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Chemistry

आरएनए के ओलिगोमर्स के ठोस चरण संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल जिसमें 2'- Published: July 28, 2017 doi: 10.3791/56189
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, University of Colorado Denver

Summary

यह लेख सी 2- ओ- रिप्लेसमेंट में संशोधित आरएनए के डोडेकमर्स के ठोस चरण संश्लेषण, शुद्धि और लक्षण वर्णन पर एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है। यूवी-विज़ और सर्कुलर डिचोरिजम फोटेट्रिक विश्लेषण का उपयोग स्ट्रक्चरल पहलुओं को मापने और चिह्नित करने के लिए किया जाता है, अर्थात् एकल स्ट्रैंड या डबल-स्ट्रैंड्स।

Abstract

ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग न्युक्लिक एसिड के कैनोनिकल और संशोधित पॉलिमर प्राप्त करने के लिए किया गया है, विशेष रूप से डीएनए या आरएनए, जिसने इसे विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों के लिए और विभिन्न शोध उद्देश्यों के लिए एक लोकप्रिय पद्धति बना दिया है। यहां वर्णित प्रक्रिया में आरएनए 5 '- [सीयूए सीजीजी एएयू सीएयू] -3' के संश्लेषण, शुद्धि और लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया गया है- सी 2 ' ओ- ओपीओशन' पर स्थित शून्य, एक या दो संशोधनों वाला जांच 2-थियोफिनेल्मिथेटिल समूहों पर आधारित होती है, जो मानक कार्बनिक संश्लेषण के माध्यम से आरएनए न्यूक्लियोटाइड्स में शामिल होते हैं और संबंधित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में उनके संबंधित फॉस्फोरामिडाइट्स के माध्यम से पेश होते हैं। इस रिपोर्ट में चार विहित न्यूक्लियोबेस (uridine (यू), साइटोसिन (सी), guanosine (G), एडेनोसाइन (ए)), और साथ ही 2-thiophenylmethyl क्रियाशील न्यूक्लियोटाइड 2'- हे पर संशोधित के माध्यम से phosphoramidite रसायन विज्ञान का उपयोग करता है - पद; हालांकि, एक बड़े var के लिए कार्यप्रणाली योग्य हैवर्षों में विकसित किए गए संशोधनों की मीठी। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एक नियंत्रित-ताकना कांच (सीपीजी) समर्थन पर संश्लेषित किया गया, जिसके बाद मानक शर्तों के तहत राल और वंशानुक्रम से क्लेवेज किया गया, अर्थात् अमोनिया और मेथाइलामाइन (एएमए) का मिश्रण हाइड्रोजन फ्लोराइड / ट्राईथाइलैमाइन / एन-मेथिलपीरोलिडीनोन द्वारा पीछा किया गया। इसी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को पॉलिएक्लाइमाइड वैद्युतकणसंचलन (20% डेंटलिंग) के माध्यम से शुद्ध किया गया था, इसके बाद उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी (सेप-पीक, सी 18 -column) के माध्यम से अलौकिक, डिसलाटिंग और अलगाव किया गया था। क्रमशः और संरचनात्मक पैरामीटर को क्रमशः पराबैंगनी-दृश्य (यूवी-विज़) और सर्कुलर डिचोरिज्म (सीडी) फोटोटेट्रिक विश्लेषण के माध्यम से मूल्यांकन किया गया। इस रिपोर्ट का उद्देश्य इस क्षेत्र में शुरू करने वाले इच्छुक और विशेषज्ञ शोधकर्ताओं के लिए संसाधन और मार्गदर्शन के रूप में सेवा करना है। उम्मीद है कि नई प्रौद्योगिकियों और तरीकों के विकास के कार्य-प्रगति के रूप में कार्य करना होगा। थी के भीतर तरीकों और तकनीकों का विवरणएस दस्तावेज़ एक डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र (2013 में नवीनीकृत और खरीदा गया) के अनुरूप है जो फास्फोरैमिडीट रसायन विज्ञान का उपयोग करता है

Introduction

डीएनए / आरएनए के oligonucleotides प्राप्त करने के लिए ठोस चरण संश्लेषण एक शक्तिशाली उपकरण है, जो 1 9 2 के 1 , 2 , 3 के बाद से विभिन्न क्षेत्रों में फ़ॉस्फोरामिडाइट बिल्डिंग ब्लॉक 4 का उपयोग करते हुए कई अनुप्रयोगों का उपयोग किया है। इसके व्यापक प्रभाव के उदाहरणों में शामिल हैं: लेबलिंग (क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रियाओं के माध्यम से ) 5 , संरचनात्मक जांच 6 , और एंटीसेन्स टेक्नोलॉजीज 7 के साथ-साथ जैविक तंत्र 8 , 9 , अपनी जेनेटिक सामग्री 10 के स्रोत, और अध्ययन कई प्राकृतिक और / या रासायनिक संशोधनों 11 , 12 , कई अन्य लोगों के बीच में। संशोधन जो हम यहां उपयोग करते हैं वह आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स प्राप्त करने के हमारे प्रयासों में पहला कदम दर्शाता हैइस महत्वपूर्ण बायोपॉलिमर के संरचना और कार्य के अस्थायी नियंत्रण को सक्षम करने के लिए फोटोएक्टिव जांच

अनुक्रमों के साथ आरएनए डोडेकैमर्स के संश्लेषण: 5 '- [सीयूए सीजी जी ए एयू केयू] -3' / 5 '- [AUU AUU CCG UAG] -3' (रेखांकित पदों में एक सी 2 ' ओ- थिफ़ेनेमिलिथिल संशोधन का समावेश होता है ) इस अध्ययन के फोकस का गठन किया है। अनुक्रम को आरआईए किलों की मात्रा को मापने और एकल किस्में के रूप में मापने के लिए चुना गया था, या उनके संबंधित द्वैध संरचनाओं के रूप में (अन्य माध्यमिक संरचनाओं को थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर के रूप में नहीं बताया गया था)। सीडी का उपयोग स्ट्रक्चरल मापदंडों, यानी डुप्लेक्स गठन और थर्मल डिनटैचरेशन ट्रांज़िशन की स्थापना के लिए किया गया था।

