Summary
Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.
Abstract
Xeno-vrije en volledig gedefinieerde condities zijn belangrijke parameters voor robuuste en reproduceerbare generatie van homogene, geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen. Onderhoud van hiPS-cellen op feedercellen of ongedefinieerde matrices zijn vatbaar voor batchafwijkingen, pathogene verontreiniging en risico op immunogeniciteit. Het gebruik van de gedefinieerde recombinant humane laminin 521 (LN-521) matrix in combinatie met xenovrije en gedefinieerde media formuleringen vermindert de variabiliteit en zorgt voor een consistente generatie van hiPS cellen. De Sendai-virus (SeV) -vector is een niet-integrerend RNA-systeem, waardoor problemen die verband houden met het potentiële ontwrichtende effect op genoomintegriteit die integratie-vectoren kunnen hebben, worden omzeild. Bovendien hebben deze vectoren relatief hoog rendement bij de herprogrammering van dermale fibroblasten aangetoond. Bovendien vergemakkelijkt enzymatische single cell passage van cellen homogeen onderhoud van hiPS cellen zonder aanzienlijke eerdere ervaring van stamcellenLl cultuur. Hier beschrijven we een protocol dat uitgebreid getest en ontwikkeld is met een focus op reproduceerbaarheid en gebruiksgemak, waardoor een robuuste en praktische manier is om gedefinieerde en xeno-vrije humane hiPS-cellen van fibroblasten te genereren.
Introduction
Sinds de eerste afleiding van hiPS-cellijnen door Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS cellen hebben een nuttig hulpmiddel voor ziekte modelleren, drug ontdekking en als bronmateriaal voor het genereren van celtherapieën in regeneratieve geneeskunde 3 verschaft . HiPS celcultuur is al lang afhankelijk van co-cultuur met fibroblast feedercellen 4 , 5 of op Matrigel 6 en met media formuleringen die foetaal boviene serum (FBS) bevatten. Batch-to-batch varianties zijn een gemeenschappelijk gevolg van de ongedefinieerde aard van deze cultuuromstandigheden, wat resulteert in onvoorspelbare variaties, die een belangrijke bijdrage leveren aan de onbetrouwbaarheid van deze protocollen 7 . De ontwikkeling van gedefinieerd medium, zoals essentiële 8 (E8) 8 en gedefinieerde celkweekmatrices, bijvoorbeeld LN-521 9 , toestaanS voor de oprichting van hoogst reproduceerbare protocollen en hulp bij de robuuste generatie en het onderhoud van homogene hiPS cellen 7 , 8 , 9 , 10 .
Ontwikkeling van integratie gratis herprogrammeringstechnieken is een stap vooruit. Oorspronkelijk was herprogrammering afhankelijk van retrovirale vectoren die willekeurig in het genoom geïntegreerd werden met verstorende effecten op genomische integriteit 11 . Voorschotten in herprogrammeringsmethoden omvatten de ontwikkeling van RNA-gebaseerde vectoren. RNA-vectoren hebben een voordeel ten opzichte van de DNA-gebaseerde herprogrammeringsmethode aangezien onbedoelde integratie via genomische recombinatie niet mogelijk is 12 . SeV-vectoren verschaffen hoge en voorbijgaande expressie van exogene factoren door enkelstrengs RNA zonder een DNA-fase 11 . De herprogrammerende vectoren geleverd door de SeVWorden door de celuitbreiding verdund en worden uiteindelijk uit de cultuur afgevoerd, waardoor een vrije afdrukmogelijkheid voor fotoprints mogelijk is. Daarna is het onderhoud van pluripoten afhankelijk van endogene expressie van de pluripotentiegenen 2 .
Aangezien pioniersvolle therapieën van HiPS-cel beginnen te verplaatsen naar klinische proeven, zijn de eisen aan gestandaardiseerde partijen, reproduceerbaarheid en veiligheid essentiële problemen om 13 aan te pakken. Daarom moeten producten van dierlijke oorsprong worden vermeden. Bijvoorbeeld, het gebruik van xenogene producten is geassocieerd met het risico op nonhuman pathogeen besmetting. Ook hebben cellen die zijn gekweekt in aanwezigheid van dierlijke afgeleide cultuurcomponenten, aangetoond dat niet-humane siliaczuren in celmembranen worden opgenomen, die dreigen om afgeleide cellen immunogene 14 te maken . Daarom is de noodzaak om xenogene producten te elimineren nodig voor toekomstige klinische werkzaamheden. Dit protocol is van toepassing op xeGeen-vrije en gedefinieerde cultuur bij het behoud van hiPS-cellen die cellen dichter bij de klinische naleving bewegen.
