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Developmental Biology

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56146
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

Summary

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Abstract

Xeno-freie und vollständig definierte Bedingungen sind Schlüsselparameter für eine robuste und reproduzierbare Erzeugung von homogenen human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS). Die Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen auf Feeder-Zellen oder undefinierten Matrizen ist anfällig für Charge-Varianzen, pathogene Kontamination und Immunogenitätsgefahr. Die Verwendung der definierten rekombinanten humanen Laminin 521 (LN-521) -Matrix in Kombination mit xenofreien und definierten Medienformulierungen reduziert die Variabilität und ermöglicht die gleichmäßige Erzeugung von hiPS-Zellen. Der Sendai-Virus (SeV) -Vektor ist ein nicht-integrierendes RNA-basiertes System, wodurch Umstände vermieden werden, die mit dem potentiellen störenden Effekt auf die Integrationsvektoren der Genomintegrität verbunden sind. Darüber hinaus haben diese Vektoren eine relativ hohe Effizienz bei der Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten gezeigt. Darüber hinaus ermöglicht die enzymatische Einzelzell-Passage von Zellen eine homogene Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen ohne wesentliche Vorkenntnisse von StammzellenKultur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das umfangreich getestet und mit einem Fokus auf Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit entwickelt wurde, was eine robuste und praktische Möglichkeit zur Erzeugung definierter und xenofreier menschlicher HiPS-Zellen aus Fibroblasten bietet.

Introduction

Da die erste Ableitung von hiPS-Zelllinien von Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-Zellen haben ein nützliches Werkzeug für die Krankheitsmodellierung, die Wirkstoffforschung und als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von Zelltherapien in der regenerativen Medizin bereitgestellt 3 . Die hiPS-Zellkultur ist seit langem auf Co-Kultur mit Fibroblasten-Feeder-Zellen 4 , 5 oder auf Matrigel 6 und mit Medienformulierungen, die fötales Rinderserum (FBS) enthalten, abhängig. Batch-to-Batch-Varianzen sind eine häufige Konsequenz der undefinierten Natur dieser Kulturbedingungen, was zu unvorhersehbaren Variationen führt, was einen wesentlichen Beitrag zur Unzuverlässigkeit dieser Protokolle gibt 7 Die Entwicklung eines definierten Mediums wie zB essentielle 8 (E8) 8 und definierte Zellkulturmatrizen zum Beispiel LN-521 9 erlauben esS für die Etablierung hochreproduzierbarer Protokolle und Unterstützung bei der robusten Erzeugung und Pflege von homogenen HiFi Zellen 7 , 8 , 9 , 10 .

Entwicklung von integrationsfreien Umprogrammierungstechniken war ein Sprung nach vorne. Ursprünglich hing die Neuprogrammierung von retroviralen Vektoren ab, die zufällig in das Genom integriert wurden, mit störenden Auswirkungen auf die genomische Integrität 11 . Fortschritte bei der Reprogrammierung von Methoden umfassen die Entwicklung von RNA-basierten Vektoren. RNA-Vektoren haben einen Vorteil gegenüber der DNA-basierten Reprogrammierungsmethode, da eine unbeabsichtigte Integration durch genomische Rekombination nicht möglich ist 12 . SeV-Vektoren liefern eine hohe und transiente Expression exogener Faktoren durch einzelsträngige RNA ohne DNA-Phase 11 . Die von der SeV gelieferten UmprogrammierungsvektorenSind in der Zellexpansion verdünnt und scheiden schließlich aus der Kultur, die einen fußabdruckfreien Weg zur Umprogrammierung bietet. Danach ist die Aufrechterhaltung der Pluripotenz abhängig von der endogenen Expression der Pluripotenzgene 2 .

Als bahnbrechende hiPS-zellbasierte Therapien beginnen sich in klinische Studien zu bewegen, die Anforderungen an standardisierte Chargen, Reproduzierbarkeit und Sicherheit sind wesentliche Fragen, um 13 zu adressieren. Daher sollten Produkte tierischen Ursprungs vermieden werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von xenogenen Produkten mit dem Risiko einer nichtmenschlichen Pathogenkontamination verbunden. Auch Zellen, die in Gegenwart von tierischen Kulturkomponenten kultiviert wurden, haben gezeigt, dass sie nichtmenschliche Silicasäuren in Zellmembranen einfließen, die drohende, abgeleitete Zellen immunogen zu machen 14 . Daher ist die Notwendigkeit, xenogene Produkte zu eliminieren, notwendig für zukünftige klinische Aktivitäten. Dieses Protokoll gilt für xeNicht-freie und definierte Kultur in der Aufrechterhaltung von hiPS-Zellen, die Zellen näher an klinische Compliance bewegen.