संश्लेषण
इन oligonucleotides प्राप्त करने के लिए समग्र प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है और stepwise प्रक्रिया का पालन करती है: स्वचालित ठोस चरण संश्लेषण → Deprओटेक्शन → शुद्धि → मात्राकरण → विशेषता चित्रा 2 चित्रा 2 इस प्रक्रिया में आवश्यक है कि monomeric इकाइयों को प्रदर्शित करता है। आरएनए का ठोस चरण संश्लेषण डीएनए के समान है, जो कि फॉस्फोरैमिडीइट रसायन ( चित्रा 2 , बाएं) पर आधारित है और जी, ए और सी पर न्यूक्लियोफिलिक एक्सोक्लेक्लिक एमाइंस के लिए आधार-लैबिल रक्षा समूहों का उपयोग, जैसे , एसिटाइल, बैन्जॉयल, फेनोनैक्सीटिल, टी- ब्यूटी या एन , एन- डायमिथाइलफार्माइड ( चित्रा 2 , दाएं)। सी 2'-ओएच समूह (डीओकोनीओलिऑनियोलियोटइड बायोपॉलिमर्स में कमी) की उपस्थिति के कारण आरएनए में विचार करने के लिए एक और पहलू है, यह अतिरिक्त कदम है जिसे सुरक्षा के लिए शामिल किया जाना है, और बाद में इस न्यूक्लेओफिलिक स्थिति की deprotection। इस संबंध में, सिलिकॉन-आधारित सुरक्षा समूह एक आकर्षक रणनीति बन गए हैं क्योंकि जैवघटोगात्मक moieties (विशिष्ट सभीवाई फ्लोटोराइड की उपस्थिति में deprotected), टीआरटी -बल्टिडाइमथाइलसिलील (टीबीडीएमएस) और ट्राइज़ोप्रोपल्स्सिल्लोक्सीमाइथाइल (टॉम) समूहों के साथ लोकप्रिय विकल्प ( चित्रा 2 , नीचे-बाएं) के साथ।

इस काम में, स्वचालित संश्लेषण डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र पर किया गया था जो मानक फॉस्फोरामिडाइट रसायन विज्ञान का उपयोग करता है। उपकरण पर निर्माता सेटिंग्स में डीएनए के लिए फॉस्फोरैमिडीइट के व्यावसायिक संस्करणों का उपयोग करते समय एक स्वचालित कमजोर पड़ने का चरण शामिल होता है, या उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मात्रा में कमजोर करने का विकल्प। हालांकि, हमने आरएनए फॉस्फोरैमिडिइट का वजन करने का निर्णय लिया और मैन्युअल रूप से इसे पतला किया: 1) आरएनए के कैनोनिकल फॉस्फोरामिडाइट्स की कीमत अधिक है (कुछ मामलों में 50 गुना अधिक महंगा); 2) संशोधित फॉस्फोरमिडिट्स अक्सर छोटी मात्रा में प्राप्त होती हैं; और 3) एक स्वचालित कमजोर पड़ने का कदम (निर्माता द्वारा निर्धारित) का उपयोग करने पर व्यर्थ सामग्री की मात्रा बड़ी है इसके अलावा, हमने इस्तेमाल किया: 1) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ठोस समर्थन( उदाहरण के लिए , सीपीजी) जिसमें 3-अंत के रूप में काम करने के लिए संरक्षित न्युक्लोबबेस होता है; और 2) वाणिज्यिक फॉस्फोरियमिडिट्स (कैनोनिकल न्यूक्लियोबासिस) को सी 2'- ओ- बिज़िशन में एक टीबीडीएमएस समूह के साथ संरक्षित किया गया है। संश्लेषण चरणों की विस्तृत सूची चित्रा 3 और तालिका 1 में प्रदान की गई है, साथ में अधिक विवरण और आरएनए संश्लेषण के लिए समायोजित चरणों के लिए टिप्पणियों के साथ। इसके अलावा, चित्रा 4 में 'ट्राइटिल मॉनिटर' विकल्प चुनने के बाद प्रत्येक चरण के लिए देखे जाने वाले चरण-योग्य उपज को दिखाया गया है, जो प्रत्येक डिट्रिटिएलेशन चरण से रिलीज किए गए ट्रैटल कथन का परिमाण करता है।

यह ध्यान देने योग्य है कि आम तौर पर, हमारे अनुभव में, सीमित कारक फ़ॉस्फोरामिडाइट प्राप्त कर रहा था जिसमें वांछित संशोधन होता था। यही है, एक सिंथेटिक पद्धति का विकास जो कि चयनित साइटों पर संशोधनों को शामिल करने की अनुमति देता है। इस रिपोर्ट में, हम इस पर ध्यान देते हैंएक संशोधित न्यूक्लियोटाइड का समावेश जिसमें हमने इसी सिंथेटिक पद्धति को स्थापित किया है, सी 2'- ओ- थिफ़ेन्इलमैथाइल समूह। यह समूह आकार में छोटा है और किसी भी तरह से ठोस चरण संश्लेषण को प्रभावित नहीं करता है। चूंकि इस समूह को आरएनए के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड में शामिल किया गया है, संरचनात्मक और थर्मोडायनामिक मापदंडों के साथ 4 , संशोधित फॉस्फोरमिडितों के लिए अग्रणी कार्बनिक संश्लेषण के कोई पहलू को यहां वर्णित नहीं किया जाएगा।

Deprotection, शुद्धिकरण, और विशेषता
एक्सोक्स्क्लिक एमाइंस और एसएएस-साइनोइथाइल समूहों की अवरोध सीपीजी-राल से दरार के समान ही होता है। हम एएमए के एक जलीय समाधान की उपस्थिति में प्राप्त राल को गर्म करने की सामान्यतः उपयोग की जाने वाली शर्तों को लागू करते हैं, फ्लोराइड आयनों की उपस्थिति में C2'- O -silyl समूहों के दरार के बाद, और फिर जेल के माध्यम से शुद्धिवैद्युतकणसंचलन। हालांकि ये कई मामलों में मानक स्थितियां बन गए हैं, मूलभूत स्थितियों या फ्लोराइड आयनों के लिए प्रयोगात्मक संशोधनों के लिए मामूली शर्तों 13 , 14 , उदाहरण के लिए , मेथनॉल / पोटेशियम कार्बोनेट (मेओएच / के 2 सीओ 3 ), या बायोलामाइन की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, संबंधित फॉस्फोरैमिडों पर रक्षा समूहों का एक अलग समूह आवश्यक है इसके अलावा, हमने इस पद्धति के साथ पिछले अनुभव को देखते हुए, deprotected oligomers को शुद्ध करने के लिए पसंदीदा विकल्प के रूप में वैद्युतकणसंचलन चुना और अन्य इंस्ट्रूमेंटेशन की कमी। हालांकि, एचपीएलसी वैकल्पिक रूप से प्रभावी विधि 15 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। शुद्ध समूह oligonucleotides की विशेषता जन स्पेक्ट्रोमेट्री, मैट्रिक्स सहायता लेजर desorption / ionization उड़ान के समय के माध्यम से किया गया था (MALDI-TOF), हमारे समूह 16 द्वारा एक रिपोर्ट की प्रक्रिया का उपयोग कर।