Dit protocol beschrijft een consistente, zeer reproduceerbare en makkelijk te gebruiken methode die gestandaardiseerde hiPS cellen van fibroblasten genereert. Het biedt ook een gebruiksvriendelijk cultuursysteem voor het behoud van gevestigde hiPS-cellen. Dit protocol is gebruikt om meer dan 300 hiPS-cellijnen af te leiden in de Zweedse nationale menselijke iPS Core-faciliteit van het Karolinska Institutet, waarvan sommige lijnen eerder 15 , 16 zijn beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De inzameling van patiënt materiaal en afleiding van hiPS cellen is goedgekeurd door de Ethics Review Board, Stockholm, 28 maart 2012, Registratienummer: 2012 / 208-31 / 3. Celcultuurstappen dienen in biosafety kasten te worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld. Gebruik altijd steriele hanteringstechnieken bij het werken met cellen. Laat de media, platen en reagentia de kamertemperatuur bereiken voordat u begint. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 bij hoge vochtigheid.
1. Isolatie van humane fibroblasten van dermale biopsie
- Voorbereidingen van cultuurmedium, spijsverteringsenzymen, bekleding van gerechten en dissecterende gereedschappen.
- Bereid Fibroblast medium: 44,5 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 5 ml Fetaal Bovenserum (FBS) en 500 μL Penicilline / Streptomycine (PEST) (zie tabel 1 ), opslaan bij 4 ° C.
- Verteer spijsverteringsenzymen bij een werkconcentratie van 1 mg / ml: weiGh aliquots van 4 mg dispase en collagenase type I poeder in afzonderlijke buizen van 15 ml en oplossen in 4 ml DMEM / F12 + 1% PEST. Steriliseer de enzymatische oplossing door het door een 0,22 μm filter te brengen. Bereid elke keer verse enzymprocessen voor.
- Coat één goed in een 6-putje weefselkweekplaat (of 35 mm weefselkweekschotel) per biopsie gedissecteerd met 1 ml 0,1% gelatine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Autoclaaf een set chirurgische scharen en pincet per biopsie voor dissectie.
- Biopsie behandeling
OPMERKING: Proces biopsies zo snel mogelijk na het nemen. Bewaar in PBS + 1% PEST gedurende maximaal 48 uur bij 4 ° C. Biopsie moet 2 - 4 mm in diameter zijn en volgens ethische vergunningen.- Breng de biopsie over in een 35 mm schotel. Verplaats de biopsie naar een nieuwe 35 mm schotel en dompel de biopsie in 2 ml 70% ethanol gedurende 30 s.
- Verplaats de biopsie naar een derde35 mm schotel en was met 1 ml steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aangevuld met 1% PEST.
- Breng de biopsie over naar een vierde 35 mm schaal, voeg 1 ml vers bereide 0,1% dispasoplossing toe.
- Snijd de huidbiopsie in 1 - 2 mm 3 stuks in het gerecht met behulp van chirurgische scharen en pincetjes en plaats vervolgens de biopsie stukken inclusief de dispasoplossing in een 15 ml buis. Voeg een extra 2 ml dispase toe.
- Spoel de 35 mm schaal af met een 1 ml dispasoplossing en overdragen naar de 15 ml buis.
- Incubeer de biopsie bij 4 ° C overnacht.
- Voeg 4 ml 0,1% collagenase I toe aan de buis en incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur.
- Centrifugeer de verteerde cellen 300 xg gedurende 3 minuten, aspirateer de supernatant en resusteer de vertering in 2 ml fibroblast medium.
- Verwijder de gelatineoplossing uit de 6-putjesweefselkweekplaat. Breng de celsuspensie over, inclusief eventuele resterende stukken aan een weefselkweekplaat met 6 putjes (of 35-mM weefselkweekschotel) precoated met 0,1% gelatine in DPBS.
