Summary
通过使用非整合仙台病毒（SeV）载体介导的真皮成纤维细胞的重编程，实现人诱导的多能干细胞（hiPS）细胞的稳健衍生。使用重组人层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential E8（E8）培养基，使用无异种素和化学定义的培养条件进行hiPS细胞维持和克隆扩增。
Abstract
无性和完全定义的条件是稳定和可重复产生均质人诱导多能干细胞（hiPS）细胞的关键参数。饲养细胞或未定义基质上的hiPS细胞的维持易受批次差异，致病性污染和免疫原性风险的影响。使用定义的重组人层粘连蛋白521（LN-521）基质与无异种素和限定的培养基制剂组合减少变异性并允许hiPS细胞的一致产生。仙台病毒（SeV）载体是一种非整合的基于RNA的系统，因此规避了与基因组完整性整合载体可能具有的潜在破坏性影响相关的问题。此外，这些载体在真皮成纤维细胞的重新编程中已经表现出相对较高的效率。此外，细胞的酶促单细胞传代促进了hiPS细胞的均匀维持，而没有实质的茎干经验文化。在这里，我们描述了一个经过广泛测试和开发的方案，重点是重现性和易用性，为从成纤维细胞中产生定义和不含异种的人类hiPS细胞提供了一种可靠和实用的方法。
Introduction
由于Takahashi 等人首先推导出hiPS细胞系1,2 ，hiPS细胞为疾病建模，药物发现和用于在再生医学中产生细胞疗法的源材料提供了有用的工具3 。长期以来，HiPS细胞培养依赖于与成纤维细胞饲养细胞4,5或基质胶6和含有胎牛血清（FBS）的培养基配制物的共培养。批次差异是这些文化条件未定义性质的常见后果，导致不可预测的变化，这是这些协议不可靠性的主要原因7 。定义的培养基如基本8（E8） 8和定义的细胞培养基质例如LN-521 9的开发允许s用于建立高度可重复的方案，并有助于稳健的产生和维持均质的hiPS细胞7,8,9,10。
一体化免费重编程技术的发展已经跨越式发展。最初，重编程依赖于随机整合到基因组中的逆转录病毒载体，对基因组完整性具有破坏性影响11 。重编程方法的进展包括开发基于RNA的载体。 RNA载体相对于基于DNA的重编程方法具有优势，因为通过基因组重组的非预期整合是不可能的12 。 SeV载体通过没有DNA相11的单链RNA提供高和短暂的外源因子表达。由SeV交付的重编程载体在整个细胞扩增过程中被稀释，最终从培养物中脱落，提供了免打印方式的重编程。此后，多能性的维持依赖于多能性基因的内源性表达2 。
作为开创性的基于hiPS细胞的疗法正在开始进入临床试验，标准化批次，再现性和安全性的要求是解决13的重要问题。因此，应避免动物产地。例如，异种产品的使用与非人类病原体污染的风险相关。此外，在动物衍生的培养物组分存在下培养的细胞已经显示出将非人类硅酸掺入可能导致衍生细胞免疫原性的细胞膜中14 。因此，消除异种产品的需要对于任何未来的临床追求都是必要的。此协议适用于xe免疫和定义的培养在保持hiPS细胞移动细胞更接近临床依从性。
该协议描述了从成纤维细胞产生标准化的hiPS细胞的一致，高度可重现和易于使用的方法。它还提供了一种用户友好的文化系统，用于维护已建立的hiPS细胞。该协议已被用于在Karolinska机构的瑞典国家人类iPS核心设施中获得超过300个hiPS细胞系，其中一些线路之前已被描述为15,16 。
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Protocol
患者资料的收集和hiPS细胞的推导得到道德评估委员会，2012年3月28日，斯德哥尔摩，注册号：2012 / 208-31 / 3的批准。细胞培养步骤应在生物安全柜内进行，除非另有说明。在使用细胞时，始终使用无菌处理技术。允许介质，板和试剂在启动前达到室温。在37℃，5％CO 2高湿度条件下孵育细胞。
1.从真皮活检中分离人成纤维细胞
- 培养基的制备，消化酶，菜肴和解剖工具的涂层。
