Summary

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Published: July 07, 2017
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Summary

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Abstract

As condições Xeno-free e totalmente definidas são parâmetros fundamentais para a geração robusta e reprodutível de células de vástago pluripotente induzido por humanos (hiPS) homogêneas. A manutenção das células HiPS em células alimentadoras ou matrizes indefinidas são susceptíveis a variantes do lote, contaminação patogênica e risco de imunogenicidade. A utilização da matriz de laminina humana recombinante definida 521 (LN-521) em combinação com formulações de meios sem xeno e definidas reduz a variabilidade e permite a geração consistente de células hiPS. O vetor de vírus Sendai (SeV) é um sistema não-integrante baseado em ARN, evitando assim preocupações associadas ao potencial efeito disruptivo sobre a integridade do genoma que os vetores de integração podem ter. Além disso, esses vetores demonstraram eficiência relativamente alta na reprogramação de fibroblastos dérmicos. Além disso, o envio enzimático de células únicas de células facilita a manutenção homogênea de células HiPS sem experiência substancial antes de troncoCultura. Aqui descrevemos um protocolo que foi amplamente testado e desenvolvido com foco na reprodutibilidade e facilidade de uso, proporcionando uma maneira robusta e prática de gerar células HiPS humanas definidas e sem xeno de fibroblastos.

Introduction

Desde a primeira derivação das linhas celulares hiPS por Takahashi et al. 1 , 2 , as células HiPS forneceram uma ferramenta útil para modelagem de doenças, descoberta de drogas e como material de origem para a geração de terapias celulares em medicina regenerativa 3 . A cultura de células hiPS tem sido dependente da co-cultura com células alimentadoras de fibroblastos 4 , 5 ou em Matrigel 6 e com formulações de mídia contendo soro bovino fetal (FBS). As variações de lote para lote são uma conseqüência comum da natureza indefinida dessas condições de cultura, resultando em variações imprevisíveis, o que é um dos principais contribuintes para a falta de confiabilidade desses protocolos 7 . O desenvolvimento de um meio definido como Essential 8 (E8) 8 e matrizes de cultura de células definidas, por exemplo, LN-521 9 , permitemS para o estabelecimento de protocolos altamente reprodutíveis e ajuda na geração e manutenção robustas de células hips homogêneas 7 , 8 , 9 , 10 .

O desenvolvimento de técnicas de reprogramação livre de integração tem sido um salto em frente. Originalmente, a reprogramação dependia de vetores retrovirais que se integrassem aleatoriamente ao genoma com efeitos disruptivos sobre a integridade genômica 11 . Os avanços nas metodologias de reprogramação incluem o desenvolvimento de vetores baseados em ARN. Os vetores de ARN têm uma vantagem sobre o método de reprogramação baseado em DNA, uma vez que a integração não intencional através da recombinação genômica não é possível 12 . Os vetores SeV fornecem expressão elevada e transitória de fatores exógenos através de ARN de cadeia simples sem uma fase de DNA 11 . Os vetores de reprogramação entregues pela SeVSão diluídos durante a expansão celular e, eventualmente, derramam da cultura, fornecendo um modo de reprogramação livre de pé-impressão. Posteriormente, a manutenção da pluripotência é dependente da expressão endógena dos genes de pluripotência 2 .

À medida que as terapias baseadas em células HiPS pioneiras estão começando a se mover para ensaios clínicos, as demandas de lotes, reprodutibilidade e segurança padronizados são questões essenciais para abordar 13 . Portanto, os produtos de origem animal devem ser evitados. Por exemplo, o uso de produtos xenogênicos tem sido associado ao risco de contaminação por agentes não humanos. Além disso, as células cultivadas na presença de componentes de cultura derivados de animais demonstraram incorporar ácidos siliac não humanos em membranas celulares que ameaçam tornar as células derivadas imunogênicas 14 . Portanto, a necessidade de eliminar produtos xenogênicos é necessária para qualquer atividade clínica futura. Este protocolo aplica xeCultura sem livre e definida na manutenção das células móveis do hiPS que se deslocam para as células mais próximas do cumprimento clínico.

Este protocolo descreve um método consistente, altamente reprodutível e fácil de usar, que gera células HiPS padronizadas a partir de fibroblastos. Ele também oferece um sistema de cultura fácil de usar para a manutenção de células HiPS estabelecidas. Este protocolo foi usado para derivar mais de 300 linhas celulares de hiPS na instalação nacional sueca de iPS Core em Karolinska Institutet, das quais algumas linhas já foram descritas 15 , 16 .

Protocol

A coleção de material do paciente e derivação de células HiPS é aprovada pelo Ethics Review Board, em Estocolmo, 28 de março de 2012, número de registro: 2012 / 208-31 / 3. As etapas de cultura de células devem ser realizadas em gabinetes de segurança de biossegurança, salvo indicação em contrário. Sempre pratique técnicas de manuseio estéril ao trabalhar com células. Permita que a mídia, placas e reagentes atinjam a temperatura ambiente antes de começar. Incubar células a 37 ° C, 5% de CO 2</s…

Representative Results

Da biópsia às células hiPS Todo o processo, desde a biópsia até as células hiPS estabelecidas, sem vetor de reprogramação e pronto para caracterização, leva aproximadamente 16 semanas ( Figura 1 ). Uma linha de tempo mais detalhada é especificada na Figura 2A . Aproximadamente 4 semanas são necessárias para estabelecer e expandir as culturas de fibroblastos….

Discussion

O resultado esperado deste protocolo é a geração bem-sucedida de várias linhas de células hiPS derivadas de clonação. Importante, o método para a manutenção e expansão de células estabelecidas de hiPS aqui descritas é confiável e pode ser realizado com pouca experiência prévia de cultura de células-tronco. A migração de célula única enzimática com ROCKi juntamente com a matriz LN-521 é conhecida por manter as células como cariotípicamente normais, pluripotentes e prontamente capazes de se difere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por agentes de financiamento SSF (B13-0074) e VINNOVA (2016-04134).

Materials

Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
PenicillinStreptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 ml tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 ml tube Eppendorf 0030123.301 1.5 ml tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 ml VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting

References

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Cite This Article
Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

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