- Verander het medium elke derde dag.
- Uitbreiding van menselijke fibroblasten
OPMERKING: Fibroblasten zijn klaar om door een T25 (25 cm 2 ) weefselkweekfles te worden vervoerd wanneer 80% samenvloeit ( Figuur 2B ). Fibroblasten bereiken meestal 80% confluency binnen 7 dagen. De benodigde tijd kan echter sterk variëren, maar mag niet meer dan 4 weken zijn.- Aspiratiemedium en wassen eenmaal met 2,5 ml DPBS.
- Verwijder DPBS en voeg 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%) toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of tot cellen ronde randen laten zien en begin loslaten.
- Voeg 2 ml fibroblastmedium toe, eventueel spoel de cellen de juiste afschakeling van de cellen. Breng de celoplossing over op een 15 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 3 minuten.
- Verwijder supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml fibroblast medium en plaat fibroblasten in eenOp-gecoate celweefselkweek T25-fles. Wanneer u fibroblasten na deze stap uitbreidt, dissociëren zoals boven beschreven en zaad 12 x 10 3 cellen / cm2.
- Zodra samenvloeiende cellen klaar zijn om te bevroren, verbreden of platen voor herprogrammering. Bevestig twee ronden fibroblast voordat een herprogrammering is gestart (zie volgende sectie voor het vriesproces). De herprogrammeringsefficiëntie is over het algemeen hoger voor lagere doorgangsfibroblasten, cellen bij passage 2-4 zijn optimaal. Echter, succesvolle herprogrammering van fibroblasten tot passage 10 is uitgevoerd met dit protocol.
- Bevriezen en ontdooien van fibroblasten
- Bereid vers fibroblast bevriezend medium op: 90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Blijf bij 4 ° C ( tabel 1 ). Zodra samenvloeiend, kan de T25 weefselkweekfles in drie cryovials worden bevroren. Bereid 500 μl fibroblast bevriezend medium per vrieskas bevroren.
- Om cellen te bevriezen, dissociëren cElls zoals beschreven in stap 1.3, cellen cellen met behulp van een hemocytometer en overbrengen porties van 3 x 10 5 cellen naar 15 ml buizen. Spin buizen bij 300 xg gedurende 3 minuten. Aspirate supernatant.
- Resulteer celpellets in 500 μl 4 ˚C fibroblast bevriezing medium en over te brengen in cryovials. Plaats de flesjes in een vriescontainer en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij -80 ° C voordat ze overgebracht worden naar vloeibaar stikstof voor langdurige opslag.
- Om de cellen te ontdoen, onderdompelen het bodemdeel van de cryovial in 37 ° C water. Zodra het vloeibaar is, breng de cel-suspensie over naar een 15 ml buis en voeg 5 ml fibroblast medium toe. Spincellen 300 xg gedurende 3 minuten.
- Verwijder de supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml fibroblastmedium. Overdracht cellen naar een niet-gecoate T25 weefselkweekfles en incuberen in 37 ° C.
2. SeV Vector Herprogrammering van Fibroblasten
- Bereiding van vectorquota VOORZICHTIG: Behandel de SeV onder de bioveiligheidsniveau 2. Raadpleeg het protocol van de fabrikant en de lokale richtlijnen 17 . Virus titer verschilt tussen partijen.
- Alvorens te bereiden, berekenen de hoeveelheid vector die nodig is voor 5 x 10 4 cellen volgens het protocol van de fabrikant ( bijvoorbeeld CytoTune 2.0). De virustiter varieert over het algemeen van 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Ontdooi en combineer vectoren 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 en hKlf4 = MOI 3). Deel het bedrag dat is berekend voor de herprogrammering van 5 x 10 4 cellen in geautoclaveerde 1,5 ml buizen. Verdun virusalikwoten met fibroblastmedium tot een eindvolume van 250 μL voor herprogrammering.
OPMERKING: Elke injectieflacon is geldig voor herprogrammering van een putje van een 24-putjes weefselkweekplaat met 5 x 10 4 fibroblasten. Bewaar de aliquots van de virus bij -80 ° C.