- 准备成纤维细胞培养基：44.5mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM），5mL胎牛血清（FBS）和500μL青霉素/链霉素（PEST）（ 见表1 ），储存在4℃。
- 以1mg / mL的工作浓度制备消化酶：wei在分开的15-mL管中加入4mg分散酶和胶原酶I型粉末的gh等分试样并溶于4mL DMEM / F12 + 1％PEST中。通过将其通过0.22μm过滤器来消毒酶溶液。每次准备新鲜的酶溶液。
- 在6孔组织培养板（或35mm组织培养皿）中，每孔用1mL 0.1％明胶在磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中切片进行活检，涂一个孔。在室温下孵育30分钟。
- 高压灭菌一次手术剪刀和镊子每次活检进行解剖。
- 活检处理
注意：采集后尽可能快地处理活组织检查。在4℃下在PBS + 1％PEST中存放长达48小时。活检的大小应为2-4毫米，符合道德准证。- 将活检转移到35毫米的盘中。将活组织检查移至新的35毫米皿中，并将活检浸没在2毫升70％乙醇中30秒。
- 将活检移至第三位35毫升菜，并用1毫升无菌汉克平衡盐溶液（HBSS）和1％PEST进行洗涤。
- 将活检转移到第四个35毫米皿中，加入1毫升新鲜制备的0.1％分散液。
- 使用手术剪刀和镊子将皮肤活检切成盘中1-2mm 3片，然后将包括分泌酶溶液的活检片转移到15mL管中。加入另外2 mL的分散液。
- 用1 mL分散液冲洗35 mm的培养皿并转移到15 mL管中。
- 在4℃孵育活检过夜。
- 加入4 mL 0.1％胶原酶Ⅰ至37℃孵育4 h。
- 将消化的细胞离心300×g 3分钟，抽出上清液并将消化物重悬于2mL成纤维细胞培养基中。
- 从6孔组织培养板中取出明胶溶液。将包括任何剩余片段的细胞悬浮液转移到6孔组织培养板（或35μm）中m组织培养皿），用DPBS中的0.1％明胶预涂。
- 每三天更换一次媒体。
- 人类成纤维细胞的扩增
注意：当80％汇合时，成纤维细胞可以传代给T25（25cm 2 ）组织培养瓶（ 图2B ）。成纤维细胞通常在7天内达到80％的汇合。然而，所需时间可能会有很大差异，但不得超过4周。- 吸出培养基，并用2.5mL DPBS洗涤一次。
- 取出DPBS，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA（0.05％），37℃孵育5 min，直至细胞呈圆形边缘，开始分离。
- 加入2 mL成纤维细胞培养基，如有必要，冲洗细胞，确保细胞正确分离。将细胞溶液转移到15-mL管中，并以300xg离心3分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5mL成纤维细胞培养基和平板成纤维细胞中包被细胞组织培养T25烧瓶。当在该步骤之后扩增成纤维细胞时，如上所述解离并种子12×10 3个细胞/ cm 2 。
- 一旦融合的细胞准备冻结，扩大或平板进行重新编程。在任何重新编程开始之前冻结两轮成纤维细胞（参见下一部分的冷冻程序）。下通道成纤维细胞的重编程效率一般较高，第2-4代细胞最佳。然而，使用该方案已经使成纤维细胞成功重编程直到第10代。
- 冻融成纤维细胞
- 准备新鲜的成纤维细胞冷冻培养基：90％FBS + 10％二甲基亚砜（DMSO）。保持在4°C（ 表1 ）。一旦汇合，T25组织培养瓶可以冷冻成三个冷冻管。每瓶冷冻制备500μL成纤维细胞冷冻培养基。
- 冻结细胞，解离c使用血细胞计数器计数细胞并将3×10 5个细胞的部分转移至15-mL管。旋转管300×g 3分钟。吸出上清。
- 将细胞沉淀重悬于500μL的4℃成纤维细胞冷冻培养基中并转移到冷冻管中。将小瓶放入冷冻容器中，并将细胞在-80℃下孵育24小时，然后将其转移至液氮以长期储存。