संरचनात्मक लक्षण वर्णन और प्राप्त डुप्लेक्स की खराब स्थायित्व सीडी के माध्यम से किया गया था। विशेष रूप से, हम आरएएन के संशोधित और अनअर्डेड ओलिगोनक्लियोटाइड्स के थर्मल विकृतीकरण संक्रमण को सीए पर बैंड की अण्डाकारता में कमी के बाद निर्धारित करने के लिए सीडी का उपयोग करते हैं। 270 एनएम, साथ ही बैंड के लापता होने (नकारात्मक अंडाकारता के साथ) 210 एनएम पर एक λ अधिकतम के साथ। संकरण से पहले और बाद में स्पेक्ट्रा की तुलना उनके मतभेदों को स्पष्ट करने और नियोजित कार्यप्रणाली की मान्यता प्रदान करने के लिए प्रदान की जाती है। सीडी के उपयोग व्यापक रूप से न्यूक्लिक एसिड में संरचनात्मक रूपांकनों के निर्धारण में स्वीकार किया जाता है और 17 aminoacids, और इसलिए विभिन्न संरचनात्मक और thermodynamic के मापदंडों 18 निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में कार्यरत जा सकता है; हालांकि, ऐसे कई उदाहरण नहीं होते हैं जहां तकनीक का उपयोग थर्मल डिनट्राटेशन संक्रमण का आकलन करने के लिए किया जाता है। कुछ मामलों में जी-क्वाड्रैप्लेक्सिस युक्त डीएनए पर थर्मल स्थिरता के निर्धारण शामिल हैंAss = "xref"> 19 , 20 या आरएएनए 21 के डुप्लेक्स और हेयरपिन में

यह रिपोर्ट गैर-विशेषज्ञ रीडर या व्यूअर को ऐसे उपकरणों के सेट प्रदान करने का इरादा रखती है जो इस प्रकार के अनुसंधान के लिए एक सुचारू रूप से शुरुआत करते हैं। यह विज्ञान की इस रोमांचक शाखा में शामिल अन्य अनुसंधान प्रयोगशालाओं में तरीकों और तकनीकों के साथ बढ़ाने और उनकी तुलना करने के लिए काम करेगा। इस रिपोर्ट की सामग्री विभिन्न स्रोतों से इस तकनीक के मौजूदा प्रोटोकॉल को जोड़ती है, और प्रत्येक चरण के लिए दृश्य सहायता के साथ अनुभव को समृद्ध और सुविधाजनक बनाती है।