- Alvorens te bereiden, berekenen de hoeveelheid vector die nodig is voor 5 x 10 4 cellen volgens het protocol van de fabrikant ( bijvoorbeeld CytoTune 2.0). De virustiter varieert over het algemeen van 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Ontdooi en combineer vectoren 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 en hKlf4 = MOI 3). Deel het bedrag dat is berekend voor de herprogrammering van 5 x 10 4 cellen in geautoclaveerde 1,5 ml buizen. Verdun virusalikwoten met fibroblastmedium tot een eindvolume van 250 μL voor herprogrammering.
- SeV Vector transductie
- Aspireren cel cuMedium medium en was met 1 ml DPBS gewassen. Aspireer DPBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,05%) toe. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat cellen losgemaakt zijn.
- Voeg 2 ml fibroblast medium toe en breng de cellen opnieuw op en over te brengen naar een 15 ml buis. Centrifuge 300 xg gedurende 3 minuten.
- Aspirateer de supernatant en resusteer de pellet in 2 ml fibroblast medium.
- Tel fibroblasten door gebruik te maken van een hemocytometer en zaad 5 x 104 cellen in een put van een 24-putjes weefselkweekplaat. Incubeer cellen bij 37 ° C overnacht.
- Aspireren celcultuurmedium, voeg 250 μl van de SeV-oplossing toe en incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Dagelijks veranderen in vers fibroblast medium. Laat getransduceerde cellen 7 dagen groeien voordat ze doorgevoerd worden naar LN-521-beklede platen. Bereid de LN-521 borden de dag voor de doorgang. Zie 2.3.1 voor coatingprocedure.
- Replateren van getransduceerde fibroblasten
- Bereiding van LN-521 gecoate gerechten: Verdun LN-521 in DPBS tot een eindconcentratie van 0,63 μg / cm2. Pipet 2 ml van de LN-521 oplossing per 60 mm weefselkweekschotel. Verzegel de 60 mm weefselkweekschotel met parafilm. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Bereid essentiële 8-medium (E8) aliquots voor gemakkelijker hanteren: 48,5 ml E8-medium, 1 ml E8-supplement en 500 μL PEST ( tabel 1 ).
- 7 dagen na transductie, passeren de cellen naar een LN-521 gecoate 60 mm weefselkweekschotel. Voeg 250 μl Trypsin-EDTA (0,05%) toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat cellen losgemaakt zijn. Voeg 2 ml fibroblast medium toe en centrifugeer cellen gedurende 3 minuten bij 300 x g.
- Aspirateer de supernatant. Resulteer pellet in 2 ml fibroblast medium en tel cellen in een hemocytometer. Aspirate LN-521 oplossing van de voorgelaste plaat en zaad 4 x 10 4 cellen in 5 ml fibroblast medium in de LN-521 precoated 60 mm schotel. Voeg Rho-kinase-remmer Y-27632 toe(ROCKi) tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM. Incubeer overnacht in 37 ° C.
- Belangrijk, de volgende dag, verander medium tot E8 medium. E8 dagelijks wijzigen. HiPS celkolonies komen binnen 2 tot 3 weken op.
3. Plukken van kolonies en uitbreiding van hiPS-cellen
OPMERKING: De volgende stappen worden buiten de biosafety-kast onder een stereomicroscoop uitgevoerd. Het gebruik van haarnet- en proceduremaskers wordt aanbevolen. Werk zorgvuldig om de celcultuur niet te verontreinigen.
- Bereid LN-521-gecoate weefselkweekplaten 24-putjes de dag voor het plukken. Verdun LN-521 in DPBS 0,63 μg / cm2. Pipette 250 μL van de LN-521 oplossing in één putje van een 24-putjes weefselkweekplaat. Afdichtplaten met parafilm. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
OPMERKING: Kolonies zijn klaar om geplukt te worden als ze een maat> 1 mm in diameter bereiken. Kolonies zouden scherpe randen moeten laten zien en in homogene mon kunnen groeienOlayers ( figuur 2D ). - Aspirate de LN-521 oplossing en voeg 500 μL E8 in één putje van een 24-putjes weefselkweekplaat.
