עם קצה חד לכיוון fibroblasts מסביב ( איור 2 ד ). מושבות תאים hiPS נחתכו בתבנית דמוית רשת באמצעות איזמל ו passaged מכנית ( איור 2E ). שיבוטים hiPS שנשארו נותרו במשך 48 שעות כדי לדבוק בצלחת ללא שינוי בינוני. שיבוטים התא hiPS היו הומוגניים מאוד עם זאת כמה fibroblasts שמקורם צלחת תכנות מחדש נסבל במהלך שתי הקטעים הראשונים ( איור 2F ). בחירת המושבות עם הגבולות מטושטש גדולים מסה הטרוגנית מסה גדולה יש להימנע ( איור 2G ). תאי ה- hiPS שהתקבלו גדל כמו monolayers צפופה, עם יחס גדול לגרעין ל- cytoplasm והגדיר גבולות זוהר. לעומת זאת, מושבות שאינן הומוגניות דבקות שלא מילא את הקריטריונים הללו נמחקו ( איור 2H ), כדי למנוע תרבויות של אוכלוסיות תאים מעורבים.

P "fo: לשמור יחד. עם דף =" 1 "> אימות של שיבוטים תא hiPS

אפיון פלוריפוטנטי של תאים נגזרים בוצע לאחר וקטור SEV אבדה ותחזוקה של המדינה pluripotent היה מונע על ידי ביטוי של גורמים אנדוגניים. לפני שתמשיך עם אימות hiPS תא, להבטיח את הביטוי וקטור SeV אבדה. בעקבות פרוטוקול זה, SV וקטור רנ"א כבר לא ניתן לגילוי על ידי מעבר 12 על פי הניסיון שלנו, ובכך נקודת התחלה מתאימה של אפיון ( איור 3 א ). מכתים Immunocytochemistry עבור סמנים pluripotency OCT4, SSEA4 ו NANOG צריך להניב תוצאה חיובית homogenously ( איור 3 ב ). תרבויות תאים המכילים תאים מתוכנתים חלקית שלא ביטאו גורמי גורמי סיכון הושלכו ( איור 3 ג ). ביטוי mRNA של גנים plordipotency אנדוגני מוצג בזמן אמת PC R (RT-PCR) באיור 3D .

תאי גזע Pluripotent צריך להיות מסוגל להבדיל בקלות לתוך שלוש שכבות נבט. פוטנציאל ההבחנה של תאים hiPS הוערך על ידי היווצרות של גופים Embryoid (EB) 18 . חינם EBS צף שנוצר תאים hiPS מוצגים בתרשים 3E ו ביטוי mRNA של שכבת נבט סמנים ספציפיים לאחר 21 ימים של בידול EB מיוצג בתרשים 3F .