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Protocol

1. आरएनए ऑलिगोनक्लियोटाइड के ठोस चरण संश्लेषण

  1. प्रत्येक फास्फोरियमिडाइट (तालिका 1) युक्त समाधान तैयार करना
    1. न्यूक्लियोटाइड की संख्या की गणना और n + 1 समीकरण (जहां एन = न्यूक्लियोटाइड की संख्या) में फिट होते हैं, प्रत्येक आधार से मेल खाती हैं और लापता मूल्यों के साथ तालिका में भरें। वॉल्यूम = 0.15 एमएल प्रति न्यूक्लियोटाइड 0.1 एम की एकाग्रता में, निर्जल एसिटोनिट्रिले में भंग।
    2. ओवन सूखे 10 एमएल एम्बर की बोतलों में प्रत्येक फॉस्फोरामिडाइट वजन (सेटलम टॉप एम्बर 394 एमिडाइट 13 एमएम आईडी x 20 एमएम ओडी टॉप) और एक सुखाने एजेंट वाले डिसेकेटर का उपयोग करके वैक्यूम के तहत तुरंत जगह दें।
    3. सूखी आर्गन के साथ डिसेकेटर को भरें, बोतल को हटा दें और उपकरण को सुरक्षित करने से पहले एसिटोनिट्रिले (निर्जल) की इसी राशि के साथ तुरंत कम करें।
      नोट: गैस-तंग सिरिंजों का उपयोग करना सुनिश्चित करें और हर समय निर्जल वातावरण रखें।
    4. बोतल से सेप्टा निकालें और मी पर रखेंएक बोतल परिवर्तन समारोह के माध्यम से, achine
      नोट: संश्लेषण से पहले इस लाइन को प्रत्येक समाधान के लिए अतिरिक्त 0.15 एमएल (इसलिए ऊपर के एन + 1 समीकरण में अतिरिक्त मात्रा) की आवश्यकता है।
  2. सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अनुक्रम और ठोस चरण संश्लेषण की स्थापना ( चित्रा 3 )।
    1. सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करें ( उदाहरण के लिए , ओलिगनेट 1.0.1) और उपकरण नाम चुनें > ठीक है फ़ाइल> न्यू संश्लेषण> आदेश द्वारा एक नया संश्लेषण बनाएं
    2. भरें-इन: तिथि; RunID; उपकरण चुनें; अनुक्रम नाम; अनुक्रम (5'-टू-3 'अंत) के तहत | चक्र, पहले से बनाई गई विधि असाइन करें ( चित्रा 3 )। अंत प्रक्रिया का चयन करें, ( सीपीजी राल के लिए बाध्य oligonucleotide छोड़ देता है)> मैनुअल।
    3. डीएमटी ऑफ का चयन करें > (संश्लेषण के अंत में 5'-ओएच समूह प्राप्त करने के लिए अंतिम चरण में टीसीए उपचार) ; फाइल सहेजें> के रूप में सहेजेंऔर प्रयोग के लिए एक नाम प्रदान करें।
    4. संश्लेषण आदेश शुरू करने के लिए फ़ाइल भेजें> सिंथेसाइज़र को आदेश भेजें और कॉलम चुनें 1-4 सिंथेसाइज़र विंडो खोलें और ट्राइटल मॉनिटर चुनें | फ़ंक्शन | ट्रिटी चुनें | प्रत्येक चरण की निगरानी करें
    5. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की संख्या के आधार पर आवश्यक रूप से दोहराएं, एक बार संश्लेषित किए जाने के लिए (ध्यान दें कि सभी आदेशों का एक ही तरीका होना चाहिए, अर्थात , युग्मन समय और घटनाओं का क्रम)।
    6. सिंथेसाइज़र शुरू करें> शुरू करने के लिए तैयार करें उपकरण पर संकेतित पदों पर वांछित 3'-अंत के साथ कॉलम रखें। उपकरण पर प्रारंभ> नहीं (एबीआई तैयारी के लिए) पर क्लिक करें ।
    7. एक बार संश्लेषण पूरा हो जाने पर, उपकरण से स्तंभ को हटा दें और एक गोल नीचे फ्लास्क में रखें और 0.5 एच के लिए कम दबाव के तहत सुखाने के बाद।
      नोट: यह जांचने की सिफारिश की जाती है कि रैंड में एक गहरे नारंगी रंग का निरीक्षण किया गया हैट्रिपल मॉनीटर फ़ंक्शन से संभावित त्रुटियों से बचने के लिए ओम कप्ललिंग (1.2.4 - 1.2.7 चरणों)।
  3. आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की सुरक्षा और संरक्षण
    1. ब्लैक कैप को घुमाकर कॉलम खोलें और सफेद रेजिन की 1.6 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सभी (या आधा, जरूरत या उद्देश्य के आधार पर) स्थानांतरण करें। मिथाइलैमाइन की 0.5 मिलीलीटर (पानी में 40%) / अमोनिया (पानी में 40%) 1: 1 पर जोड़ें।
    2. पैराफिल के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब कैप सुरक्षित करें और, एक गर्मी-ब्लॉक का प्रयोग करें, 1.5 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी।
      नोट: एक भारी ऑब्जेक्ट ट्यूब के शीर्ष पर रखा जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्रतिक्रिया ट्यूब के अंदर अमोनिया एकाग्रता स्थिर रहता है।
    3. गर्मी ब्लॉक से निकालें और धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर शांत हो जाएं। संक्षेप में सामग्री को स्पिन करने के लिए नमूना को अपकेंद्रित करें, फिर सतह पर तैरनेवाला को एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. तरल नाइट्रोजन (या सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान) में ट्यूब डुबकी करके नमूनों को फ्रीज करें और स्कीन में ध्यान केंद्रित करेंकम दबाव के तहत एक अपकेंद्रित्र में आईएनजी।
    5. एक triethylamine / n-methylpyrrolidinone / triethylamine-trihydrofluoride (2: 2: 3 अनुपात) समाधान के 0.4 एमएल में ठोस पुनः निलंबित समाधान। 1.5 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी, उसके बाद कमरे के तापमान पर धीमी गति से शीतलन।
    6. एक NaOAc समाधान (0.03 एम, पीएच 5.5 - एचसीएल के साथ समायोजित) के 0.04 एमएल जोड़ें, उसके बाद एक विंदुक टिप के साथ कोमल मिश्रण। इथेनॉल (1 एमएल) जोड़ें और सीए के लिए शांत। 15 मिनट के लिए -70 डिग्री सेल्सियस (सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान)
    7. 15,000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस विभाजित करने के लिए विंदुक का प्रयोग करें और कम दबाव के तहत परिणामी गोली को सूखा।
    8. लदान बफर (0.2 एमएल, 90% एसी फार्ममाइड, 1 एमएम ईडीटीए) में प्राप्त ठोस को फिर से निलंबित और मिश्रण सजातीय होने तक मिश्रण।
    9. पहले से तैयार किए गए polyacrylamide जेल पर लोड निलंबन (20% denaturing, अच्छी तरह से आयाम: 30 सेमी x 1 मिमी) 22
    10. ब्रोमोफिनोल नीले मार्कर 1 / 2-2 / 3 के बीच स्थित होने तक जेल के माध्यम से एक मौजूदा आवेदन करेंनीचे जेल (जेल आयाम: ~ 21.5 सेमी x 30 सेमी)।
    11. खड़े से जेल निकालें और कांच से प्लास्टिक की चादर (दोनों तरफ आच्छादित) की जेल सामग्री को स्थानांतरित करें, और बैंड की कल्पना करने के लिए सिलिका (254 एनएम पर फ्लोरोसेंट डाई युक्त) की एक पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) प्लेट पर रखें यूवी-लैंप (λ अधिकतम = 254 एनएम) का उपयोग करना
    12. उस स्थिति को चित्रित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें जहां ऊपरी बैंड स्थित है और इसे नए रेजर ब्लेड के द्वारा काट दिया गया है। एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में आरएनए (प्लास्टिक की चादर के बिना) रखें और एक गिलास रॉड का उपयोग करके छोटे टुकड़ों को कुचल दें।
    13. जेल अवशेषों को एक NaCl aq में निलंबित करें समाधान (2 मिमी, और 1 मिमी EDTA) और 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन को हिलाएं। 10 मिनट के लिए शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र
    14. रिवर्स-चरण सी 18 कारतूस का उपयोग करके निराला
      1. कारतूस को 10 एमएल सिरिंज का प्रयोग करके धो लें:
        एसीटोनिट्रीले (10 एमएल)
        एच 2 हे (दो बार, 10 एमएल)
        5 एमएम एनएच4 सीएल एक समाधान (3 एमएल)
        आरएनए युक्त समाधान, किसी भी जेल अवशेषों को नहीं डालना।
      2. एच 2 ओ (तीन बार, 10 एमएल) के साथ धो लें
      3. 60% aq का उपयोग करके कॉलम से एल्यूट करें मेथनॉल समाधान (3 एमएल)
    15. कम दबाव के तहत ध्यान दें और आरएनस मुक्त पानी (0.3 एमएल) में पुनः भंग।
    16. यूवी-वी स्पेक्ट्रम (200-450 एनएम) को मापने के लिए एक पतला समाधान (10 μL) तैयार करें और यूवी-वीज उपकरण पर 1 μL जमा करें ( जैसे , नैनोड्रॉप)।
    17. प्राप्त समाधान की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए बीयर लंबर्ट के कानून का उपयोग करें:
      समीकरण 1
      जहां ए = प्राप्त अवशोषण; Ε = गणित विलुप्त होने के गुणांक; सी = एकाग्रता, और l = 0.1 1 मिमी की पथ की लंबाई के लिए।
    18. Oligonucleotides के लिए विद्वान विलुप्त होने के गुणांक की गणना; एक ऑन लाइन कैलकुलेटर के साथ यहां गणनाजो डिनामेल सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
  4. MALDI-TOF के माध्यम से एकाग्रता निर्धारण और लक्षण वर्णन
    1. नमूनों को एक मोलिडी प्लेट पर लोड करें, जिसमें विंदुक टिप का उपयोग होता है जो सी 18 टिप के साथ भरी हुई होती है, और प्रत्येक ओलिगोनक्लियोटाइड को दिखता है।
      1. 50% एसिटोनिट्रिअल (10 μL x 2) के साथ टिप धो लें टिप के साथ 0.1% ट्राइफ्लोरोरासिटिक एसिड (टीएफए; 10 μL x 2) समतल बनाना। नमूना के साथ लोड टिप (आमतौर पर 100-150 pmol)।
      2. 0.1% TFA (10 μL x 2) के साथ टिप धो लें, और फिर पानी (10 μL x 2) के साथ।
      3. वांछित मैट्रिक्स युक्त समाधान में नमूना को नमस्कार; हमने निम्न समाधान का प्रयोग किया: 10 μL 25 मिमी -4,6-त्रिहैड्रॉक्सीटाफोनीन मोनोहाइड्रेट (थैप), 10 मिमी अमोनियम साइट्रेट, और 300 एमएम अमोनियम फ्लोराइड 50% एसिटोनिट्रिले में।
      4. 0.9 μL (वायु सुखाने के बाद) जमा करके और आवश्यकतानुसार प्रक्रिया को दोहराते हुए सीधे MALDI प्लेट पर स्पॉट लगाएं।
        नोट: सभी स्पेक्ट्रा परावर्तन सकारात्मक-मोड पर प्राप्त किए गए थे।

2. सीडी के माध्यम से आरएनए संरचना विश्लेषण

  1. सीडी के समाधान की तैयारी
    1. संशोधित आरएनए [3 माइक्रोग्राम], NaCl [10 मिमी], सोडियम फॉस्फेट बफर [10 मिमी, पीएच 7.2] और एमजीसीएल 2 [5 एमएम] युक्त 0.25 एमएल तैयार करें। नमूना विश्लेषण के लिए तैयार है, खासकर यदि यह एक अनिमोलकेयर संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है।
    2. यदि लक्ष्य द्वैध संरचनाओं या बाइमोलेकुलर संक्रमण का विश्लेषण करना है, तो इस समय पूरक (1 दाढ़ी के बराबर, यदि लागू हो) जोड़ें या नीचे दिए गए कदम के साथ जारी रखें।
    3. नमक को गर्मी-ब्लॉक पर रखें, 90 डिग्री सेल्सियस से पहले गरम किया जाता है, और कमरे के तापमान पर धीमा कूलिंग को नियंत्रित करने के लिए गर्मी बंद कर देता है (आमतौर पर 2 - 4 ह)।
  2. स्पेक्ट्रा अधिग्रहण
    1. रिक्त समाधान तैयार करें (NaCl 10 मिमी, सोडियम फॉस्फेट 10 मिमी पीएच 7.3, एमजीसीएल 2 5 मिमी), ट्रांसफर टीओए सूक्ष्म क्युवेट (1 सेमी पथ लंबाई, 250 μL न्यूनतम मात्रा), और साधन के भीतर नमूना परिवर्तक के धारक की स्थिति पर जगह।
    2. नमूना परिवर्तक में एक अन्य सूक्ष्म क्यूवेट और स्थिति में आरएनए युक्त नमूना स्थानांतरण करें। यदि थर्मल डिनट्राइबेशन संक्रमण को मापने, जलीय परत में बाधा डालने के बिना ध्यान से तेल का एक बिस्तर जोड़ें और टेफ्लॉन टेप के एक टुकड़े का उपयोग करके क्युवेट की टोपी सुरक्षित करें।
    3. नाइट्रोजन टैंक को एक प्रवाह प्रदान करने के लिए खोलें जो वायु फ्लेटर को सीए के लिए उपकरण पर स्थित करता है। 40. बारी-बारी से कूलर
    4. उपकरण चालू करें और सॉफ्टवेयर स्पेक्ट्रा मैनेजर आइकन खोलें, फिर अधिग्रहण विंडो स्पेक्ट्रा मापन खोलें।
    5. अधिग्रहण से पहले 5 मिनट के लिए नाइट्रोजन के साथ उपकरण को शुद्ध करें।
    6. निम्न मापदंडों का उपयोग करके स्पेरा प्राप्त करें पैरामीटर और पैरामीटर को निम्नानुसार समायोजित करें:
      1. सामान्य के तहत, चयन करें: 200-350 एनएम स्कैन करें; चैनल सीडी और एचटी: डेटा0.1 एनएम पर पिच; 100 एनएम / मिनट पर गति स्कैन करना; बैंड की चौड़ाई 1 एनएम; 5 में जमाराशि की संख्या
      2. सेल इकाई के तहत, 20 डिग्री सेल्सियस चुनें नियंत्रण के तहत, शटर का चयन करें और स्वचालित रूप से बंद हो जाता है। जानकारी के अंतर्गत, नाम, एकाग्रता, ऑपरेटर चुनें।
      3. डेटा के अंतर्गत, वांछित फ़ोल्डर में ब्राउज़ करें। ठीक क्लिक करें
    7. स्पेक्ट्रा उपाय> नमूना माप प्राप्त करें, नमूना परिवर्तक 1-6 के अनुसार क्यूवेट की स्थिति (एस) की पहचान करें, ठीक क्लिक करें
  3. यदि एक थर्मल विकृतीकरण संक्रमण ले रहे हैं:
    1. बंद अधिग्रहण सॉफ्टवेयर फ़ाइल> बाहर निकलें और एक नया प्रोग्राम चर तापमान मापन> उपाय> पैरामीटर खोलें
    2. थर्मल संक्रमण रिकॉर्ड करने के लिए निम्नलिखित पैरामीटरों को लागू करें, जिसे वांछित के रूप में समायोजित किया जा सकता है:
      1. तापमान के तहत, शुरू अस्थायी चुनें: 4 डिग्री सेल्सियस; अंतराल: 0.2; टाRget: 90 डिग्री सेल्सियस; ढाल: 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट; रुको 0 एस प्रारंभ / अंत के तहत, इच्छित स्थिति के रूप में प्रारंभ स्थिति और अंत स्थिति का चयन करें
      2. सामान्य के अंतर्गत, 3 चैनल, सीडी / एचटी / एब्स चुनें; बैंडविड्थ: 1 एनएम; तरंगलांबी: 270 एनएम (या वांछित) नियंत्रण के तहत, कोई भी नहीं चुनें सूचना के तहत, नाम का चयन करें, एकाग्रता, ऑपरेटर।
      3. डेटा के अंतर्गत, वांछित फ़ोल्डर में ब्राउज़ करें। ठीक क्लिक करें
    3. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस तक और एक स्पेक्ट्रम माप प्राप्त करने से पहले इस तापमान पर 5 मिनट की प्रतीक्षा करें।
  4. स्पेक्ट्रा के लिए डाटा वर्क-अप
    1. सॉफ़्टवेयर पर फ़ंक्शन का उपयोग करना, लक्ष्य अधिग्रहण से रिक्त स्पेक्ट्रम को बफ़र सिस्टम से इस्तेमाल होने वाले पृष्ठभूमि सिग्नल के खाते में घटाना: स्पेक्ट्रा विश्लेषण> फ़ाइल> ओपन ।
    2. एक रिक्त फाइल और एक स्पेक्ट्रा फ़ाइल खोले जाने के बाद दृश्य 2 के तहत दृश्य 2 को खींचें (स्क्रीन के बाईं ओर)।
    3. पीआर पर क्लिक करेंOcessing> घटाव> ठीक है या विनिमय डेटा> ठीक है
    4. एएससीआईआई फ़ाइल के रूप में डेटा निकालें: फ़ाइल> निर्यात करें और एएससीआईआई चुनें
    5. संबंधित स्पेक्ट्रम को साजिश करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ऐसे मामलों में डेटा का सुचारू रूप से वैकल्पिक है जहां संकेत-से-शोर अनुपात अपेक्षा से कम है। इस परिवर्तन को स्मूथिंग डेटा विकल्प लागू करने से लागू किया जा सकता है।
  5. थर्मल विकृतीकरण संक्रमण के लिए डेटा कार्य अप।
    1. एक ASCII फ़ाइल के रूप में JASCO फ़ाइल से डेटा निकालें।
    2. तापमान के एक समारोह के रूप में अण्डाकार अंक का प्लॉट करें आम तौर पर, तरंग दैर्ध्य की जांच के आधार पर डेटा को सुचारण करना आवश्यक होता है। कुछ उदाहरणों में, 210 एनएम पर तरंगदैर्ध्य के इस्तेमाल के लिए भूखंडों के बीच बड़े भिन्नरूपों का उपयोग किया गया था, जिनकी आवश्यकता होती है चिकनाई। हालांकि, नमूना और सांद्रता के आधार पर, कच्चे डेटा का उपयोग करके कई गणना किए गए थे।
    3. थर्मल डेन की गणना करने के लिएअस्थिरता संक्रमण (टी एम ) मान, वक्र के पहले व्युत्पन्न प्राप्त करें। मैक्सिमा या मिनमा इस पैरामीटर का संकेत थे। जैसा कि पिछले चरण में था, कुछ मामलों में सबसे सटीक मान प्राप्त करने के लिए डेटा की सफाई करना आवश्यक था।
      नोट: प्रयोगों को आमतौर पर तीनों में किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माप के लिए इसी औसत और मानक विचलन में परिणाम मिला है।

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Representative Results

सी 2'- ओ -रिप्लेसमेंट में आरएएनए डोडेकैमर्स के संश्लेषण में शून्य, एक या दो 2-थिफ़ेफेनिलमिथिल संशोधनों को शामिल किया गया है, इसके संबंधित शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के साथ। इसके अलावा, सीडी के माध्यम से किए गए संरचनात्मक विश्लेषण का विस्तृत विवरण शामिल है।

आरएनए (एक पूरक अनुक्रम के साथ एक किनारा सहित) की चार किस्में ठोस चरण संश्लेषण के माध्यम से प्राप्त की गई थी, जो प्रत्येक ओलिगोनक्लियोटाइड के 300-700 एनएमएल के बीच शुद्धिकरण उपज मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रत्येक नमूने के ~ 150 pmol desalting और फिर MALDI-TOF विश्लेषण ( चित्रा 5 ) के लिए एक थाली पर जमा द्वारा किया गया था। प्रत्येक समाधान के पराबैंगनी फोटोमेट्रिक विश्लेषण के माध्यम से मात्राकरण किया जाता था, जबकि सीडी को द्वैध संरचनाओं के गठन की पहचान करने और उनके संबंधित टी एम रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से, विहित और संशोधित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं देखा गया है, चाहे एकल-फंसे नमूनों या द्वैध संरचनाओं की तुलना करना। हालांकि, उनके सीडी स्पेक्ट्रा ( चित्रा 6 ) के माप पर मामूली बदलाव देखे गए हैं। इसके अलावा, तीन द्वैध संरचनाओं के टी मीटर माप में एक अलग मूल्य प्रदर्शित किया गया जो कि किस्में में से किसी एक पर 2'-ओ-थिफ़ेनेलेमिथिल संशोधन के शामिल होने से प्रेरित अस्थिरता का संकेत था।

आकृति 1
चित्रा 1 : आरएनए सड़कों को प्राप्त करने की प्रक्रिया ठोस चरण के रूप में सीपीजी का उपयोग करके ठोस चरण चक्र और उत्प्रेरक के रूप में 5-एथिथिएथोट्राज़ोल: ( i ) डिट्रिसेलेशन; ( Ii ) युग्मन; ( Iii ) ऑक्सीकरण; ( Iv ) कैपिंग और नए चक्र पर; भ्रष्ट करने के लिएडिंग ऑलिगोनक्लियोटाइड ( v ) सीपीजी राल पर समर्थित है और सभी संरक्षित समूहों को युक्त है; और इसके बाद के विस्थापन को आधार और फ्लोराइड ( vi ) की उपस्थिति में आगे के विश्लेषण के लिए अंतिम आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राप्त करने के लिए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : फास्फोरियमिड्स और संरक्षित समूह के ढांचे। इस अध्ययन में एस, जी और सी। के ओ- टीबीडीएमएस समूह के एक्सोक्लेक्लिक एमाइंस पर सिएलएल आधारित सी 2 ' ओ- ग्रुप और बेस लैबिल समूह वाले फास्फोरामिडाइट की रासायनिक संरचना का उपयोग किया गया था। कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा versio देखने के लिएइस आंकड़े के n

चित्र तीन
चित्रा 3 : अनुरूप ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के चरणबद्ध संश्लेषण चक्र को दिखाया गया था और प्रयुक्त कोड के लिए एक कुंजी और प्रवाह दर सही पर दिखायी गई है। चरणबद्ध संश्लेषण प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर से चिपकाया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : व्यक्तिगत कूपलिंग की प्राप्त हुई यील्ड और ट्रैकिंग का प्रतिनिधित्व दिखाए गए उदाहरण को ठेठ ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण प्रदर्शित करने के लिए पूरक के संश्लेषण से अनुकूलित किया गया हैहै। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5 : ऑलिगोन्यूक्लिओटाइड्स (ओएनएस) 1-3 की एमएस पर 1 की MALDI-TOF - 3 (ऊपर से नीचे)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
6 चित्रा : सिंगल और डबल फंसे हुए आरएनए, कैननियम और संशोधित की सीडी स्पेक्ट्रा। शून्य ( 1 , ए), एक ( 2 , बी) या दो वाले नमूने के सीडी स्पेक्ट्रा ( इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