- Knip kolonies in kleinere stukken met een scalpel in een rasterpatroon onder een stereomicroscoop. Schraap de celbladen mechanisch uit de schotel en verplaats de bladen met een 200 μL pipet naar de voorbereide put ( Figuur 2D -2E ). Kies kolonies in aparte putjes.
- Laat cellen toe om vast te zetten zonder 48 uur te veranderen. Vervolgens verander E8-medium dagelijks.
- Wanneer de kolonies een grootte hebben bereikt van> 5 mm, enzymatisch doorlopen cellen als enkele cellen naar een nieuwe putje van een LN-521 gecoate plaat.
- Aspiratie van het celkweekmedium uit cellen en wassen met 250 μl DPBS.
- Aspireer DPBS. Voeg 250 μl dissociatie-reagens toe en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.
- Let op dat de cellen begonnen zijn om op te ronden. losmakenCellen uit de plaat door de cellen een paar keer met dissociatie-reagens te spoelen.
- Voeg 500 μl E8 medium toe aan een 15 ml buis. Breng de cellen in het dissociatie reagens naar de buis en centrifuge gedurende 3 minuten bij 300 x g.
- Aspirateer de LN-521 oplossing uit de LN-521 precoated well en voeg 500 μL kamertemperatuur E8 medium toe.
- Aspirateer de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 μl E8 medium.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 cellen in de voorbereide LN-521 precoated well (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 cellen / cm 2 ). Cellcultuur formaat kan gemakkelijk upscaled worden om het beoogde doel te passen.
- Voeg ROCKi toe aan een eindconcentratie van 10 μM. Incubeer cellen bij 37 ° C.
- E8 dagelijks wijzigen. Cellen zijn meestal klaar om na 4 - 6 dagen over te gaan. Enzymatisch doorlopen cellen als enkele cellen zoals hierboven beschreven, wanneer ongeveer 90% samenvloeien.
OPMERKING: De herprogrammerende vectoren worden geleidelijk verdund tijdens de hiPS-celuitbreiding en niet detecteerbaar na passage 12. Cells die onpartijdig herprogrammerd zijn, stoppen gewoon om langs de passage 6-10 te prolifereren of hun karakteristieke pluripotente stamcelmorfologie te verliezen ( Figuur 3B ). - Bevriezen en ontdooien van hiPS-cellen
- Om cellen te bevriezen, cellen cellen enzymatisch als afzonderlijke cellen zoals hierboven beschreven, tellen cellen in een hemocytometer en verdelen 2,5 x 10 5 cellen naar een 15 ml buis die 1 ml E8 medium bevat. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 3 minuten. Aspirateer de supernatant.
- Resuspende celpellet in 250 μL 4 ° C PSC-cryomedium en overbrengen naar een cryovial. Plaats de injectieflacon in een vriescontainer en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij -80 ° C voordat ze overgebracht worden naar vloeibaar stikstof voor langdurige opslag.
- Voor het ontdooien van cellen, bereide een voorgelaste LN-521 put van een 24-putjes weefselkweekPlaat door de LN-521-oplossing te aspireren en 250 μl E8-medium toe te voegen. Onderdompel het onderkant van de cryovial in 37 ° C water tot er maar een klein ijsje blijft.
- Voeg 250 μL E8 Medium aan de cryovial toe en breng de cel-suspensie over naar een 15 ml-buis en voeg 1 ml E8-medium toe. Spincellen 300 xg gedurende 3 minuten.
- Verwijder de supernatant en resuspende de celpellet in 250 μL kamertemperatuur E8 medium. Zet de celsuspensie over op de voorbereide put en voeg een 1% cellevendigheidsaanvulling toe of 10 μM ROCKi. Incubeer het weefselkweekplaat bij 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van biopsie naar hiPS-cellen
Het gehele proces van biopsie naar gevestigde hiPS-cellen, waarbij u de programmeringsvector opnieuw wilt programmeren en klaar voor karakterisering, duurt ongeveer 16 weken ( Figuur 1 ). Een meer gedetailleerde tijdlijn is gespecificeerd in figuur 2A . Ongeveer 4 weken is nodig om fibroblastculturen vast te stellen en uit te breiden. De eerste hiPS-celkolonies begonnen te verschijnen over drie weken na de Sendai-vectortransductie. Kolonies werden mechanisch gekozen voor de eerste doorgang en vervolgens enzymatisch doorgegeven als enkele cellen.