Dieses Protokoll beschreibt eine konsistente, hoch reproduzierbare und einfach zu bedienende Methode, die standardisierte HiPS-Zellen aus Fibroblasten erzeugt. Es bietet auch ein benutzerfreundliches Kultursystem für die Wartung von etablierten Hallo-Zellen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um mehr als 300 hiPS Zelllinien in der schwedischen nationalen menschlichen iPS Core-Anlage am Karolinska Institutet abzuleiten, von denen einige Zeilen zuvor beschrieben wurden 15 , 16 .

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Protocol

Die Sammlung von Patientengaterial und Ableitung von hiPS-Zellen wird vom Ethics Review Board, Stockholm, 28. März 2012, Registrierungsnummer: 2012 / 208-31 / 3 genehmigt. Zellkulturschritte sollten in Biosicherheitsschränken durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Bei der Arbeit mit Zellen immer sterile Handhabungstechniken durchführen. Medien, Platten und Reagenzien vor dem Start auf Raumtemperatur bringen lassen. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 bei hoher Feuchtigkeit.

1. Isolierung von menschlichen Fibroblasten aus der Dermalbiopsie

  1. Zubereitungen von Kulturmedium, Verdauungsenzyme, Beschichten von Geschirr und Sezierwerkzeugen.
    1. Bereiten Sie das Fibroblastenmedium vor: 44,5 ml Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM), 5 ml Fetales Rinderserum (FBS) und 500 μl Penicillin / Streptomycin (PEST) (siehe Tabelle 1 ), bei 4 ° C aufbewahren.
    2. Bereiten Sie Verdauungsenzyme bei einer Arbeitskonzentration von 1 mg / ml vor: weiGh Aliquots von 4 mg Dispase und Kollagenase Typ I Pulver in separaten 15-ml-Röhrchen und lösen sich in 4 ml DMEM / F12 + 1% PEST. Sterilisieren der enzymatischen Lösung durch Durchleiten durch ein 0,22 μm Sieb. Bereiten Sie frische Enzymlösungen jedes Mal vor.
    3. In einer 6-Well-Gewebekulturplatte (oder einer 35-mm-Gewebekulturschale) pro Biopsie, die mit 1 ml 0,1% iger Gelatine in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) seziert wurde, Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
    4. Autoklav ein Satz chirurgische Schere und Pinzette pro Biopsie für die Sektion.
  2. Biopsiebehandlung
    HINWEIS: Prozess Biopsien so schnell wie möglich nach der Aufnahme. In PBS + 1% PEST für bis zu 48 h bei 4 ° C aufbewahren. Biopsie sollte 2 - 4 mm im Durchmesser in Größe und in Übereinstimmung mit ethischen Genehmigungen.
    1. Übertragen Sie die Biopsie in eine 35-mm-Schale. Die Biopsie auf eine neue 35-mm-Schale geben und die Biopsie in 2 ml 70% igem Ethanol für 30 s eintauchen.
    2. Die Biopsie auf ein Drittel bringen35-mm-Schale und waschen mit 1 ml steriler Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), ergänzt mit 1% PEST.
    3. Übertragen Sie die Biopsie auf eine vierte 35-mm-Schale, fügen Sie 1 ml frisch zubereitete 0,1% Disposelösung hinzu.
    4. Schneiden Sie die Hautbiopsie in 1 - 2 mm 3 Stücke in der Schale mit chirurgischen Scheren und Pinzette und übertragen Sie dann Biopsie Stücke einschließlich der Dispase-Lösung in ein 15-ml-Rohr. Füge weitere 2 mL Disposition hinzu.
    5. Spülen Sie die 35-mm-Schale mit einer 1 mL Disposelösung und überführen Sie sie auf das 15-ml-Röhrchen.
    6. Inkubieren Sie die Biopsie bei 4 ° C über Nacht.
    7. 4 ml 0,1% Collagenase I zu dem Röhrchen geben und bei 37 ° C für 4 h inkubieren.
    8. Die verdauten Zellen 300 xg für 3 min zentrifugieren, den Überstand absaugen und den Digest in 2 ml Fibroblastenmedium resuspendieren.