तालिका एक
तालिका 1: फॉस्फोरैमिडीइट समाधान गणना

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Discussion

इस पांडुलिपि का इरादा डीएनए या आरएनए के oligonucleotides के संश्लेषण को सफलतापूर्वक प्राप्त करने या बढ़ाने के लिए क्षेत्र, शुरुआत या विशेषज्ञ में शोधकर्ताओं के लिए एक मार्गदर्शक के रूप में सेवा करना है। वर्णित पद्धति मानक फॉस्फोरामिडाइट रसायन के माध्यम से स्वचालित डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र का उपयोग करके ठोस चरण संश्लेषण के उपयोग पर केंद्रित है। रिपोर्ट में आरएनए डोडेकैमर्स के संश्लेषण, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के चरण-दर-चरण चित्रण का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, सीडी का उपयोग माध्यमिक संरचनात्मक रूपांकनों और थर्मल विकृत रूपांतरों की पहचान करने के लिए किया जाता है।

यह ध्यान रखना जरूरी है कि यह काम अन्य परिस्थितियों में अनुकूलनीय हो सकता है, अर्थात् , ठोस-चरण संश्लेषण में विभिन्न ब्रांड उपकरण, संशोधनों, रक्षा समूहों और / या अभिकर्मकों। इसलिए, इस प्रक्रिया में शामिल कई या एक से अधिक पैरामीटर को बदलने या प्रतिक्रिया की स्थिति में समायोजन के माध्यम से सुधार प्राप्त किया जा सकता है। मैंएन अतिरिक्त, यहां उपलब्ध कराए गए विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण (सीडी के माध्यम से) इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करने की उम्मीद है, जो आम तौर पर यूवी-विज़ के माध्यम से समरूप विश्लेषण करता है।

ठोस चरण संश्लेषण के लिए फॉस्फोरामिडीइट्स के लोगों को निर्धारित करने के लिए गणना नीचे दिखाए गए अनुक्रमों पर आधारित थी, और चार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स तैयार किए गए थे और उसी रन पर शुद्ध किए गए थे (रेखांकित पदों में 2'- O- thiophenylmethyl संशोधन की उपस्थिति का संकेत मिलता है) । सभी गणना और मूल्य तालिका 1 में शामिल हैं
1 5 '- [सीयूए सीजीजी एएयू सीएयू] -3'
2 5 '- [सीयूए सीजीजी ए एयूयूसीयू] -3'
3 से 5 '- [CUA तटरक्षक जी एक ए.यू. CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'

शायद आरएनए को संभालने का सबसे महत्वपूर्ण पहलू रिबोन्यूक्लिज द्वारा गिरावट की ओर इसकी संवेदनशीलता से संबंधित है, और इसकी ईएसी को जलीय समाधानों में हाइड्रोलिसिस से गुजरना और धातु आयनों 24 की उपस्थिति में। इस प्रकार, RNase- मुक्त परिस्थितियों को सभी समय 25 पर लागू किया जाना चाहिए, जैसा कि यहां बताया गया है: 1) डायथाइल पाइरोकार्बोनेट (0.1% वाय / वी, डीईपीसी) की उपस्थिति में सभी पानी को आटोक्लेव किया गया था; 2) सभी कांच के बने पदार्थ को एक ओवन (150 डिग्री सेल्सियस, रातोंरात) में पकाया गया था, और डीईपीसी के इलाज के पानी के साथ धोया गया; 3) सभी ट्यूब और पिपेट टिप्स निर्माताओं से उनके आरएनज मुक्त रूप में खरीदे गए थे; 4) हर समय दस्ताने का इस्तेमाल किया गया था और काम को एक नामित हुड में किया गया था; और 5) आरएनएस परिशोधन समाधान के साथ सभी सतहों और उपकरणों को लगातार नष्ट कर दिया गया है जो विभिन्न निर्माताओं से खरीद के लिए उपलब्ध हैं। सभी शुद्ध आरएनए को छोटे भागों में विभाजित किया गया था और उपयोग की आवृत्ति के आधार पर -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, जबकि चावल या अनपुरीकृत रेजिन 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। जैसा कि हमने पहले 16 , ओलिगोन्यूएलओआई को इंगित किया हैडेस यहाँ वर्णित तरीके से प्राप्त किया गया है और 10-34 न्यूक्लियोटाइड्स के बीच के आकार में अन्य रिपोर्टों की तुलना में उच्च स्थिरता प्रदर्शित करते हैं 26 इसलिए, लंबे समय तक आरएनए को संभालने के दौरान पाठक को अन्य भंडारण प्रक्रियाओं में संदर्भित किया जाता है 27 ।

स्वचालित रूप से संश्लेषण में चरणबद्ध उपज (विकिरण कदम के द्वारा गणना की गई) 97 से 100% के बीच थी और यह विशेष रूप से उन संशोधनों की विशेष रूप से, जो विशेष रूप से संशोधित की गई हैं। राल, अपस्तिष्क, और शुद्धिकरण (जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से ) से दरार के बाद 30 से 75% की कुल पैदावार प्राप्त हुई थी, जो पृथक ओलिगोनक्लियोटाइड के ~ 300-750 एनएमएल के अनुरूप थी। आक्रामक रूप से, संशोधनों का समावेश आरएनए किस्में की समग्र उपज को प्रभावित नहीं करता है। हालांकि, इन श्रेणियों को स्वीकार्य मात्रा के रूप में माना जा सकता है, जबकि ~ 50 न्यूक्लियोटाइड से अधिक oligonucleotides के संश्लेषण (हमारी प्रयोगशाला में पिछले, अप्रकाशित डेटा) 98% के नीचे चरण-योग्य उपज से काफी प्रभावित हो सकता है इस प्रकार, 50 न्यूक्लियोटाइड्स से अधिक की अपेक्षा की जाती है, उदाहरण के लिए , उच्च गुणवत्ता के लिए एसिटोनिट्रिअल के स्रोत को बदलने के लिए, फॉस्फोरियमिड्स के वातावरण के वातावरण को कम करने के समय में कम से कम सावधानी बरती जानी चाहिए, फॉस्फोरियमिड्स को एक सेट में पतला करने के लिए उपकरण का कार्यक्रम मूल्य हर बार विहित phosphoramidites की नई बोतलों का उपयोग करते समय, एचपीएलसी शुद्धिकरण इलेक्ट्रोफोरेक्टिक विश्लेषण के स्थान पर, और / या हल्के deprotection शर्तों का उपयोग करें।