Oprichting van menselijke fibroblast culturen
Toen de menselijke fibroblastculturen tot confluency waren gegroeid en de geaccepteerde morfologie werden getoond, werden ze eerst uitgebreid en bevroren voor twee passagiersVoordat u wordt geplateerd voor transductie ( Figuur 2B ).
Herprogrammering van menselijke fibroblasten met behulp van SeV-vectoren
Verhoogde niveaus van celdood werden gevonden in de dagen na SeV transductie en lichte veranderingen in fibroblast morfologie werden waargenomen. Opkomst van de eerste hiPS kolonies werd gedetecteerd vanaf dag 12 na transductie ( Figuur 2A , 2C ). Kolonies die klaar zijn om te worden geplukt, werden verwacht na ongeveer drie tot vier weken na transductie ( Figuur 2A , 2D ). Zaadcellen in de in dit protocol gespecificeerde hoeveelheden hebben geleid tot een overvloed aan kolonies die zich voordoen (<20). Selectieve plukken van kolonies die de gunstige morfologie tonen, wordt aanbevolen. Kolonie kenmerkt de geprefereerde gecompliceerde compactcellen massa, groei als homogene monolayers, onderscheidbaar indi Vidale cellen met scherpe rand naar omliggende fibroblasten ( figuur 2D ). De hiPS-celkolonies werden gesneden in een roosterachtig patroon met behulp van een scalpel en mechanisch doorgegeven ( Figuur 2E ). Geselecteerde hiPS-klonen werden 48 uur achtergelaten om aan de plaat te houden zonder medium verandering. HiPS-celklonen waren zeer homogeen, maar weinig fibroblasten die afkomstig zijn van de herprogrammeringsplaat werden geduld tijdens de eerste twee passages ( Figuur 2F ). Het plukken van kolonies met drukke grenzen en grote, niet-compacte heterogene celmassa moet worden vermeden ( figuur 2G ). De verkregen hiPS-cellijnen groeiden als dichte monolagen, met een grote kern-naar-cytoplasma-verhouding en hadden luminescerende grenzen gedefinieerd. In tegendeel werden niet-homogene kolonies die niet aan deze criteria voldoen, verwijderd ( Figuur 2H ) om culturen van gemengde celpopulaties te vermijden.
P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Validatie van hiPS-celklonenPluripotentie karakterisering van afgeleide cellen werd uitgevoerd nadat de SeV vector verloren was en het onderhoud van de pluripotente staat werd gedreven door de expressie van endogene factoren. Voordat u verder gaat met de hiPS-celvalidatie, zorg ervoor dat de SeV-vectoruitdrukking is verloren. Na dit protocol is SeV vector RNA niet meer detecteerbaar door passage 12 volgens onze ervaring, dus een geschikt beginpunt van karakterisering ( Figuur 3A ). Immunocytochemie kleuring voor pluripotentie markers OCT4, SSEA4 en NANOG zou een homogeen positief resultaat moeten opleveren ( Figuur 3B ). Celculturen die gedeeltelijk herprogrammeerde cellen bevatten die geen pluripotentiefactoren hebben uitgedrukt, werden weggegooid ( Figuur 3C ). MRNA expressie van endogene pluripotency genen wordt getoond door real-time PC R (RT-PCR) in Figuur 3D .
Pluripotente stamcellen zouden gemakkelijk kunnen onderscheiden in de drie kiemlagen. Het differentiatiepotentieel van hiPS-cellen werd beoordeeld door de vorming van embryoidlichamen (EB) 18 . Vrije drijvende EB's gegenereerd uit hiPS cellen worden getoond in Figuur 3E en mRNA expressie van kiemlaag specifieke markers na 21 dagen van EB differentiatie is weergegeven in Figuur 3F .
Figuur 1: Stroomschema van huidbiopsie naar hiPS-cellen.
Overzicht van de belangrijkste stappen in het protocol. De illustratie omvat biopsie collectie, isolatie van fibroblasten, SeV transductie, kolonie plukken en de klonale uitbreiding van hiPS cellen.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2: Critische stappen bij de opwekking van hiPS-cellen.