איור 1
איור 1: תרשים זרימה מ ביופסיה עור לתאי hiPS.
סקירה כללית של שלבי המפתח בפרוטוקול. האיור כולל אוסף ביופסיה, בידוד fibroblasts, התמרה SeV, בחירת המושבות ואת ההתרחבות המשובשת של תאים hiPS.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2
איור 2: צעדים קריטיים הדור של תאים hiPS.
(א) ציר הזמן הדגשת נקודות זמן חשוב בפרוטוקול כולל ציפוי fibroblast, התמרה SeV, שינויים בינוניים וציפויים. מעבר 12 של תאים hiPS מודגש כנקודת ההתחלה של ניסויים אפיון. (ב) תמונה שדה בהיר של fibroblasts ומחוברות בתרבות עם מורפולוגיה טיפוסית. (ג) הופעתה של מושבות תאים hiPS מ fibroblasts transduced. (D) מוכן לבחור מושבה הצגת תכונות מועדפות, מסה שטוח תאים קומפקטית, תאים בודדים להבדיל עם קצוות חדים לכיוון fibroblasts מסביב (מעבר 0). (E) hiPSמושבות תאים נחתכות בדגם דמוי רשת ומעוברות באופן מכני . (ו) מושבה דבק לאחר כמה ימים של צמיחה. התאים hiPS דבק מוקפים מספר גבוה במיוחד של fibroblasts שמקורם צלחת תכנות מחדש. Fibroblasts ניתן שרטט של הצלחת ויהיה ככל הנראה להיעלם עם מעברים תאים בודדים הבאים (מעבר 1). (G) מושבות המציגות מורפולוגיה שאינה מזכירה תאים מתוכנתים במלואם; גבולות מטומטמים, מסה גדולה הטרוגנית לא מסובכת. (H) תמונה שדה מבריק מדגים קטע מוקדם הומוגני לחלוטין תכנות מחדש hiPS קו התא בהשוואה לקו התא הטרוגני מאוד. פסי סולם מצביעים על 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 איור 3: אפיון של תאים hiPS.
(A) RT-PCR של סמנים ספציפיים וקטורית SeV. תאים hiPS במעבר 3 משמשים שליטה חיובית עבור vectorl תכנות מחדש. במעבר 12 תאים הם שליליים עבור הביטוי של סמנים ספציפיים וירוס סנדאי ספציפיים עמוד השדרה (Sev B), Sendai ספציפיים KLF4 (KLF4 SEV), CMYC ספציפי Sendai (cMYC SEV), בקרת PCR (GAPDH) ולא תבנית (-). (B) דוגמה נציג של תכנות מחדש לחלוטין בתא תא הומוגני הומוגני לחלוטין במעבר 12. שדה שדה בהיר של תאים hiPS לחשוף תאים לגדול monolayers הדוק עם קצוות מוארים חדה עם גרעינים גדולים ציטופלסמה קטנה. מכתים Immunocytochemistry של סמנים pluripotency OCT4, NANOG, SSEA4, מכתים גרעיני 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) הוכחת ביטוי חיובי הומוגנית. (ג) קו סלולרי המציג ביטוי הטרוגני סמן pluripotency NANOG. התרבותE מכיל תאים מתוכנתים חלקית ויש להשליך אותם. (D) RT-PCR של ביטוי mRNA של סמנים pluripotency NANOG, OCT4, בקרת PCR (GAPDH) ולא תבנית (-) המציין את הביטוי של סמנים pluripotency. (E) חינם גופים עוברים צף שנוצר תאים hiPS. (F) RT-PCR לאחר 21 ימים של דיפרנציאציה הגוף העובר להראות כי נגזר תאים hiPS מסוגלים להבדיל את שלוש שכבות נבט. סמנים endodermal AFP ו GATA4, סמנים mesodermal RUNX ו HAND1, סמנים ectodermal NCAM ו NESTIN, בקרת PCR (GAPDH) ולא תבנית (-). פסי סולם מצביעים על 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התוצאה הצפויה של פרוטוקול זה הוא הדור המוצלח של מספר שורות תאים hiPS הנגזר clonally. חשוב לציין, השיטה לתחזוקה של הרחבת תאים hiPS הוקמה כאן המתואר הוא אמין יכול להתבצע עם ניסיון מוקדם מעט של תרבות תא גזע. אנזימטית תא יחיד passaging עם ROCKi יחד עם מטריקס LN-521 ידוע לשמור תאים כמו נורמלי karyotypically, pluripotent ובקלות מסוגל להבדיל תוך הימנעות הטרוגניות המושרה כי המושבה מבוסס passaging יכול לעורר 10 , 19 , 20 . תאים hiPS מתורבת על LN-521 ניתן passaged כמו תאים בודדים ללא תוספת של ROCKi 10 , תוספת של ROCKi עושה זאת להפוך את הפרוטוקול קל יותר עבור מנוסים פחות מנוסה ומקטין את הזמן הדרוש עבור הגזירה hips תא.