- 要解冻细胞，将冰箱的底部浸入37°C的水中。一旦液化，将细胞悬浮液转移到15 mL管中，加入5 mL成纤维细胞培养基。旋转细胞300 xg 3 min。
- 去除上清液并将细胞沉淀重悬于5 mL成纤维细胞培养基中。将细胞转移至未涂覆的T25组织培养瓶中，并在37℃下孵育。
2.成纤维细胞的SeV载体重编程
- 载体等分试样的制备 小心：在生物安全2级遏制下处理SeV。参见制造商协议和本地准则17 。病毒滴度在批次之间变化。
- 在制备等分试样之前，根据制造商的方案（ 例如 CytoTune 2.0）计算5×10 4个细胞所需的载体量。病毒滴度通常为8×10 7 - 1.5×10 8 。解冻和组合载体5：5：3（KOS MOI = 5，hc-myc MOI = 5和hKlf4 = MOI 3）。将5×10 4个细胞的重新编程计算的部分分成高压灭菌的1.5mL管。用成纤维细胞稀释病毒等分试样至250μL的最终体积用于重新编程。
注意：每个小瓶有效重新编程一个具有5×10 4成纤维细胞的24孔组织培养板的一个孔。将病毒等分试样储存在-80°C。
- 在制备等分试样之前，根据制造商的方案（ 例如 CytoTune 2.0）计算5×10 4个细胞所需的载体量。病毒滴度通常为8×10 7 - 1.5×10 8 。解冻和组合载体5：5：3（KOS MOI = 5，hc-myc MOI = 5和hKlf4 = MOI 3）。将5×10 4个细胞的重新编程计算的部分分成高压灭菌的1.5mL管。用成纤维细胞稀释病毒等分试样至250μL的最终体积用于重新编程。
- SeV载体转导
- 吸气孔切片培养基并用1mL DPBS洗涤。吸入DPBS并加入1mL胰蛋白酶-EDTA（0.05％）。在37℃孵育5分钟或直到细胞分离。
- 加入2mL成纤维细胞培养基，并重悬细胞并转移到15-mL管中。离心300 xg 3 min。
- 吸出上清液并将沉淀重悬于2mL成纤维细胞培养基中。
- 在24孔组织培养板的一个孔中使用血细胞计数器和种子5×10 4细胞计数成纤维细胞。在37℃孵育细胞过夜。
- 吸出细胞培养基，加入250μLSeV溶液，37℃孵育过夜。
- 每天更换培养基至新鲜成纤维细胞培养基。允许转导的细胞生长7天，然后传播到LN-521涂覆的平板。在通过前一天准备LN-521板。涂层程序参见2.3.1。
- 替代转导的成纤维细胞
- 制备LN-521涂层：DPBS稀释LN-521至0.63μg/ cm 2的终浓度。每60毫米组织培养皿移取2毫升LN-521溶液。使用石蜡膜密封60毫米组织培养皿。在4℃下孵育过夜。
- 准备基本8中等（E8）等分试样以便于处理：48.5mL E8培养基，1mL E8补充物和500μLPEST（ 表1 ）。
- 转导后7天，将细胞通过LN-521涂覆的60mm组织培养皿。加入250μL胰蛋白酶-EDTA（0.05％），37℃孵育5分钟或直到细胞分离。加入2mL成纤维细胞培养基，并以300×g离心细胞3分钟。
- 吸出上清液。将沉淀重悬于2mL成纤维细胞培养基中，并在血细胞计数器中计数细胞。将来自预涂板的吸液LN-521溶液和在LN-521预涂的60mm培养皿中的5ml成纤维细胞培养基中种子4×10 4细胞。添加Rho激酶抑制剂Y-27632（ROCKi）至最终浓度为5μM。在37℃下孵育过夜。
- 重要的是，第二天将介质更换为E8中等。每天更换E8中等hiPS细胞集落将在2-3周内出现。
3.采摘殖民地和hiPS细胞扩增
注意：以下步骤是在立体显微镜下在生物安全柜之外完成的。推荐使用发丝网和程序口罩。小心不要污染细胞培养。
- 在采摘前一天准备LN-521涂层组织培养24孔板。 DPBS稀释LN-521 0.63μg/ cm 2 。将250μL的LN-521溶液移至24孔组织培养板的一个孔中。密封板使用石蜡膜。在4℃下孵育过夜。
注意：当大小达到直径1毫米的大小时，殖民地已准备好挑选。殖民地应显示锋利的边缘，并以均匀的单株生长olayers（ 图2D ）。 - 吸出LN-521溶液，并将500μLE8加入24孔组织培养板的一个孔中。
- 用立体显微镜下的网格像格子的手术刀将殖民地切成小块。机械地从盘中刮下细胞片并使用200μL移液管将片材转移到制备好的孔中（ 图2D-2D ）。选择殖民地分成不同的井。
- 允许细胞在不改变培养基的情况下附着48小时。此后，每天更换E8。
- 当菌落达到> 5mm的大小时，将细胞作为单细胞酶促传代至LN-521涂层板的新孔。
- 从细胞吸出细胞培养基，用250μLDPBS洗涤。
- 吸气DPBS。加入250μL解离试剂，37℃孵育3 min。
- 观察细胞已经开始向上。分离通过用解离试剂冲洗细胞几次，从板上取出细胞。
- 向15 mL管中加入500μLE8培养基。将解离试剂中的细胞转移到管中，并以300×g离心3分钟。
- 从LN-521预涂井抽出LN-521溶液，加入500μL室温E8培养基。
- 吸出上清并将细胞沉淀重悬于500μL的E8培养基中。
- 使用血细胞计数器计数细胞，并在制备的LN-521预包被孔（1.25×10 4 - 2.5×10 4个细胞/ cm 2 ）中种2.5×10 4 -5×10 4个细胞。细胞培养格式可以轻松地放大到适合预期目的。
- 将ROCKi添加到终浓度为10μM。孵育细胞在37°C。
- 每天更换E8中等细胞通常在4-6天后通过。当约90％融合时，将上述细胞作为单细胞进行酶促传代。
注意：重编程载体在hiPS细胞扩增期间逐渐稀释，在第12代后无法检测到。通常重新编程的细胞通常停止在6-10周围增殖或丧失其特征性多能干细胞形态（ 图3B ）。 - hiPS细胞的冻融
- 为了冷冻细胞，如上所述用单细胞酶促离解细胞，在血细胞计数器中计数细胞，并将2.5×10 5个细胞转移到含有1mL E8培养基的15-mL管中。以300 xg离心3分钟。吸出上清液。
- 将细胞沉淀重悬于250μL4℃的PSC冷冻细胞中，并转移至低温条件下。将小瓶放入冷冻容器中，并将细胞在-80℃下孵育24小时，然后将其转移至液氮以进行长期储存。
- 为了解冻细胞，准备24孔组织培养物的预涂LN-521孔通过吸取LN-521溶液并加入250μLE8培养基。将冰箱的底部浸入37°C的水中，直到只剩下一个小冰柱。
- 向冷冻机中加入250μLE8培养基，并将细胞悬浮液转移到15 mL试管中，加入1 mL E8培养基。旋转细胞300 xg 3 min。
- 取出上清液，将细胞沉淀重悬于250μL室温E8培养基中。将细胞悬浮液转移到准备好的孔中，加入1％细胞活力补充剂或10μMROCKi。在37℃下孵育组织培养板。
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Representative Results
从活检到hiPS细胞
从活检到建立的hiPS细胞，清除重编程载体并准备表征的整个过程大约需要16周（ 图1 ）。 图2A中指定了更详细的时间表。需要大约4周来建立和扩大成纤维细胞培养。第一个hiPS细胞集落开始在仙台载体转导后约三周出现。首先通过机械采集菌落，然后以单细胞酶促传代。
建立人类成纤维细胞培养物
当人类成纤维细胞培养物增长到融合并显示接受的形态时，首先将其扩增并冷冻两次（ 图2B ）。
使用SeV载体重编程人成纤维细胞
在SeV转导后的几天发现细胞死亡水平升高，观察到成纤维细胞形态的轻微变化。从转导后第12天检测到第一个hiPS菌落的出现（ 图2A ，2C ）。准备挑选的殖民地预计在转导后约3至4周（ 图2A ，2D ）。本方案规定量的播种细胞导致大量的菌落出现（<20）。推荐选择显示有利形态的菌落。菌落特征优选包括扁平的细胞团块，生长为均质单层，可区分的indi具有朝向周围成纤维细胞的锐利边缘的视细胞（ 图2D ）。使用手术刀将hiPS细胞集落切成网格状图案并机械传代（ 图2E ）。将选择的hiPS克隆放置48小时以粘附到板上，无中等变化。 hiPS细胞克隆是高度均匀的，但是在前两次传代期间，耐受来自重编程板的少量成纤维细胞（ 图2F ）。应避免使用繁杂的边界和大的不稳定的异质细胞团的采集（ 图2G ）。获得的hiPS细胞系生长为致密单层，具有大的细胞核与细胞质比例，并具有定义的发光边界。相比之下，丢弃不符合这些标准的粘附的非均质菌落（ 图2H ），以避免混合细胞群的培养。