(A) Tijdlijn waarin belangrijke tijdspunten worden vermeld in het protocol, waaronder fibroblast plating, SeV transductie, medium veranderingen en coatings. Passage 12 van hiPS cellen is gemarkeerd als begin van karakterisatie experimenten. (B) Helder veldbeeld van confluente fibroblasten in cultuur met typische morfologie. (C) Opkomst van hiPS celkolonies van getransduceerde fibroblasten. (D) Klaar om kolonie te selecteren die voorkeursfuncties, platte compacte celmassa, onderscheiden individuele cellen met scherpe randen naar omliggende fibroblasten (Passage 0) toont. (E) hiPSCelkolonies worden in een rasterachtig patroon gesneden en mechanisch doorgegeven . (F) Behandelde kolonie na een paar dagen van groei. De geheiligde hiPS cellen worden omringd door een ongewoon hoog aantal fibroblasten afkomstig van de herprogrammeringsplaat. De fibroblasten kunnen van de plaat worden geschraapt en zullen waarschijnlijk verdwijnen met daaropvolgende enkele cellen passages (Passage 1). (G) Kolonies die morfologie tonen, herinnert zich niet aan volledig herprogrammeerde cellen; Kieskeurige grenzen, grote ongecompacteerde heterogene celmassa. (H) Helder veldbeeld, dat een vroege doorgangshomogene volledig herprogrammeerde hiPS-cellijn illustreert in vergelijking met een zeer heterogene cellijn. Schaalstaven geven 100 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van hiPS-cellen.
(A) RT-PCR van SeV vector specifieke markers. HiPS cellen bij gang 3 worden gebruikt als positieve controle voor de herprogrammerende vectoren1. Bij passage 12 zijn cellen negatief voor expressie van virusspecifieke merkers Sendai-specifieke ruggengraat (SeV B), Sendai-specifieke KLF4 (KLF4 SeV), Sendai-specifieke cMYC (cMYC SeV), PCR-controle (GAPDH) en geen sjabloon (-). (B) Representatief voorbeeld van volledig herprogrammeerde homogene hiPS-cellijn bij passage 12. Helder veldbeeld van hiPS-cellen onthult cellen groeien in strakke monolagen met scherpe luminescerende randen en met grote kernen en klein cytoplasma. Immunocytochemie-kleuring van pluripotentiemarkers OCT4, NANOG, SSEA4 en nucleaire kleuring 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) die homogene positieve expressie aantonen. (C) Cellijn die heterogene expressie voor pluripotentiemarkering NANOG vertont. De cultuurE bevat gedeeltelijk opnieuw geprogrammeerde cellen en moet worden weggegooid. (D) RT-PCR van mRNA-expressie van pluripotentiemarkeringen NANOG, OCT4, PCR-controle (GAPDH) en geen sjabloon (-) die de expressie van pluripotentiemarkeringen aangeeft. (E) Vrij drijvend embryoïde lichamen gegenereerd uit hiPS cellen. (F) RT-PCR na 21 dagen embryoïde lichaamsdifferentiatie tonen aan dat afgeleide hiPS-cellen in staat zijn tot differentiatie van de drie kiemlagen. Endodermale markers AFP en GATA4, mesodermale markers RUNX en HAND1, ectodermale markers NCAM en NESTIN, PCR-controle (GAPDH) en geen sjabloon (-). Schaalstaven geven 100 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het verwachte resultaat van dit protocol is de succesvolle opwekking van verschillende clonaal afgeleide hiPS-cellijnen. Belangrijk is dat de methode voor het onderhoud en uitbreiding van gevestigde hiPS-cellen hier beschreven, betrouwbaar is en kan worden uitgevoerd met weinig eerdere ervaring van stamcelcultuur. Enzymatische single cell passaging met ROCKi samen met de LN-521 matrix is bekend om cellen als karyotypisch normaal, pluripotent te handhaven en gemakkelijk in staat te differentiëren, terwijl geïnduseerde heterogeniteit voorkomt dat colonisatie gebaseerde passaging 10 , 19 , 20 kan stimuleren. HiPS cellen gecultiveerd op LN-521 kunnen worden vervoerd als enkele cellen zonder de toevoeging van ROCKi 10 , maar de toevoeging van ROCKi maakt het protocol makkelijker voor minder ervaren handlers en vermindert de tijd die nodig is voor hiPS-cellederivatie.