יעילות תכנות מחדש היא geNerally לא בעיה עם פרוטוקול זה; SEV וקטורים יש יעילות גבוהה יחסית תכנות מחדש> 1% עבור fibroblasts 11 . הופעתה של שפע של מושבות (<20) צפויה. מומלץ לבחור פי שלושה במספר המושבות הדרושות. זה כבר ציין כי חלק שיבוטים הרים להיכשל לדבוק לאחר קטיף. מושבות נוספות יכול גם להיות נחוץ כדי לפצות על מושבות מחדש מחדש חלקית. מושבות מתוכנות חלקית הן מסוגלות לדבוק ולגדול על ידי ביטוי אקסוגני של גנים מסוג pluripotency על ידי וקטורים SEV. כמו וקטורים SEV הם מדולל, תאים אלה יפסיקו להתרבות ו לנתק, בדרך כלל נראה סביב מעבר 6-8. ההטרוגניות של התרבות היא גם סימן של תכנות מחדש חלקי קווים הטרוגניים יש להשליך ( איור 2H ).

הבחירה האופטימלית של תכנות מחדש וקטור התנאים התרבות תלויההמטרה של התאים שנוצר. עם זאת, כדי למנוע סטיות אצווה אל אצווה להשפיע על התוצאות, מומלץ להגדיר תנאים מוגדרים. הבחירה של מערכת וקטורית לא משולבת מוצעת כדי לשמור על שלמות הגנום של תאים מתוכנתים. SEV וקטורים נבחרו בפרוטוקול זה בשל החוסן, יעילות גבוהה יחסית וידיים נמוך בזמן הנדרש. ווקטורים SEV הם דילול במהלך חטיבות התא ולא ניתן להבחין סביב מעבר 12, ובכך להבטיח כי הנתונים שנוצר אינו מושפע ביטוי אקסוגני. בגלל הדרישות קפדנית לשים על תאים המיועדים למטרות קליניות, תכנות מחדש SeV יכול להיות מחסום לתרגום הקליני מאז הוכחת השילה המלא של כל החומר וקטור קשה. MRNA בתיווך בתיווך יכול להיות יתרון אם להפיק תאים עם השימוש המיועד טיפולים התא 12 . שיטות אלה הן הרבה יותר עבודה אינטנסיבית ויותר מסובך להשתמש 21 . השיטה כאן דהשכתב עבור תרבות fibroblast אינו מתאים גם עבור יישומים קליניים. כמו שניהם FBS ו ג 'לטין הם xenogeneic ו לא מוגדר, שקול לעבור אלה מוגדרים מוצרים ללא xno 22 .

טכניקות טיפול סטריליות בדיקות זיהום mycoplasma רגיל מומלץ בעת עבודה עם כל צורה של תרבות התא. העור האנושי מכיל מיקרואורגניזמים רבים שיכולים לשגשג בתנאים תאים מתורבתים אם לא מטופלים כראוי. לכן מומלץ להיות ערניים יותר בטיפול ביופסיות עור ובימים הראשונים של התרבות לאחר עיבוד ביופסיה. הקמת התרבות fibroblast מביופסיות העור הוא, אכן, תהליך רב זמן. לאחר עיבוד ביופסיה של העור, יהיו בתחילה סימנים חלשים של תאים fibroblast דבקות, לחכות לפחות שבוע אחד כדי למצוא כמה תאים fibroblast הצגת מורפולוגיה הצפויה בתרבות. הזמן הדרוש להקמת fibroblastsבתרבויות חוץ גופית מביופסיות תלוי במגוון גורמים, כולל גודל הביופסיה, גיל התורם וכיצד הביופסיה מטופלת מאז נלקחה. זה העדיף לתכנת מחדש fibroblasts המעבר מוקדם עבור יעילות תכנות מחדש אופטימלי 23 .

לסיכום, אנו כאן לתאר שיטה מבוססת וקל לשימוש הוקמה עבור תאים hiPS הומוגניות מאוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לדווח.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי SSF (B13-0074) וסוכני מימון של VINNOVA (2016-04134).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 125 תאים אנושיים המושרשים בתאי גזע תכנות מחדש סנדאי וירוסים Fibroblasts ללא Xeno מוגדרים כימית Laminin רקומביננטי אנושי 521
אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uhlin, E., Marin Navarro, A.,… More

Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter