Summary
Denna artikel tillhandahåller ett detaljerat förfarande på syntesen i fast fas, rening och karakterisering av dodekamerer av RNA modifierad vid C2'- O- positionen. UV-vis och cirkulär dikroismfotometriska analyser används för att kvantifiera och karaktärisera strukturella aspekter, dvs singelsträngar eller dubbelsträngar.
Abstract
Fastfassyntes har använts för att erhålla kanoniska och modifierade polymerer av nukleinsyror, specifikt av DNA eller RNA, vilket har gjort det till en populär metod för tillämpningar inom olika områden och för olika forskningsändamål. Förfarandet som beskrivs häri fokuserar på syntes, rening och karakterisering av dodekameror av RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' innehållande noll, en eller två modifieringar placerade vid C2'- O- positionen. Proberna är baserade på 2-tiofenylmetylgrupper, inkorporerade i RNA-nukleotider via standard organisk syntes och införda i motsvarande oligonukleotider via deras respektive fosforamiditer. Denna rapport använder fosforamiditkemi via de fyra kanoniska nukleobaserna (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)), såväl som 2-tiofenylmetylfunktionaliserade nukleotider modifierade vid 2'- O- placera; Metoden är dock möjlig för en stor varTjugo modifieringar som har utvecklats under åren. Oligonukleotiderna syntetiserades på ett stöd med kontrollerad pore glas (CPG) följt av klyvning från hartset och avskyddning under standardbetingelser, dvs en blandning av ammoniak och metylamin (AMA) följt av vätefluorid / trietylamin / N-metylpyrrolidinon. De motsvarande oligonukleotiderna renades via polyakrylamidelektrofores (20% denaturerande) följt av eluering, avsaltning, och isolering via omvänd fas-kromatografi (Sep-pak, C 18-kolonn). Kvantifiering och strukturella parametrar utvärderades via ultraviolett synlig (UV-vis) respektive cirkulär dikroism (CD) fotometrisk analys. Denna rapport syftar till att fungera som en resurs och guide för nybörjare och experter som är intresserade av att gå in på detta område. Det förväntas fungera som ett pågående arbete som ny teknik och metodik utvecklas. Beskrivningen av metoder och tekniker inom dessaS dokument motsvarar en DNA / RNA synthesizer (renoverad och köpt år 2013) som använder fosforamiditkemi.
Introduction
Solidfassyntes för att erhålla oligonukleotider av DNA / RNA är ett kraftfullt verktyg som har fungerat flera applikationer på olika områden sedan 1970-talet 1 , 2 , 3 med användning av fosforamiditbyggnadsblock 4 . Exempel på dess breda inflytande är: dess inverkan på märkning ( via klickkemiska reaktioner) 5 , strukturundersökning 6 och antisensteknik 7 samt dess belysning av biologiska mekanismer 8 , 9 , källa som genetiskt material 10 och studien av Olika naturliga och / eller kemiska modifieringar 11 , 12 bland många andra. Modifieringen som vi använder här representerar det första steget i våra ansträngningar för att erhålla RNA-oligonukleotider som innehållerFotoaktiva sonder för att möjliggöra temporär kontroll av strukturen och funktionen hos denna viktiga biopolymer.
Syntesen av RNA-dodecamers med sekvenser: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [augusti AUU CCG UAG] -3' (understrukna positionerna representerar införlivandet av en C2'- O -thiophenylmethyl modifiering ) Utgör fokus för denna studie. Sekvenserna valdes för att möjliggöra kvantifiering och mätning av RNA-strängar som enskilda strängar eller som deras motsvarande duplexstrukturer (inga andra sekundära strukturer förutspåddes som termodynamiskt stabila). CD användes för att fastställa strukturella parametrar, dvs duplexbildning och termiska denatureringsövergångar.