    9. Entfernen Sie die Gelatinelösung aus der 6-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die Zellsuspension einschließlich aller verbleibenden Stücke auf 6-Well-Gewebekulturplatte (oder 35-mM Gewebekulturschale), die mit 0,1% Gelatine in DPBS vorbeschichtet wurde
    10. Ändere das Medium jeden dritten Tag.
  3. Erweiterung der menschlichen Fibroblasten
    HINWEIS: Fibroblasten sind bereit, an einen T25 (25 cm 2 ) Gewebekulturkolben passiert zu werden, wenn 80% konfluent sind ( Abbildung 2B ). Fibroblasten erreichen in der Regel 80% Konfluenz innerhalb von 7 Tagen. Allerdings kann die Zeitaufwand stark variieren, sollte aber nicht länger als 4 Wochen sein.
    1. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie es einmal mit 2,5 ml DPBS.
    2. Entfernen Sie DPBS und fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%) hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 5 min oder bis die Zellen abgerundete Kanten zeigen und beginnen, sich zu lösen.
    3. Füge 2 ml Fibroblasten-Medium hinzu, ggf. spülen die Zellen, um eine ordnungsgemäße Zerlegung von Zellen zu gewährleisten. Übertragen Sie die Zelllösung auf ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 xg für 3 min.
    4. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 5 ml Fibroblastenmedium und Plattenfibroblasten in einem resuspendierenAuf-beschichtete Zellgewebekultur T25-Kolben. Beim Aufweiten von Fibroblasten nach diesem Schritt dissoziieren wie oben beschrieben und Saatgut 12 x 10 3 Zellen / cm 2 .
    5. Sobald konfluierende Zellen bereit sind, eingefroren zu werden, erweitern oder platten für die Umprogrammierung. Gefrieren Sie zwei Runden Fibroblasten, bevor eine Neuprogrammierung gestartet wird (siehe nächster Abschnitt zum Einfrieren). Die Umprogrammierungseffizienz ist bei niedrigeren Durchgangsfibroblasten im Allgemeinen höher, die Zellen am Durchgang 2 - 4 sind optimal. Jedoch wurde eine erfolgreiche Neuprogrammierung von Fibroblasten bis zum Durchgang 10 unter Verwendung dieses Protokolls durchgeführt.
  4. Einfrieren und Auftauen von Fibroblasten
    1. Frohes Fibroblasten-Gefriermedium vorbereiten: 90% FBS + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Bei 4 ° C aufbewahren ( Tabelle 1 ). Einmal konfluent, kann der T25 Gewebekulturkolben in drei Kryovials eingefroren werden. 500 μl Fibroblasten-Gefriermedium pro Vial gefroren
    2. Um Zellen zu frieren, dissoziiere cElls, wie in Schritt 1.3 beschrieben, Zählzellen unter Verwendung eines Hämocytometers und Transferabschnitte von 3 x 10 & sup5; Zellen zu 15-ml-Röhrchen. Spinnröhrchen bei 300 xg für 3 min. Absaugen des Überstandes
    3. Restenz von Zellpellets in 500 & mgr; l 4 & mgr; C Fibroblasten-Gefriermedium und Transfer in Kryovials. Legen Sie die Fläschchen in einen Gefrierbehälter und inkubieren Sie die Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, bevor Sie sie auf flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung übertragen.
    4. Um die Zellen aufzutauen, tauchen Sie den unteren Teil des Kryovials in 37 ° C Wasser ein. Nach der Verflüssigung die Zellsuspension auf ein 15-ml-Röhrchen überführen und 5 ml Fibroblasten-Medium zugeben. Spin-Zellen 300 xg für 3 min.
    5. Den Überstand entfernen und das Zellpellet in 5 ml Fibroblastenmedium resuspendieren. Die Zellen in einen nicht beschichteten T25-Gewebekulturkolben überführen und in 37 ° C inkubieren.