De herprogrammeringsefficiëntie is geNergens een probleem met dit protocol; SeV-vectoren hebben een relatief hoge herprogrammeringsefficiëntie> 1% voor fibroblasten 11 . Het ontstaan van een overvloed aan kolonies (<20) wordt verwacht. Het is aan te raden om drie keer het aantal colonies te selecteren die u nodig hebt. Er is waargenomen dat een gedeelte van de gekozen klonen niet na het plukken kleeft. Extra colonies kunnen ook nodig zijn om te compenseren voor gedeeltelijk herprogrammeerde kolonies. Gedeeltelijk herprogrammeerde kolonies zijn in sommige gevallen in staat om vast te houden en te ondersteunen door exogene expressie van pluripotentiegenen door de SeV-vectoren. Aangezien de SeV-vectoren verdund zijn, zullen deze cellen opvallen en dissociëren, meestal zichtbaar rond passage 6-8. Heterogeniteit van de cultuur is ook een teken van gedeeltelijke herprogrammering en heterogene lijnen moeten weggegooid worden ( Figuur 2H ).
De optimale keuze van herprogrammerende vector- en cultuuromstandigheden is afhankelijk van deDoel van de gegenereerde cellen. Om te voorkomen dat batch-to-batch variaties de resultaten beïnvloeden, worden de gedefinieerde voorwaarden aanbevolen. De keuze van een niet-integrerend vector systeem wordt voorgesteld om genomische integriteit van herprogrammeerde cellen te behouden. SeV-vectoren werden gekozen in dit protocol door de robuustheid, relatief hoge efficiëntie en lage hands-on-time benodigdheid. De SeV-vectoren worden verdund tijdens celafdelingen en zijn niet detecteerbaar rond passage 12, waardoor de gegenereerde data niet wordt beïnvloed door exogene expressie. Door de nauwkeurige eisen aan cellen die bestemd zijn voor klinische doeleinden, kan SeV-herprogrammering een belemmering vormen voor de klinische vertaling, aangezien het bewijs is dat het volledig afzetten van alle vectormaterialen moeilijk is. MRNA gemedieerde herprogrammering kan voordelig zijn als cellen afkomstig zijn met voorgenomen gebruik in celtherapieën 12 . Deze methoden zijn echter veel arbeidsintensief en ingewikkelder om 21 te gebruiken. De methode hier deGeschreven voor fibroblastcultuur is ook ongeschikt voor klinische toepassingen. Aangezien zowel FBS als gelatine xenogeen en ongedefinieerd zijn, overwegen deze te overschakelen naar gedefinieerde xenovrije producten 22 .
Steriele hanteringstechnieken en regelmatig mycoplasma-infectie testen worden aanbevolen tijdens het werken met elke vorm van celcultuur. Menselijke huid bevat veel micro-organismen die kunnen bloeien in de omstandigheden waarin cellen worden gekweekt indien niet goed behandeld. Daarom wordt aanbevolen om extra waakzaam te zijn bij de behandeling van huidbiopsies en tijdens de eerste dagen van de cultuur na de biopsieverwerking. De oprichting van fibroblastcultuur uit huidbiopsies is inderdaad een tijdrovend proces. Na het verwerken van de huidbiopsie zullen er in eerste instantie zwakke tekenen van fibroblastcellen zijn die aan elkaar hechten, dus wacht minstens een week om een paar fibroblastcellen te vinden die de verwachte morfologie in de cultuur laten zien. De tijd die nodig is voor de oprichting van fibroblastenIn vitro culturen uit biopsies is afhankelijk van een aantal factoren, waaronder de grootte van de biopsie, de leeftijd van de donor en hoe de biopsie is behandeld sinds het is genomen. Het heeft de voorkeur om vroege doorgangsfibroblasten te herprogrammeren voor een optimale herprogrammeringsefficiëntie 23 .
Samenvattend beschrijven we hier een gevestigde, robuuste en makkelijk te gebruiken methode voor het genereren van zeer homogene hiPS-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door SSF (B13-0074) en VINNOVA (2016-04134) financieringsagenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 mL tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 mL | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Sealing plates for storage |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