Syntes
Det övergripande förfarandet för att erhålla dessa oligonukleotider illustreras i figur 1 och följer stegvis process: automatiserad fastfassyntese → DeprOtektion → Rening → Kvantificering → Karakterisering. Figur 2 visar de monomerenheter som är nödvändiga vid denna procedur. Fastfassyntesen av RNA liknar den hos DNA genom att den är baserad på fosforamiditkemi ( Figur 2 , vänster) och användningen av baslabila skyddsgrupper för de nukleofila exocykliska aminerna på G, A och C, t.ex. Acetyl, bensoyl, fenoxiacetyl, t- butyl eller N , N- dimetylformamid ( Figur 2 , höger). En ytterligare aspekt att överväga i RNA, på grund av närvaron av C2'-OH-gruppen (saknar deoxyoligonukleotidbiopolymererna) är det ytterligare steget som måste införlivas för skyddet och efterföljande avskyddning av denna nukleofila position. I detta avseende har kiselbaserade skyddsgrupper blivit en attraktiv strategi på grund av deras potential som biortogonala delar (specificallY avskyddad i närvaro av fluorid), med tert- butyldimetylsilyl (TBDMS) och triisopropylsilyloximetyl (TOM) grupper som populära val ( Figur 2 , nedre vänster).
I detta arbete utfördes den automatiserade syntesen på en DNA / RNA-syntetiserare som använder standard fosforamiditkemi. Tillverkarens inställningar på instrumentet inkluderar ett automatiserat utspädningssteg när de kommersiella versionerna av fosforamiditerna används för DNA, eller alternativet att späda ut i volymer som användaren ställt. Men vi bestämde oss för att väga RNA fosforamiditen och späda ut manuellt med tanke på att 1) priset på kanoniska fosforamiditer av RNA är högre (upp till 50 gånger dyrare i vissa fall); 2) de modifierade fosforamiditerna erhålls ofta i små mängder; Och 3) mängden bortkastat material vid användning av ett automatiserat utspädningssteg (fastställd av tillverkaren) är stor. Dessutom använde vi: 1) kommersiellt tillgängliga fasta bärare( T.ex. CPG) innehållande ett skyddat nukleobas för att fungera som 3'-änden; Och 2) kommersiella fosforamiditer (kanoniska nukleobaser) skyddade med en TBDMS-grupp vid C2'- O- positionen. Den detaljerade listan över syntesstegen ges i figur 3 och tabell 1 tillsammans med ytterligare beskrivning och kommentarer för steg som justerades för RNA-syntesen. Vidare illustrerar figur 4 de stegvisa utbytena som observeras för varje steg efter att ha valt "Trityl Monitor" -alternativet, vilket kvantifierar trityl-kationen frigjord från varje detrityleringstrinn.
Det är värt att notera att den begränsande faktorn vanligtvis uppnådde, enligt vår erfarenhet, fosforamiditen innehållande den önskade modifieringen. Det vill säga utvecklingen av en syntetisk metod som möjliggör införlivande av modifieringar på utvalda platser. I denna rapport fokuserar vi påInkorporering av en modifierad nukleotid för vilken vi har etablerat motsvarande syntesmetod, C2'- O- tiiofenylmetylgruppen. Denna grupp är liten i storlek och påverkar inte fastfassyntesen på något sätt. Eftersom införlivandet av denna grupp i oligonukleotider av RNA har rapporterats, tillsammans med strukturella och termodynamiska parametrar 4 , kommer inga aspekter av den organiska syntesen som leder till de modifierade fosforamiditerna att beskrivas häri.
Deprotektion, rening och karaktärisering
Avlägsnandet av de exocykliska aminerna och ß-cyanoetylgrupperna sker i samma steg som klyvningen från CPG-hartset. Vi tillämpade de allmänt använda betingelserna för uppvärmning av det erhållna hartset i närvaro av en vattenhaltig lösning av AMA följt av klyvning av C2'- O- silylgrupperna i närvaro av fluoridjoner och därefter rening via gelelektrofores. Medan dessa har blivit standardbetingelser i många fall, modifikationer som är labila för basiska betingelser eller fluoridjoner kan kräva mildare betingelser 13, 14, t ex metanol / kaliumkarbonat (MeOH / K 2 CO 3), eller butylamin. Sålunda är en annan uppsättning skyddande grupper på motsvarande fosforamiditer nödvändig. Vidare valde vi elektrofores som det föredragna alternativet att rena de skyddade oligomererna med tanke på vår tidigare erfarenhet av denna metod och avsaknaden av annan instrumentering. HPLC kan emellertid alternativt användas som en effektiv metod 15 . Karakterisering av de renade oligonukleotiderna utfördes via masspektrometri, matrixassisterad laser desorption / joniseringstid för flygning (MALDI-TOF), med användning av en rapporterad procedur av vår grupp 16 .
Strukturell karaktärisering och därmed Malstabilitet hos de erhållna duplexema utfördes via CD. Specifikt använder vi CD för att bestämma termiska denatureringsövergångarna av modifierade och omodifierade oligonukleotider av RNA genom att följa minskningen i ellipticiteten hos bandet vid ca. 270 nm, samt försvinnandet av bandet (med negativ ellipticitet) med en λ max vid 210 nm. En spektrajämförelse före och efter hybridisering tillhandahålls för att illustrera deras skillnader och tillhandahålla validering av den använda metoden. Användningen av CD är allmänt accepterad vid bestämning av strukturella motiv i nukleinsyror och aminosyror 17 och kan därför användas som ett verktyg för att bestämma olika strukturella och termodynamiska parametrar 18 ; Det finns emellertid inte många exempel där tekniken används för att bedöma termiska denatureringsövergångar. Vissa fall innefattar bestämning av termiska stabiliteter på DNA innehållande G-quadruplexerAss = "xref"> 19 , 20 eller i duplex och hårnålar av RNA 21 .
Denna rapport avser att ge icke-expertläsaren eller tittaren en uppsättning verktyg som möjliggör en smidig start på denna typ av forskning. Det kommer att tjäna för att förbättra och jämföra med metoder och tekniker vid andra forskningslaboratorier som är inblandade i denna spännande forskningsgren. Innehållet i denna rapport lägger till de befintliga protokollen från denna teknik från olika källor och berikar och underlättar upplevelsen med visuellt hjälpmedel för varje steg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fastfassyntes av RNA-oligonukleotider
- Framställning av lösningar innehållande varje fosforamidit (Tabell 1).
- Räkna antalet nukleotider och passa in i n + 1 ekvationen (där n = antal nukleotider) som motsvarar varje bas och fyll i tabellen med de saknade värdena. Volym = 0,15 ml per nukleotid vid en koncentration av 0,1 M, upplöst i vattenfri acetonitril.
- Väg varje fosforamidit i ugnstorkade 10 ml amberflaskor (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) och placera omedelbart under vakuum med hjälp av en torkmedel innehållande ett torkmedel.
- Fyll torkmedlet med torr argon, ta av flaskan och späd det omedelbart med motsvarande mängd acetonitril (vattenfri) innan du sätter fast på instrumentet.
OBS! Se till att du använder gasstega sprutor och håll alltid vattenfri atmosfär. - Ta bort septa från flaskan och placera den på mAchine, via en flaskbytesfunktion.
OBS: Denna process kräver ytterligare 0,15 ml (följaktligen överskottsvolymen i n + 1 ekvationen ovan) av varje lösning för att primära linjen före syntes.
- Uppställning av sekvens och fastfassyntes med användning av programvaran ( Figur 3 ).
- Klicka på programvaruikonen ( t.ex. OligoNet 1.0.1) och välj Instrumentnamn> OK . Skapa en ny syntes genom File> New Synthesis> Order .
- Fyll i: Datum; RunID; Välj instrument; Sekvensnamn; Sekvens (5'-till-3'-änden). Under | cykel, tilldela den tidigare skapade metoden ( Figur 3 ). Välj slutförfarandet, ( lämnar oligonukleotid bunden till CPG-hartset)> manuell.
- Välj DMT Off> (TCA-behandling i sista steget för att erhålla en 5'-OH-grupp vid slutet av syntesen) ; Spara fil> Spara somOch ge ett namn på experimentet.
- Skicka filen för att börja syntes Order> Skicka order till synthesizer och välj kolumn 1-4 . Öppna synthesizerfönstret och välj trityl monitor | välj funktion | trity> övervaka varje steg .
- Upprepa stegen efter behov, beroende på antalet oligonukleotider som ska syntetiseras samtidigt (observera att alla beställningar måste ha samma metod, dvs samma kopplingstider och händelseförlopp).
- Börja syntesen Synthesizer> Förbered dig för att börja . Placera kolumnerna med önskad 3'-ände på de positioner som anges på instrumentet. På instrumentet klicka på Start> Nej (för ABI-förberedelse).
- När syntesen är färdig, ta av kolonnen från instrumentet och placera i en rundkolv följt av torkning under reducerat tryck i ca 0,5 h.
OBS! Det rekommenderas att kontrollera att en djup orange färg observeras i randOm kopplingar (steg 1.2.4 - 1.2.7) för att undvika potentiella fel från trityl monitor-funktionen.
- Deprotektion och rening av RNA-oligonukleotider.
- Öppna kolonnen genom att vrida den svarta kåpan och överföra allt (eller hälften, beroende på behoven eller syftet) av det vita hartset i ett 1,6 ml centrifugrör. Tillsätt 0,5 ml av en metylamin (40% i vatten) / ammoniak (40% i vatten) vid 1: 1.
- Säkra centrifugröret med parafilm och värm till 60 ° C i 1,5 h med hjälp av ett värmeblock.
OBS! Ett tungt föremål kan placeras ovanpå röret för att säkerställa att ammoniakkoncentrationen förblir konstant inuti reaktionsröret. - Avlägsnas från värmeblocket och sakta svalna till rumstemperatur. Centrifugera provet snabbare för att snurra ner innehållet och överför supernatanten till ett nytt centrifugrör.
- Frysta provet med nedsänkta rör i flytande kväve (eller torris / etanolbad) och koncentrera till torrhet under spinnIngas i en centrifug under reducerat tryck.
- Re-suspendera fasta substanser i 0,4 ml av en lösning av trietylamin / N-metylpyrrolidinon / trietylamin-trihydrofluorid (2: 2: 3). Värm till 60 ° C i 1,5 h följt av långsam kylning till rumstemperatur.
- Tillsätt 0,04 ml av en NaOAc-lösning (3M, pH 5,5 - justerad med HCl) följt av försiktig blandning med en pipettspets. Tillsätt etanol (1 ml) och kyla till ca. -70 ° C (torris / etanolbad) under 15 min.
- Centrifugera vid 15 000 rpm och 4 ° C i 10 min. Använd en pipett för att extrahera alikvoten och torka den resulterande pelleten under reducerat tryck.
- Re-suspendera den erhållna fasta substansen i laddningsbuffert (0,2 ml, 90% aq. Formamid, 1 mM EDTA) och blanda tills blandningen är homogen.
- Belasta suspensionen på en tidigare framställd polyakrylamidgel (20% denaturering, brunnens mått: 30 cm x 1 mm) 22 .
- Applicera en ström genom gelén tills bromfenolblåmarkören ligger mellan 1 / 2-2 / 3Ner gelén (gelmått: ~ 21,5 cm x 30 cm).
- Ta bort gelén från stativet och överför gelinnehållet från glaset till plastfolie (täckt på båda sidor) och placera över en tunnskiktskromatografi (TLC) platta täckt med kiseldioxid (innehållande fluorescerande färg vid 254 nm) för att visualisera banden Med en UV-lampa (A max = 254 nm).
- Använd en markör för att avgränsa positionen där övre bandet ligger och skär det med ett nytt rakblad. Placera gel som innehåller RNA (utan plastfolie) i ett 50 ml koniskt rör och krossa till små bitar med en glasstång.
- Suspendera gelresterna i en NaCl-aq. Lösning (2 mM och 1 mM EDTA) och skaka suspensionen vid 37 ° C under 12 timmar. Centrifugera det koniska röret i 10 minuter.
- Avsalt genom att använda en omvänd fas C18 patron.
- Förbered patronen med en 10 ml spruta genom att tvätta med:
Acetonitril (10 ml)
H 2 O (två gånger, 10 ml)
5 mM NH4 Cl aq. Lösning (3 ml)
Lösning innehållande RNA, var försiktig med att inte hälla någon av gelresterna. - Tvätta med H2O (tre gånger, 10 ml).
- Elute från kolonnen med en 60% aq. Metanollösning (3 ml)
- Förbered patronen med en 10 ml spruta genom att tvätta med:
- Koncentreras under reducerat tryck och återupplöses i RNas-fritt vatten (0,3 ml)
- Förbered en utspädd lösning (10 μl) och sätt 1 μL på UV-visinstrumentet ( t.ex. Nanodrop) för att mäta UV-vis spektret (200-450 nm).
- Använd öl Lamberts lag för att bestämma koncentrationen av den erhållna lösningen:
Där A = erhållen absorbans; E = beräknad molär extinktionskoefficient C = koncentration och l = 0,1 för en banlängd på 1 mm. - Beräkna de molära extinktionskoefficienterna för oligonukleotiderna; Beräknas här med en on-line räknareSom använder DINAMelt-programvara (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
- Koncentrationsbestämning och karakterisering via MALDI-TOF.
- Ladda prov på en MALDI-platta med hjälp av en pipettspets laddad med en C18-spets för att avsaltas och placera varje oligonukleotid.
- Tvätta spetsen med 50% acetonitril (10 μL x 2). Ekvilibrera spetsen med 0,1% trifluorättiksyra (TFA, 10 | il x 2). Ladda tip med prov (vanligtvis 100-150 pmol).
- Tvätta spetsen med 0,1% TFA (10 μL x 2) och sedan med vatten (10 μL x 2).
- Lös provet i en lösning innehållande den önskade matrisen; Vi använde en lösning av: 10 | il 25 mM-2,4,6-trihydroxiacetofenonmonohydrat (THAP), 10 mM ammoniumcitrat och 300 mM ammoniumfluorid i 50% acetonitril.
- Spot direkt på MALDI-plattan genom att deponera 0,9 μL (följt av lufttorkning) och upprepa proceduren efter behov.
OBS: Alla spektra erhölls på reflektor-positivt sätt.
- Ladda prov på en MALDI-platta med hjälp av en pipettspets laddad med en C18-spets för att avsaltas och placera varje oligonukleotid.
2. RNA-strukturanalys via CD
- Framställning av lösningar för CD.
- Förbereda 0,25 ml innehållande det modifierade RNA [3 uM], NaCl [10 mM], natriumfosfatbuffert [10 mM, pH 7,2], och MgCl2 [5 mM]. Provet är redo för analys som det är, särskilt om det representerar en unimolekylär övergång.
- Om målet är att analysera duplexstrukturer eller bimolekylära övergångar, lägg till komplement (1 molär ekvivalent, om tillämpligt) vid den här tiden, eller fortsätt med steget nedan.
- Placera provet på ett värmeblock, förvärmt till 90 ° C och stäng av värmen för att styra långsam kylning till rumstemperatur (vanligtvis 2 - 4 h).
- Spectra förvärv
- Bered en blindlösning (NaCI 10 mM, natriumfosfat 10 mM pH 7,3, MgCl2 5 mM), överföring tBland annat mikrokvett (1 cm bana längd, 250 μL minsta volym) och placera i hållarens läge på provväxlaren inom instrumentet.
- Överför provet innehållande RNA till en annan mikrokuvett och placera i provväxlaren. Om man mäter en termisk denatureringsövergång, lägg försiktigt en oljebädd utan att störa vattenskiktet och säkra kuvettlocket med en bit Teflon-tejp.
- Öppna kvävebehållaren för att ge ett flöde som flyttar luftfläkten på instrumentet till ca. 40. Slå på kylaren.
- Slå på instrumentet och öppna programvarans Spectra Manager- ikon och öppna sedan förvärvsfönstret Spectra Measurement .
- Rengör instrumentet med kväve i 5 minuter före förvärv.
- Skaffa spektra med följande parametrar Mät> Parametrar och justera parametrarna enligt följande:
- Under Allmänt väljer du: Skanna 200-350 nm; Kanaler CD och HT: DataStigning vid 0,1 nm; Avsökningshastighet vid 100 nm / min; Bandbredd vid 1 nm; Antal ackumuleringar vid 5.
- Under cellenhet , välj 20 ° C. Under kontroll , välj Slutaren öppnas och stängs automatiskt. Under information , välj namn, koncentration, operatör.
- Under data , bläddra till önskad mapp. Klicka på OK .
- Skaffa spektrummåttet > Provmätning , identifiera positionerna för kyvetterna i provväxlaren 1-6 följaktligen, klicka på OK .
- Om man tar en termisk denatureringsövergång:
- Stäng Förvärvsprogramvara Fil> Avsluta och öppna ett nytt program Variabel temperaturmätning> Mätning> Parametrar .
- Applicera följande parametrar för att registrera en termisk övergång, som kan justeras enligt önskemål:
- Under Temperatur , välj starttemperatur: 4 ° C; Intervall: 0,2; taRget: 90 ° C; Gradient: 1 ° C / min; Vänta 0 s. Under Start / Slut väljer du Start villkor och slutförhållande som önskat.
- Under Allmänt väljer du 3 kanaler, CD / HT / Abs; Bandbredd: 1 nm; Våglängd: 270 nm (eller som önskat). Under Kontroll väljer du ingen. Under Information väljer du namn, koncentration, operatör.
- Under data , bläddra till önskad mapp. Klicka på OK .
- Kyl prov till 4 ° C och vänta 5 minuter vid denna temperatur innan du erhåller spektrummätning.
- Datautbildning för spektra.
- Använd funktionen på programvaran genom att subtrahera det tomma spektrumet från målförvärvet för att ta hänsyn till bakgrundssignaler som uppstår från buffertsystemet som används: Spectra Analysis> File> Open .
- När en blank fil och en spektrafil har öppnats drar du Visa 2 under Visa 1 (på vänster sida av skärmen).
- Klicka på PrOcessing> subtraktion> OK eller utbyte data> OK .
- Extrahera data som en ASCII-fil: Fil> Exportera och välj ASCII .
- Använd programvara för att plotta motsvarande spektrum. Utjämning av data är valfri i fall där signal-brusförhållandet är lägre än förväntat. Denna omvandling kan appliceras genom att använda mjukningsdataalternativet.
- Uppgiftsuppdatering för termiska denatureringsövergångar.
- Extrahera data från JASCO-filen som en ASCII-fil.
- Rita ellipticitetspunkterna som en funktion av temperaturen. Typiskt är utjämning av data nödvändig beroende på våglängden som undersöks. I vissa fall visade användningen av våglängden vid 210 nm större variationer mellan diagram som krävde mjukning. Beroende på provet och koncentrationerna utfördes emellertid ett antal beräkningar med hjälp av rådata.
- För att beräkna värmepannaaturation övergångar (T m) värdet, erhålla en första derivatan av kurvan. Maxima eller minima var en indikation på denna parameter. Som i föregående steg krävde vissa fall att dataen smidades för att få det mest exakta värdet.
OBS: Experiment utfördes typiskt i tre exemplar, vilket resulterade i motsvarande medelvärde och standardavvikelse för mätningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syntesen av RNA-dodekameror innehållande noll-, en- eller två-2-tiofenylmetylmodifieringar vid C2'- O- positionen beskrivs tillsammans med dess motsvarande rening och karakterisering. Vidare ingår en detaljerad beskrivning av den strukturella analysen som utfördes via CD.
De fyra strängarna av RNA (inkluderande en sträng med en komplementär sekvens) erhölls genom fastfassyntes, vilken följdes av ett reningsutbyte mellan 300-700 nmol av varje oligonukleotid. Masspektrometri utfördes genom avsaltning av ~ 150 pmol av varje prov och sedan avsättning på en platta för MALDI-TOF-analys ( Figur 5 ). Kvantifiering utfördes via ultraviolett Fotometrisk analys av varje lösning, medan CD användes för att identifiera bildningen av duplexstrukturer och registrera deras motsvarande Tm. Ingen klar skillnad observeras mellan kanoniska och modifierade oligonukleotider via UV-vågspektroskopi, vare sig man jämför enskildsträngade prover eller duplexstrukturer. Dock observeras mindre förändringar vid mätning av deras CD-spektra ( Figur 6 ). Dessutom visade Tm- mätningar av de tre duplexstrukturerna ett distinkt värde som var indicativt för destabiliseringen inducerad genom införlivandet av 2'-O-tiofenylmetylmodifieringen på en av strängarna.