2. SeV-Vektor-Umprogrammierung von Fibroblasten

  1. Vorbereitung von Vektoraliquots ACHTUNG: Handhabung des SeV unter Biosicherheitsstufe 2. Siehe Protokoll des Herstellers und lokale Richtlinien 17 . Der Virustiter variiert zwischen den Chargen.
    1. Vor der Vorbereitung von Aliquoten berechnen Sie die für 5 x 10 4 Zellen benötigte Vektormenge nach dem Protokoll des Herstellers ( zB CytoTune 2.0). Der Virustiter variiert im Allgemeinen von 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Tauen und kombinieren Vektoren 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 und hKlf4 = MOI 3). Portion die für die Umprogrammierung von 5 x 10 4 Zellen berechnete Menge in autoklavierte 1,5 mL Röhrchen. Verdünnen Sie Virusaliquots mit Fibroblasten-Medium bis zu einem Endvolumen von 250 μl für die Umprogrammierung.
      HINWEIS: Jede Durchstechflasche gilt für die Umprogrammierung einer Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 5 x 10 4 Fibroblasten. Bewahren Sie Virusaliquots bei -80 ° C auf.
  2. SeV-Vektor-Transduktion
    1. Aspirate Zelle cuLture medium und waschen mit 1 mL DPBS. Aspiration von DPBS und Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%). Inkubieren bei 37 ° C für 5 min oder bis die Zellen abgelöst sind.
    2. 2 ml Fibroblasten-Medium zugeben und die Zellen resuspendieren und in ein 15-ml-Röhrchen überführen. Zentrifuge 300 xg für 3 min.
    3. Den Überstand absaugen und das Pellet in 2 ml Fibroblastenmedium resuspendieren.
    4. Zählen Sie Fibroblasten unter Verwendung eines Hämocytometers und Samen 5 x 10 4 Zellen in einer Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C über Nacht.
    5. Das Zellkulturmedium einatmen, 250 μl der SeV-Lösung zugeben und bei 37 ° C über Nacht inkubieren.
    6. Wechsel täglich täglich zum frischen Fibroblasten-Medium. Lassen Sie transduzierte Zellen 7 Tage lang wachsen, bevor Sie mit LN-521 beschichteten Platten passagiert werden. Bereiten Sie LN-521 Platten am Tag vor Passage vor. Siehe 2.3.1 für Beschichtungsverfahren.
  3. Umwandlung von transduzierten Fibroblasten
    1. Herstellung von LN-521 beschichtete Schalen: LN-521 in DPBS bis zu einer Endkonzentration von 0,63 μg / cm 2 verdünnen. 2 ml der LN-521-Lösung pro 60-mm-Gewebekulturschale pipettieren. Die 60-mm-Gewebekulturschale mit Parafilm versiegeln. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
    2. Bereiten Sie essentielle 8 Medium (E8) Aliquots für eine leichtere Handhabung vor: 48,5 ml E8-Medium, 1 ml E8-Supplement und 500 μl PEST ( Tabelle 1 ).
    3. 7 Tage nach der Transduktion die Zellen zu einer LN-521 beschichteten 60 mm Gewebekulturschale überführen. Füge 250 μl Trypsin-EDTA (0,05%) hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 5 min oder bis die Zellen abgelöst sind. 2 ml Fibroblasten-Medium zugeben und 3 min bei 300 x g zentrifugieren.
    4. Sauge den Überstand. Pellet in 2 ml Fibroblastenmedium resuspendieren und Zellen in einem Hämocytometer zählen. LN-521-Lösung aus der vorbeschichteten Platte und Saatgut 4 x 10 4 Zellen in 5 ml Fibroblasten-Medium in die LN-521 vorbeschichtete 60 mm Schale geben. Füge den Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 hinzu(ROCKi) bis zu einer Endkonzentration von 5 μM. Inkubieren in 37 ° C über Nacht.
    5. Wichtig, am nächsten Tag, wechsle das Medium zum E8-Medium. E8 mittel täglich wechseln HiPS Zellkolonien entstehen innerhalb von 2 - 3 Wochen.

3. Kommissionierung von Kolonien und Erweiterung von hiPS Zellen

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden außerhalb des Biosicherheitskabinetts unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Die Verwendung von Haarnetz- und Verfahrensmasken wird empfohlen. Arbeiten Sie sorgfältig nicht, um die Zellkultur zu kontaminieren.