सभी oligonucleotides के लिए जन स्पेक्ट्रा (MALDI-TOF एमएस) सकारात्मक मोड में ABI 4800 प्लस MALDI-TOF / TOF द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर किया गया था। 3 चित्रा 5 में दिखाया जाता है - सभी नमूनों प्रक्रिया के साथ साथ और पर 1 के लिए स्पेक्ट्रा के उदाहरण में वर्णित का उपयोग कर तैयार थे।

सभी प्रयोग आम तौर पर त्रिपली में किए जाते हैंcate। सभी स्पेक्ट्रा और प्रायोगिक सेटअप को एक आयताकार 6-सेल धारक से लैस स्पेक्ट्रोपरिमरमीटर पर किया गया था। सभी कांच के बने पदार्थ एक आरएनज हटाने के समाधान से धोया गया था और आरएनसी मुक्त पानी के साथ अच्छी तरह से धोया गया था। प्रत्येक नमूने के बाद सभी नमूने खारिज किए गए थे। यह कहना महत्वपूर्ण है कि उच्च तनाव वोल्टेज (एचटी एक उपकरण है जिसे उपकरण द्वारा मापा जाता है) पर निकट ध्यान रखा जाना चाहिए। यह संकेत में संतृप्ति का संकेत हो सकता है और इस प्रकार डेटा की सटीकता और वैधता के लिए एक खतरा बन सकता है। यह पैरामीटर नमूना निर्भर है और इस तरह रखा जाना चाहिए कि संकेत किसी भी समय 500 एमवी से ऊपर नहीं जाता है। सीडी स्पेक्ट्रा के लिए उदाहरण से पहले और 1 के संकरण के बाद प्राप्त - 3 चित्रा 6 पर दिखाए जाते हैं।

इसके अलावा, सोडियम लवण (और अन्य बफर सिस्टम) में एकाग्रता बढ़ाना, या अन्य बफर सिस्टम का उपयोग करना, उदाहरण के लिए , एचईपीईएस या एमओपीएस, परिणाम 220 एनएम के नीचे बढ़ते शोर में है। इसलिए, चूंकि 210 एनएम का बैंड ए-फॉर्म डुप्लेक्स के गठन का अनुसरण करने के लिए विशेष महत्व है, इसलिए सोडियम आयनों में अधिकतम एकाग्रता ~ 10 एमएम रखा गया था।

हम यह भी दिखाते हैं कि सीडी का प्रयोग पराबैंगनी स्पेक्ट्रोस्कोपी से प्राप्त पैरामीटर प्रदान करता है। अंत में, हम संशोधित और अनसुधारित आरएनए ऑलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को संश्लेषित, शुद्ध और गुणित करने की प्रक्रिया का वर्णन और वर्णन करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि की तैयारी कोलोराडो डेन्वेर विश्वविद्यालय (जेएमआरई) से शुरूआती निधि के माध्यम से समर्थित किया गया था। एएफ रिसर्च एंड क्रिएटिव एक्टिविटी पुरस्कार (आरईसीएएस, सीयू डेनवर) से समर्थन स्वीकार करना चाहेंगे। प्रकाशन शुल्क को कवर करने के लिए रिसर्च सर्विसेज, कोलोराडो डेन्वर विश्वविद्यालय के कार्यालय से फंडिंग स्वीकार है। हम वीडियो भाग में उनके योगदान के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों सुश्री कैसंद्रा हर्बर्ट और श्री यानीक के। डज़ोओ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AbsolveTM PerkinElmer 6NE9711
Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade Fisher Scientific 75-05-8
Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing Fisher BioReagents 75-05-8
Acrylamide, 99+% ACROS Organics 164850025
Ammonium chloride 98+% Alfa Aesar 12125-02-9
Ammonium citrate, dibasic 98% Sigma Aldrich 3012-65-5
Ammonium Fluoride  98.0%, ACS grade Alfa Aesar 12125-01-8
Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus Fisher Chemical 1336-21-6
Ammonium persulfate ACROS Organics 1444
Argon-ultra high purity  Airgas 7440-37-1
Bis-acrylamide Ultra pure VWR-Amresco 172
Boric Acid Fisher Scientific A73-1
Diethyl pyrocarbonate, 97% ACROS Organics A0368487
Ethanol, anhydrous, histological grade Fisher Chemical 64-17-5
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% Fisher Chemical 6381-92-6
Formamide  Thermo Scientific 75-12-7
Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus Fisher Chemical 7647-01-0
Magnesium chloride hexahydrate, 99% Fisher Scientific 7786-30-3
Methanol, 99.9%,  HPLC Grade Fisher Chemical 67-56-1
Methylamine 40% in water Sigma Aldrich 74-89-5
1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% Aldrich 872-50-4
Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)  MDS SCIEX 1020157
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11
Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS Fisher Chemical 127-09-3
Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS Fisher Chemical 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% Sigma 13472-35-0
2’,4’ Triethylamine, 99+% Alfa Aesar 121-44-8
TEMED Amresco 761
Triethylamine trihydrofluoride, 98% Aldrich 73602-61-6
Trifluoroacetic acid, 99% Alfa Aesar 76-05-1
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% Sigma Aldrich 480-66-0
Tris Base Fisher Scientific BP154-3
Urea Fisher Scientific U15-3
Reagents for the RNA synthesis:
Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane Glen Research  40-4140-57
Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride Glen Research 40-4110-52
Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF Glen Research 40-4120-52
Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile Glen Research  30-3140-52
Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water Glen Research 40-4330-52
U-RNA-CPG Glen Research 20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG  Glen Research 20-3324-xx
Ac-G-CE Phosphoramidite  Glen Research 10-3025-xx
U-CE Phosphoramidite Glen Research 10-3030-xx
Ac-C-CE Phosphoramidite Glen Research 10-3015-xx
Bz-A-CE Phosphoramidite  Glen Research 10-3003-xx

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References

  1. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
  2. Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
  3. Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
  4. Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
  5. El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
  6. Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
  7. Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
  8. Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
  9. Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
  10. Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
  11. Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
  12. Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
  13. Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
  14. Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
  15. Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
  16. Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
  17. Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
  18. Mergny, J. -L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  19. Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
  20. Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
  21. Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
  22. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
  23. Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
  24. Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
  25. Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
  26. AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
  27. Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).

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आरएनए के ओलिगोमर्स के ठोस चरण संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल जिसमें 2&#39;-<em&gt; हे</em&gt; - थिफ़ेनिलमिथिल संशोधन और परिपत्र के माध्यम से परिपत्र दिब्रूवाद
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Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism. J. Vis. Exp. (125), e56189, doi:10.3791/56189 (2017).

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