Summary

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Published: July 07, 2017
doi:

Summary

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Abstract

Xeno-vrije en volledig gedefinieerde condities zijn belangrijke parameters voor robuuste en reproduceerbare generatie van homogene, geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen. Onderhoud van hiPS-cellen op feedercellen of ongedefinieerde matrices zijn vatbaar voor batchafwijkingen, pathogene verontreiniging en risico op immunogeniciteit. Het gebruik van de gedefinieerde recombinant humane laminin 521 (LN-521) matrix in combinatie met xenovrije en gedefinieerde media formuleringen vermindert de variabiliteit en zorgt voor een consistente generatie van hiPS cellen. De Sendai-virus (SeV) -vector is een niet-integrerend RNA-systeem, waardoor problemen die verband houden met het potentiële ontwrichtende effect op genoomintegriteit die integratie-vectoren kunnen hebben, worden omzeild. Bovendien hebben deze vectoren relatief hoog rendement bij de herprogrammering van dermale fibroblasten aangetoond. Bovendien vergemakkelijkt enzymatische single cell passage van cellen homogeen onderhoud van hiPS cellen zonder aanzienlijke eerdere ervaring van stamcellenLl cultuur. Hier beschrijven we een protocol dat uitgebreid getest en ontwikkeld is met een focus op reproduceerbaarheid en gebruiksgemak, waardoor een robuuste en praktische manier is om gedefinieerde en xeno-vrije humane hiPS-cellen van fibroblasten te genereren.

Introduction

Sinds de eerste afleiding van hiPS-cellijnen door Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS cellen hebben een nuttig hulpmiddel voor ziekte modelleren, drug ontdekking en als bronmateriaal voor het genereren van celtherapieën in regeneratieve geneeskunde 3 verschaft . HiPS celcultuur is al lang afhankelijk van co-cultuur met fibroblast feedercellen 4 , 5 of op Matrigel 6 en met media formuleringen die foetaal boviene serum (FBS) bevatten. Batch-to-batch varianties zijn een gemeenschappelijk gevolg van de ongedefinieerde aard van deze cultuuromstandigheden, wat resulteert in onvoorspelbare variaties, die een belangrijke bijdrage leveren aan de onbetrouwbaarheid van deze protocollen 7 . De ontwikkeling van gedefinieerd medium, zoals essentiële 8 (E8) 8 en gedefinieerde celkweekmatrices, bijvoorbeeld LN-521 9 , toestaanS voor de oprichting van hoogst reproduceerbare protocollen en hulp bij de robuuste generatie en het onderhoud van homogene hiPS cellen 7 , 8 , 9 , 10 .

Ontwikkeling van integratie gratis herprogrammeringstechnieken is een stap vooruit. Oorspronkelijk was herprogrammering afhankelijk van retrovirale vectoren die willekeurig in het genoom geïntegreerd werden met verstorende effecten op genomische integriteit 11 . Voorschotten in herprogrammeringsmethoden omvatten de ontwikkeling van RNA-gebaseerde vectoren. RNA-vectoren hebben een voordeel ten opzichte van de DNA-gebaseerde herprogrammeringsmethode aangezien onbedoelde integratie via genomische recombinatie niet mogelijk is 12 . SeV-vectoren verschaffen hoge en voorbijgaande expressie van exogene factoren door enkelstrengs RNA zonder een DNA-fase 11 . De herprogrammerende vectoren geleverd door de SeVWorden door de celuitbreiding verdund en worden uiteindelijk uit de cultuur afgevoerd, waardoor een vrije afdrukmogelijkheid voor fotoprints mogelijk is. Daarna is het onderhoud van pluripoten afhankelijk van endogene expressie van de pluripotentiegenen 2 .

Aangezien pioniersvolle therapieën van HiPS-cel beginnen te verplaatsen naar klinische proeven, zijn de eisen aan gestandaardiseerde partijen, reproduceerbaarheid en veiligheid essentiële problemen om 13 aan te pakken. Daarom moeten producten van dierlijke oorsprong worden vermeden. Bijvoorbeeld, het gebruik van xenogene producten is geassocieerd met het risico op nonhuman pathogeen besmetting. Ook hebben cellen die zijn gekweekt in aanwezigheid van dierlijke afgeleide cultuurcomponenten, aangetoond dat niet-humane siliaczuren in celmembranen worden opgenomen, die dreigen om afgeleide cellen immunogene 14 te maken . Daarom is de noodzaak om xenogene producten te elimineren nodig voor toekomstige klinische werkzaamheden. Dit protocol is van toepassing op xeGeen-vrije en gedefinieerde cultuur bij het behoud van hiPS-cellen die cellen dichter bij de klinische naleving bewegen.

Dit protocol beschrijft een consistente, zeer reproduceerbare en makkelijk te gebruiken methode die gestandaardiseerde hiPS cellen van fibroblasten genereert. Het biedt ook een gebruiksvriendelijk cultuursysteem voor het behoud van gevestigde hiPS-cellen. Dit protocol is gebruikt om meer dan 300 hiPS-cellijnen af ​​te leiden in de Zweedse nationale menselijke iPS Core-faciliteit van het Karolinska Institutet, waarvan sommige lijnen eerder 15 , 16 zijn beschreven.

Protocol

De inzameling van patiënt materiaal en afleiding van hiPS cellen is goedgekeurd door de Ethics Review Board, Stockholm, 28 maart 2012, Registratienummer: 2012 / 208-31 / 3. Celcultuurstappen dienen in biosafety kasten te worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld. Gebruik altijd steriele hanteringstechnieken bij het werken met cellen. Laat de media, platen en reagentia de kamertemperatuur bereiken voordat u begint. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 bij hoge vochtigheid. 1. Isolati…

Representative Results

Van biopsie naar hiPS-cellen Het gehele proces van biopsie naar gevestigde hiPS-cellen, waarbij u de programmeringsvector opnieuw wilt programmeren en klaar voor karakterisering, duurt ongeveer 16 weken ( Figuur 1 ). Een meer gedetailleerde tijdlijn is gespecificeerd in figuur 2A . Ongeveer 4 weken is nodig om fibroblastculturen vast te stellen en uit te breiden. De eers…

Discussion

Het verwachte resultaat van dit protocol is de succesvolle opwekking van verschillende clonaal afgeleide hiPS-cellijnen. Belangrijk is dat de methode voor het onderhoud en uitbreiding van gevestigde hiPS-cellen hier beschreven, betrouwbaar is en kan worden uitgevoerd met weinig eerdere ervaring van stamcelcultuur. Enzymatische single cell passaging met ROCKi samen met de LN-521 matrix is ​​bekend om cellen als karyotypisch normaal, pluripotent te handhaven en gemakkelijk in staat te differentiëren, terwijl geïndus…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door SSF (B13-0074) en VINNOVA (2016-04134) financieringsagenten.

Materials

Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
PenicillinStreptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 ml tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 ml tube Eppendorf 0030123.301 1.5 ml tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 ml VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

Play Video

Cite This Article
Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

View Video