  1. Bereiten Sie LN-521 beschichtete Gewebekultur 24-Well-Platten am Tag vor der Kommissionierung vor. Verdünnen Sie LN-521 in DPBS 0,63 μg / cm 2 . Pipettieren Sie 250 μl der LN-521-Lösung in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Dichtungsplatten mit Parafilm. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
    ANMERKUNG: Kolonien sind bereit, abgeholt zu werden, wenn sie eine Größe> 1 mm im Durchmesser erreichen. Kolonien sollten scharfe Kanten und wachsen in homogenen MonOlayers ( Abbildung 2D ).
  2. Ansaugen der LN-521-Lösung und Zugabe von 500 μl E8 in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte.
  3. Schneiden Sie Kolonien in kleinere Stücke mit einem Skalpell in einem Raster wie Muster unter einem Stereomikroskop. Mechanische Kratzen der Zellfolien aus der Schale und Übertragen der Blätter unter Verwendung einer 200 & mgr ; l Pipette auf die vorbereitete Vertiefung ( 2D- 2E ). Wähle Kolonien in getrennte Brunnen.
  4. Erlaube Zellen, ohne das Medium für 48 h zu wechseln. Danach wechseln Sie täglich E8.
  5. Wenn die Kolonien eine Größe von> 5 mm erreicht haben, enzymatisch Durchgangszellen als einzelne Zellen zu einer neuen Vertiefung einer LN-521 beschichteten Platte.
  6. Das Zellkulturmedium aus den Zellen absaugen und mit 250 μl DPBS waschen.
  7. Aspirieren Sie DPBS. Füge 250 μl Dissoziationsreagenz hinzu und inkubiere für 3 min bei 37 ° C.
  8. Beachten Sie, dass die Zellen begonnen haben, sich zu runden. AblösenZellen aus der Platte durch Spülen der Zellen mit Dissoziationsreagenz ein paar Mal.
  9. Füge 500 μl E8-Medium zu einem 15-ml-Röhrchen hinzu. Die Zellen in das Dissoziationsreagenz in das Röhrchen überführen und 3 min bei 300 x g zentrifugieren.
  10. Die LN-521-Lösung aus der LN-521-Vorbeschichtung aufnehmen und 500 μl Raumtemperatur-E8-Medium hinzufügen.
  11. Den Überstand absaugen und das Zellpellet in 500 μl E8-Medium resuspendieren.
  12. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und Samen 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 Zellen in der vorbereiteten LN-521 vorbeschichteten Vertiefung (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 Zellen / cm 2 ). Das Zellkulturformat lässt sich problemlos auf den vorgesehenen Zweck skalieren.
  13. Füge ROCKi zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzu. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C.
  14. E8 mittel täglich wechseln Die Zellen sind in der Regel nach 4 - 6 Tagen fertig. Enzymatische Passagen von Zellen als einzelne Zellen, wie oben beschrieben, wenn etwa 90% konfluent.
    ANMERKUNG: Die Umprogrammierungsvektoren werden während der Hochwasserschutzerweiterung fortschreitend verdünnt und nach dem Durchgang nicht nachweisbar. Zellen, die unparteiisch neu programmiert werden, treten häufig nicht auf, um die Passage 6 - 10 zu vermehren oder ihre charakteristische pluripotenten Stammzellmorphologie zu verlieren ( Abbildung 3B ).
  15. Einfrieren und Auftauen von Hifi-Zellen
    1. Um Zellen zu frieren, enzymatisch Zellen als einzelne Zellen wie oben beschrieben dissoziieren, Zellen in einem Hämocytometer zählen und 2,5 x 10 & sup5; Zellen in ein 15-ml-Röhrchen geben, das 1 ml E8-Medium enthält. Zentrifuge bei 300 xg für 3 min. Sauge den Überstand.
    2. Restenz von Zellpellets in 250 μl 4 ° C PSC Kryomedium und Transfer zu einem Kryovial. Legen Sie die Durchstechflasche in einen Gefrierbehälter und inkubieren Sie die Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, bevor Sie sie auf flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung übertragen.
    3. Um die Zellen aufzutauen, wird eine vorbeschichtete LN-521-Vertiefung einer 24-Well-Gewebekultur hergestelltPlatte durch Ansaugen der LN-521-Lösung und Zugabe von 250 & mgr; l E8-Medium. Tauchen Sie den unteren Teil des Kryovials in 37 ° C Wasser, bis nur ein kleiner Eiszapfen bleibt.
    4. Füge 250 μl E8-Medium in die Kryoviale ein und transferiere die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und füge 1 ml E8-Medium zu. Spin-Zellen 300 xg für 3 min.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 μl Raumtemperatur E8 Medium. Übertragen Sie die Zellsuspension auf die vorbereitete Vertiefung und fügen Sie 1% Zelllebensfähigkeitsergänzung oder 10 μM ROCKi hinzu. Inkubieren Sie die Gewebekulturplatte bei 37 ° C.

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Representative Results

Von der Biopsie zu den hiPS Zellen

Der gesamte Prozess von der Biopsie bis zu etablierten Hallo-Zellen, frei von Umprogrammierungsvektor und bereit zur Charakterisierung, dauert etwa 16 Wochen ( Abbildung 1 ). Eine detailliertere Zeitleiste ist in Abbildung 2A angegeben . Etwa 4 Wochen sind erforderlich, um Fibroblasten-Kulturen zu etablieren und zu erweitern. Die ersten hiPS-Zellkolonien begannen, etwa drei Wochen nach Sendai-Vektor-Transduktion aufzutreten. Kolonien wurden mechanisch für die erste Passage ausgewählt und dann enzymatisch als einzelne Zellen passagiert.

Etablierung von menschlichen Fibroblasten-Kulturen

Als die menschlichen Fibroblasten-Kulturen zu Konflikten gewachsen waren und eine akzeptierte Morphologie zeigten, wurden sie zuerst erweitert und für zwei Passagiere eingefrorenBevor sie für die Transduktion plattiert wurden ( Abbildung 2B ).

Neuprogrammierung von menschlichen Fibroblasten mit SeV-Vektoren

In den Tagen nach der SeV-Transduktion wurden erhöhte Zelltod beobachtet und es wurden geringfügige Veränderungen der Fibroblasten-Morphologie beobachtet. Die Emergenz der ersten hiPS-Kolonien wurde von Tag 12 nach der Transduktion nachgewiesen ( Abbildung 2A , 2C ). Kolonien, die bereit sind, ausgewählt zu werden, wurden etwa drei bis 4 Wochen nach der Transduktion erwartet ( Abbildung 2A , 2D ). Die Seeding-Zellen in den in diesem Protokoll angegebenen Mengen führten zu einer Fülle von Kolonien (<20). Die selektive Kommissionierung von Kolonien, die die günstige Morphologie zeigt, wird empfohlen. Kolonie-Merkmale bevorzugte abgeflachte kompakte Zellen Masse, Wachstum als homogene Monolagen, unterscheidbare indi Vidualen Zellen mit scharfer Kante zu umgebenden Fibroblasten ( Abbildung 2D ). Die hiPS-Zellkolonien wurden in einem gitterartigen Muster mit einem Skalpell geschnitten und mechanisch passagiert ( Abbildung 2E ). Ausgewählte hiPS Klone wurden für 48 Stunden gelassen, um an der Platte ohne mittlere Veränderung zu haften. HiPS-Zellklone waren sehr homogen, jedoch wurden nur wenige Fibroblasten, die aus der Umprogrammierungsplatte stammen, während der ersten beiden Passagen toleriert ( Abbildung 2F ). Die Auswahl von Kolonien mit fussy Rändern und große unkompakte heterogene Zellmasse sollte vermieden werden ( Abbildung 2G ). Erhaltene hiPS-Zelllinien wuchsen als dichte Monolagen, mit großem Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis und hatten Lumineszenz-Grenzen definiert. Im Gegensatz dazu wurden adhärierte nicht homogene Kolonien, die diese Kriterien nicht erfüllen, verworfen ( Abbildung 2H ), um Kulturen von gemischten Zellpopulationen zu vermeiden.

P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Validierung von hiPS-Zellklonen

Die Pluripotenzcharakterisierung der abgeleiteten Zellen wurde nach dem Verlust des SeV-Vektors durchgeführt und die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands wurde durch die Expression endogener Faktoren bestimmt. Bevor Sie mit der HiPS-Zellen-Validierung fortfahren, stellen Sie sicher, dass der SeV-Vektor-Ausdruck verloren gegangen ist. Nach diesem Protokoll ist die SeV-Vektor-RNA nicht mehr durch den Durchgang 12 nach unserer Erfahrung nachweisbar, also ein geeigneter Ausgangspunkt der Charakterisierung ( Abbildung 3A ). Immunzytochemie-Färbung für Pluripotenzmarker OCT4, SSEA4 und NANOG sollte ein homogen positives Ergebnis liefern ( Abbildung 3B ). Zellkulturen, die teilweise umprogrammierte Zellen enthielten, die keine Pluripotenzfaktoren exprimierten, wurden verworfen ( Fig. 3C ). Die mRNA-Expression von endogenen Pluripotenzgenen wird durch Echtzeit-PC gezeigt R (RT-PCR) in Abbildung 3D .

Pluripotenten Stammzellen sollten leicht in die drei Keimschichten differenzieren können. HiPS-Zellen-Differenzierungspotential wurde durch Bildung von Embryoidkörpern (EB) 18 bestimmt . Freie schwebende EBs, die aus hiPS-Zellen erzeugt wurden, sind in 3E gezeigt, und die mRNA-Expression von Keimschicht-spezifischen Markern nach 21 Tagen EB-Differenzierung ist in 3F dargestellt .