p“fo：keep-together.within-page =”1“>确认hiPS细胞克隆在SeV载体丢失之后进行衍生细胞的多能性表征，并且通过内源因子的表达驱动多能状态的维持。在进行hiPS细胞验证之前，请确保SeV载体表达已丢失。按照本方案，SeV载体RNA根据我们的经验不再能被第12代检测到，因此是合适的表征起点（ 图3A ）。多能性标记物OCT4，SSEA4和NANOG的免疫细胞化学染色应产生均匀的阳性结果（ 图3B ）。丢弃含有不表达多能性因子的部分重编程细胞的细胞培养物（ 图3C ）。内源性多能性基因的mRNA表达由实时PC显示 R（RT-PCR）。
多能干细胞应该能够容易地分化成三个胚层。通过形成胚状体（EB） 18评估hiPS细胞分化潜能。 图3E显示了由hiPS细胞产生的游离的浮游细胞， 图3F表示21天EB分化后的胚层特异性标志物的mRNA表达。
图1：从皮肤活检到hiPS细胞的流程图。
协议关键步骤概述。该图包括活组织检查收集，成纤维细胞分离，SeV转导，克隆菌落和hiPS细胞的克隆扩增。e.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图2：hiPS细胞产生的关键步骤。
（A）时间表突出了方案中的重要时间点，包括成纤维细胞电镀，SeV转导，介质变化和涂层。作为表征实验的开始，突出显示了hiPS细胞的通道12。 （B）具有典型形态的培养中汇合成纤维细胞的明场图像。 （C）来自转导的成纤维细胞的hiPS细胞集落的出现。 （D）准备选择显示优势特征的菌落，扁平的细胞团，具有尖锐边缘的可区分的单个细胞朝向周围的成纤维细胞（通道0）。 （E） hiPS将细胞集落切成网状样并机械传代。 （F）经过几天的生长之后的附属殖民地。附着的hiPS细胞被异常高数量的来自重编程板的成纤维细胞包围。成纤维细胞可以刮板，并且很可能随着单细胞传代而消失（第1段）。 （G）展示形态学的殖民地不会让人想起完全重编程的细胞;繁琐的边界，大的不稳定的异质细胞团。 （H）与高度异质的细胞系相比，明亮的视野图像例证了早期传代的同源完全重编程的hiPS细胞系。刻度尺表示100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：hiPS细胞的表征。
（A） SeV载体特异性标记物的RT-PCR。第3代的hiPS细胞用作重编程载体1的阳性对照。在第12代，细胞对病毒特异性标记物仙台特异性骨架（SeV B），仙台特异性KLF4（KLF4 SeV），仙台特异性cMYC（cMYC SeV），PCR对照（GAPDH））和无模板（ - ）的表达是阴性的。 （B）在第12代完全重编程的均质hiPS细胞系的代表性实例。hiPS细胞的明亮的图像显示细胞在紧密的单层中生长，具有明显的发光边缘以及大的细胞核和小的细胞质。多能性标记物OCT4，NANOG，SSEA4和核染色4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的免疫细胞化学染色显示均匀的阳性表达。 （C）显示多能性标记NANOG的异质表达的细胞系。文化e包含部分重编程细胞，应丢弃。 （D）多能性标记物NANOG，OCT4，PCR对照（GAPDH）的mRNA表达的RT-PCR，并且没有指示多能性标记物的表达的模板（ - ）。 （E）由hiPS细胞产生的自由漂浮的胚状体。 （F） 21天胚胎体分化后的RT-PCR显示，衍生的hiPS细胞能够分化成三个胚层。