Påvisande av entrohemoragiska Escherichia Coli koloniseringen i murina mottagande av icke-invasiva In Vivo Mareld System
Summary
Ett detaljerat protokoll av en musmodell för entrohemoragiska E. coli (EHEC) koloniseringen med hjälp av Mareld-märkt bakterier presenteras. Påvisande av dessa självlysande bakterier av en icke-invasiv i vivo imaging system med levande djur kan avancera vår nuvarande förståelse av EHEC colonization.
Abstract
Entrohemoragiska E. coli (EHEC) O157: H7, som är en livsmedelsburna patogener som causesdiarrhea, hemorragisk kolit (HS), och Hemolytiskt uremiskt syndrom (HUS), kolonisera till tarmkanalen av människor. För att studera detaljerade mekanismen av EHEC colonization in vivo är det viktigt att ha djurmodeller att övervaka och kvantifiera EHEC colonization. Vi visar här en mus-EHEC colonization modell genom att omvandla självlysande uttrycker plasmiden att EHEC att övervaka och kvantifiera EHEC kolonisationen i levande värdar. Djur som inokulerats med Mareld-märkt EHEC Visa intensiva självlysande signaler hos möss genom detektion med en icke-invasiv i vivo imaging system. Efter 1 och 2 dagar efter infektion, kunde självlysande signaler fortfarande upptäckas hos infekterade djur, vilket antyder att EHEC kolonisera i värdar för minst 2 dagar. Vi visar också att dessa självlysande EHEC lokalisera till mus tarmen, speciellt i blindtarmen och tjocktarmen, från ex vivo bilder. Denna mus-EHEC colonization modell kan fungera som ett verktyg att avancera den aktuella kunskapen om EHEC colonization mekanismen.
Introduction
EHEC O157: H7 är en patogen som orsakar diarré1, HS2, HUS3och även akut njursvikt4 genom förorenat vatten eller mat. EHEC är en patogena enterobacterium och colonizes till mag-tarmkanalen människor1. När EHEC följer först värd intestinal epitel, injicera de colonization faktorerna i värdceller genom typ III-sekretionssystemet (T3SS) som fungerar som en molekylär spruta förmå en fästa och utplåna (A/E) lesion därefter att genomdriva adhesion (kolonisation)5. Dessa gener som är involverade i A/E lesion formation kodas av locus av enterocyter utplåning (LEE) patogenicitet island5.
Mareld är en ljus-producerande kemisk reaktion, i vilka luciferas katalyserar dess substrat luciferin för att generera synliga ljus6. Detta enzymatisk process kräver ofta närvaro av syre eller adenosintrifosfat (ATP)6. Mareld imaging (BLI) tillåter forskare visualisering och kvantisering av värd-patogen interaktioner i levande djur7. BLI kan karakterisera bakterieinfektion cykeln i levande djur genom att följa de självlysande bakterierna som de migrerar till och invadera olika vävnader7; Detta avslöjar en dynamisk progression av infektionen. Dessutom är bakteriehalten i djur relaterad till den självlysande signal8; Därför är det en bekväm indikator att uppskatta de sjukliga tillstånd försöksdjur på ett enkelt och direkt sätt.
Plasmiden används här innehöll luciferas operon, luxCDABE, som är från bakterien Photorhabdus hjälp som kodar egna luciferas substrat7,9. Genom att omvandla denna luciferas-uttryckande plasmid till bakterier, kan colonization och infektion processerna övervakas genom att observera dessa självlysande bakterier i levande djur. Sammantaget tillåter BLI och Mareld-märkt bakterier forskare att övervaka bakteriell siffrorna och läge, bakteriell bärkraft med antibiotika/terapi behandling och bakteriell genuttryck i infektion/kolonisering6, 7. många patogena bakterier har rapporterats att uttrycka den luxCDABE operon att undersöka deras infektion cykel och/eller gen uttryck i infektion. Dessa bakterier, inklusive uropathogenic E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. coli (EPEC)8, Citrobakter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, och Vibriocholerae20, har dokumenterats.
Flera experimentella modeller har utvecklats för att underlätta studiet av EHEC colonization in vitro- och in-vivo21,22,23. Det finns dock en brist på lämplig djurmodeller studera den EHEC koloniseringen i vivo, och därmed en resulterande bristen på Detaljer. För att underlätta studiet av den EHEC colonization mekanism i vivo, är det värdefullt att bygga djurmodeller för att observera och kvantifiera EHEC kolonisationen i levande djur i en icke-invasiv metod.
Detta manuskript beskriver en mus-EHEC colonization modell som använder en självlysande uttrycker system för att övervaka EHEC colonization över tid i levande värdar. Möss är intragastrically inokuleras med Mareld-märkt EHEC och den självlysande signalen detekteras hos möss med en icke-invasiv i vivo imaging system13. Möss infekterade med Mareld-märkt EHEC visade betydande självlysande signaler i deras tarmen efter 2 dagar efter infektion, som föreslog att dessa bakterier koloniserade i tarmen värd efter 2 dagar efter infektion. Ex vivo bilddata visade att denna kolonisering är specifikt i blindtarmen och tjocktarmen av möss. Genom att använda denna mus-EHEC modell, kan självlysande EHEC koloniseringen upptäckas i den levande mottagande av en in-vivo imaging system, för att studera de detaljerade mekanismerna av enteriska bakterier kolonisering, som kan främja ytterligare förståelse i EHEC-inducerad fysiologiska och patologiska förändringar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har rapporterats att EHEC omvandlas med luciferas plasmid har utnyttjats för att undersöka dess lokalisering i värdar eller gen uttryck i vivo8,11,12. Murina modellen visat här har också rapporterats att upptäcka EHEC koloniserade timing och lokalisering i murina värd8. Dock ger vi protokollet detalj att administrera EHEC inympning till möss intragastrically och hur noggrant förbered…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Chi-Chung Chen från Institutionen för medicinsk forskning, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) för hjälpen i mus infektion och stöd från stadens laboratorium djur National Cheng Kung University. Detta arbete stöds av den Minister av vetenskap och teknik (de flesta) bidrag (mest 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) till CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
References
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
- Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
- Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
- Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
- Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
- Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
- Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
- Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
- Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
- Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
- Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
- Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
- Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
- Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).