Abbildung 1
Abbildung 1: Flussdiagramm von Hautbiopsie zu hiPS Zellen.
Überblick über die wichtigsten Schritte im Protokoll. Die Illustration beinhaltet die Biopsiesammlung, die Isolierung von Fibroblasten, die SeV-Transduktion, die Kartonierung der Kolonien und die klonale Ausdehnung von hiPS-Zellen.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Kritische Schritte bei der Erzeugung von HiFi-Zellen.
(A) Timeline, die wichtige Zeitpunkte im Protokoll einschließlich Fibroblast-Beschichtung, SeV-Transduktion, mittlere Veränderungen und Beschichtungen hervorhebt. Passage 12 von hiPS Zellen wird als der Beginn der Charakterisierung Experimente hervorgehoben. (B) Helles Feldbild von konfluenten Fibroblasten in Kultur mit typischer Morphologie. (C) Entstehung von hiPS-Zellkolonien aus transduzierten Fibroblasten. (D) Bereit zum Aufnehmen von Kolonie mit Präferenzmerkmalen, abgeflachte Kompaktzellenmasse, unterscheidbare Einzelzellen mit scharfen Kanten zu umgebenden Fibroblasten (Passage 0). (E) hiPSZellkolonien werden in einem gitterartigen Muster geschnitten und mechanisch passagiert . (F) Adhärische Kolonie nach ein paar Tagen Wachstum Die anhaftenden hiPS-Zellen sind von einer ungewöhnlich hohen Anzahl von Fibroblasten umgeben, die aus der Umprogrammierungsplatte stammen. Die Fibroblasten können von der Platte abgeschabt werden und werden höchstwahrscheinlich mit nachfolgenden Einzelzellenpassagen verschwinden (Passage 1). (G) Kolonien, die die Morphologie zeigen, die nicht an vollständig umprogrammierte Zellen erinnert; Fussy Grenzen, große unkompakte heterogene Zellmasse. (H) Helles Feldbild, das eine frühe Durchlauf-homogene vollständig umprogrammierte hiPS-Zelllinie veranschaulicht, verglichen mit einer sehr heterogenen Zelllinie. Maßstäbe zeigen 100 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3 Abbildung 3: Charakterisierung von hallo-Zellen.
(A) RT-PCR von SeV-Vektorspezifischen Markern. HiPS-Zellen am Durchgang 3 werden als Positivkontrolle für die Umprogrammierungsvektoren verwendet. Bei Passage 12 sind die Zellen negativ für die Expression von virusspezifischen Markern Sendai spezifisches Backbone (SeV B), Sendai spezifisches KLF4 (KLF4 SeV), Sendai spezifisches cMYC (cMYC SeV), PCR Kontrolle (GAPDH) und keine Vorlage (-). (B) Repräsentatives Beispiel für vollständig umprogrammierte homogene hiPS-Zelllinie bei Durchgang 12. Helle Feldbild von hiPS-Zellen zeigt, dass Zellen in engen Monoschichten mit scharfen Lumineszenkanten und mit großen Kernen und kleinem Zytoplasma wachsen. Immunzytochemie-Färbung der Pluripotenzmarker OCT4, NANOG, SSEA4 und Kernfärbung 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), die eine homogene positive Expression zeigt. (C) Zelllinie, die eine heterogene Expression für den Pluripotenzmarker NANOG aufweist. Die KulturE enthält teilweise umprogrammierte Zellen und sollte verworfen werden. (D) RT-PCR der mRNA-Expression von Pluripotenzmarkern NANOG, OCT4, PCR-Kontrolle (GAPDH) und keine Template (-), die die Expression von Pluripotenzmarkern angibt. (E) Freie schwimmende Embryoidkörper, die aus HiPS-Zellen erzeugt werden. (F) RT-PCR nach 21 Tagen Embryoid-Körperdifferenzierung zeigen, dass abgeleitete hiPS-Zellen in der Lage sind, die drei Keimschichten zu differenzieren. Endodermale Marker AFP und GATA4, mesodermale Marker RUNX und HAND1, ektodermale Marker NCAM und NESTIN, PCR Steuerung (GAPDH) und keine Vorlage (-). Maßstäbe zeigen 100 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche Erzeugung von mehreren klonal abgeleiteten hiPS-Zelllinien. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Methode zur Aufrechterhaltung und Erweiterung der etablierten hiPS-Zellen zuverlässig ist und mit wenig vorheriger Erfahrung der Stammzellkultur durchgeführt werden kann. Die enzymatische Einzelzell-Passage mit ROCKi zusammen mit der LN-521-Matrix ist bekannt, um Zellen als karyotypisch normal zu halten, pluripotent und leicht in der Lage zu differenzieren, während verminderte Heterogenität, dass Kolonie-basierte Passage 10 , 19 , 20 stimulieren kann. HiPS-Zellen, die auf LN-521 kultiviert wurden, können als Einzelzellen ohne Zusatz von ROCKi 10 passagiert werden, die Zugabe von ROCKi macht jedoch das Protokoll für weniger erfahrene Handler einfacher und reduziert die Zeit, die für die hiPS-Zellableitung erforderlich ist.