内皮标记物AFP和GATA4，中胚层标志物RUNX和HAND1，外胚层标记物NCAM和NESTIN，PCR对照（GAPDH）和无模板（ - ）。刻度尺表示100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议的预期结果是成功生成几个克隆导出的hiPS细胞系。重要的是，这里描述的用于维持和扩增所建立的hiPS细胞的方法是可靠的，并且可以以少量干细胞培养的经验进行。已知使用ROCKi与LN-521基因进行单酶细胞传代，将细胞维持在核型正常，多能性和易于分化，同时避免诱导的异质性，基于集落的传代可刺激10,19,20。在LN-521上培养的hiPS细胞可以作为单细胞传代，而不添加ROCKi 10 ，然而ROCKi的添加使得对于较少经验的处理程序的方案更容易，并减少hiPS细胞衍生所需的时间。
重编程效率是ge这个协议不是一个问题; SeV载体对于成纤维细胞11具有相对高的重编程效率> 1％。预计出现大量殖民地（<20）。建议选择需要的菌落数量的三倍。已经观察到，挑选的克隆的一部分在拾取后不能粘附。也可能需要额外的殖民地来补偿部分重编程的菌落。部分重编程的菌落在某些情况下能够通过SeV载体的多能性基因的外源表达来支持和附着。当SeV载体被稀释时，这些细胞将停止增殖和解离，通常在6-8周围显现。文化的异质性也是部分重编程序的一个标志，异质系列应该被丢弃（ 图2H ）。
重编程载体和培养条件的最佳选择取决于生成细胞的目的。然而，为了避免影响结果的批次间差异，建议使用定义的条件。建议选择非整合载体系统来保护重编程细胞的基因组完整性。 SeV载体在本协议中被选择，这是由于其鲁棒性，效率相对较高以及所需的手动操作时间短。 SeV载体在细胞分裂期间稀释，并且在通道12周围不可检测，从而确保生成的数据不受外源表达的影响。由于对临床目的细胞的细致要求，SeV重编程可能是临床翻译的障碍，因为证明所有载体材料的完全脱落是困难的。如果在细胞治疗中导出预期用途的细胞，则mRNA介导的重编程可能是有利的。然而，这些方法劳动密集度更高，使用更复杂21 。这里的方法划痕成纤维细胞培养也不适合临床应用。由于FBS和明胶都是异种的和未定义的，所以考虑将它们转换为定义的不含异丝蛋白的产品22 。
在使用任何形式的细胞培养时，推荐使用无菌处理技术和常规支原体感染检测。人体皮肤含有许多微生物，如果不妥善处理，细胞培养的条件可以繁殖。因此，建议在处理皮肤活组织检查时以及在活组织检查处理后的培养的第一天内要特别警惕。实际上，皮肤活检的成纤维细胞培养确实是一个耗时的过程。加工皮肤活检后，首先会出现成纤维细胞黏附的弱迹象，因此至少要等待一周，以找到一些显示培养物中预期形态的成纤维细胞。建立成纤维细胞所需的时间来自活组织检查的体外培养取决于多种因素，包括活检的大小，供体的年龄以及活检已被处理以来的活动。优选重新编程早期传代成纤维细胞以获得最佳重编程效率23 。
总之，我们在这里描述了一种建立的强大且易于使用的产生高度均匀的hiPS细胞的方法。
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Disclosures
作者没有报告利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到SSF（B13-0074）和VINNOVA（2016-04134）资助者的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 mL tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 mL | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Sealing plates for storage |
References
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