Reprogrammierung Effizienz ist geNerally kein Problem mit diesem Protokoll; SeV-Vektoren haben relativ hohe Reprogrammierungseffizienz> 1% für Fibroblasten 11 . Die Entstehung einer Fülle von Kolonien (<20) wird erwartet. Es wird empfohlen, dreimal die Anzahl der benötigten Kolonien auszuwählen. Es wurde beobachtet, dass ein Teil der gepflückten Klone nach dem Kommissionieren nicht haften kann. Zusätzliche Kolonien könnten auch benötigt werden, um teilweise umprogrammierte Kolonien zu kompensieren. Teilweise umprogrammierte Kolonien sind in einigen Fällen in der Lage, durch exogene Expression von Pluripotenzgenen durch die SeV-Vektoren zu haften und zu wachsen. Da die SeV-Vektoren verdünnt sind, werden diese Zellen aufhören, sich zu vermehren und zu dissoziieren, meist um die Passage 6-8 sichtbar. Die Heterogenität der Kultur ist auch ein Zeichen partieller Neuprogrammierung und heterogene Linien sollten verworfen werden ( Abbildung 2H ).

Die optimale Wahl der Umprogrammierungsvektor- und Kulturbedingungen ist abhängig von derZweck der erzeugten Zellen. Um jedoch Batch-to-Batch-Varianzen zu vermeiden, die die Ergebnisse beeinflussen, werden definierte Bedingungen empfohlen. Die Wahl eines nicht-integrierenden Vektorsystems wird vorgeschlagen, um die genomische Integrität von umprogrammierten Zellen zu erhalten. SeV-Vektoren wurden in diesem Protokoll aufgrund der Robustheit, relativ hohe Effizienz und niedrige Hände auf Zeit erforderlich gewählt. Die SeV-Vektoren werden während der Zellteilungen verdünnt und sind nicht um den Durchgang 12 nachweisbar, so dass die erzeugten Daten nicht durch exogene Expression beeinflusst werden. Wegen der sorgfältigen Anforderungen an Zellen, die für klinische Zwecke bestimmt sind, kann die SeV-Neuprogrammierung ein Hindernis für die klinische Übersetzung sein, da das vollständige Verschütten aller Vektormaterialien schwierig ist. MRNA-vermittelte Neuprogrammierung kann vorteilhaft sein, wenn man Zellen mit beabsichtigter Verwendung in Zelltherapien ableitet 12 . Diese Methoden sind jedoch viel arbeitsintensiver und komplizierter zu verwenden 21 . Die Methode hier deFür Fibroblasten-Kultur beschrieben ist auch für klinische Anwendungen ungeeignet. Da sowohl FBS als auch Gelatine xenogene und undefinierte sind, sollten Sie diese auf definierte xenofreie Produkte umsetzen .

Sterile Handhabungstechniken und regelmäßige Mycoplasma-Infektionstests werden empfohlen, während Sie mit jeder Form der Zellkultur arbeiten. Die menschliche Haut enthält viele Mikroorganismen, die in den Bedingungen gedeihen können, in denen die Zellen kultiviert werden, wenn sie nicht richtig behandelt werden. Es empfiehlt sich daher, bei der Handhabung von Hautbiopsien und während der ersten Kulturtage nach der Biopsieverarbeitung besonders wachsam zu sein. Die Etablierung von Fibroblasten-Kultur aus Hautbiopsien ist in der Tat ein zeitaufwändiger Prozess. Nach der Verarbeitung der Hautbiopsie werden zunächst schwache Anzeichen von Fibroblastenzellen anhaften, also mindestens eine Woche warten, um ein paar Fibroblastenzellen zu finden, die die erwartete Morphologie in der Kultur zeigen. Die Zeit, die für die Etablierung von Fibroblasten benötigt wirdIn-vitro-Kulturen aus Biopsien ist abhängig von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Größe der Biopsie, Alter des Spenders und wie die Biopsie behandelt wurde, seit es genommen wurde. Es ist bevorzugt, frühe Durchgangsfibroblasten für eine optimale Neuprogrammierungseffizienz 23 neu zu programmieren.

Zusammenfassend beschreiben wir hier eine etablierte, robuste und einfach zu bedienende Methode zur Erzeugung hochgradig homogener hiPS-Zellen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu berichten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den Förderern von SSF (B13-0074) und VINNOVA (2016-04134) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

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References

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Tags

Entwicklungsbiologie Ausgabe 125 Mensch induzierte pluripotenten Stammzellen Umprogrammierung Sendai-Virus-Vektoren Fibroblasten Xeno-freies chemisch definiertes rekombinantes menschliches Laminin 521
Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix
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Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

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