Figur 1 : Förfarande för att erhålla RNA-strängar. Fastfascykel med användning av CPG som det fasta stödet och 5-etyltiotetrazol som aktivator: ( i ) detritylation; ( Ii ) koppling; ( Iii ) oxidation; Iv ) capping och på ny cykel; För att ge motsvarandeDing oligonukleotid ( v ) uppburen på CPG-hartset och innehållande alla skyddande grupper; Och dess efterföljande avskyddande i närvaro av bas och fluorid ( vi ) för att ge den slutliga RNA-oligonukleotiden för vidare analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Strukturer av fosforamiditer och skyddsgrupper. Den kemiska strukturen hos fosforamiditinnehållande silylbaserade C2'- O- grupper och baslabila grupper på exocykliska aminerna av A, G och C. O- TBDMS-gruppen användes i denna studie. Vänligen klicka här för att se ett större versioN av denna figur.
Figur 3 : Stegvis syntes av de korresponderande oligonukleotiderna. Cykeln redigerades som visas och en nyckel för de använda koderna och flödeshastigheterna visas till höger. Den stegvisa syntesen klistrades från mjukvaran som tillhandahålls. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Representation av erhållna avkastningar och spårning av enskilda kopplingar. Det visade exemplet har anpassats från syntesen av komplementet för att visa en typisk oligonukleotidsyntesär. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5 : MS av oligonukleotider (ON) 1-3. MALDI-TOF av ON 1 - 3 (topp till botten). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6 : CD-spektra av enkel- och dubbelsträngad RNA, kanonisk och modifierad. CD-spektra av prover innehållande noll ( 1 , A), en ( 2 , B) eller två (
Tabell 1: Beräkning av fosforamiditlösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med detta manuskript är att fungera som en guide till forskare inom fältet, nybörjare eller expert, för att framgångsrikt uppnå eller förbättra syntesen av oligonukleotider av DNA eller RNA. Den beskrivna metoden fokuserar på användningen av fastfassyntes med användning av en automatiserad DNA / RNA-syntetiserare via standard fosforamiditkemi. Rapporten beskriver en steg-för-steg-avbildning av syntesen, rening och karakterisering av RNA-dodekameror. Dessutom används användningen av CD för att identifiera sekundära strukturella motiv och termiska denatureringsövergångar.
Det är viktigt att notera att detta arbete kan anpassas till andra omständigheter, det vill säga olika märken av utrustning, modifieringar, skyddsgrupper och / eller reagens i fastfassyntesen. Därför kan förbättring uppnås vid ändring av en eller flera av de många parametrar som är involverade i denna process eller genom justeringar i reaktionsbetingelserna. jagVidare är den detaljerade strukturella analysen som tillhandahålls häri (via CD) förväntad att tillhandahålla ett alternativt tillvägagångssätt för forskare inom detta område, som typiskt utför analoga analyser via UV-vis.
Beräkningarna för att bestämma fosforamiditernas massor för fastfassyntesen baserades på sekvenserna som visas nedan och de fyra oligonukleotiderna framställdes och renades på samma gång (understrukna positioner indikerar förekomsten av en 2'- O- tiiofenylmetylmodifiering) . Alla beräkningar och värden ingår i tabell 1
1 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 '- [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'
Kanske är den viktigaste aspekten vid hantering av RNA hänförlig till dess mottaglighet mot nedbrytning av ribonukleaser, och dess eAse att genomgå hydrolys i vattenhaltiga lösningar och i närvaro av metalljoner 24 . Sålunda måste RNas-fria förhållanden genomföras hela tiden 25 som följd här: 1) allt vatten autoklaverades i närvaro av dietylpyrokarbonat (0,1% vikt / volym, DEPC); 2) Alla glasvaror autoklaverades, bakades i en ugn (150 ° C, över natten) och sköljdes med DEPC-behandlat vatten; 3) alla rör och pipettips köptes från tillverkare i sin RNase-fri form; 4) Handskar användes hela tiden och arbetet utfördes i en bestämd huva; Och 5) alla ytor och utrustning torkades ständigt med RNase dekontaminationslösningar som är tillgängliga för inköp från olika tillverkare. Alla renade RNA uppdelades i små portioner och lagrades vid -20 ° C eller -80 ° C, beroende på användningsfrekvensen, medan obrutna eller orenade hartser lagrades vid 20 ° C. Som vi har påpekat tidigare 16 , oligonukleotiDes erhållna på det sätt som beskrivs häri och i storlekar mellan 10-34 nukleotider långa visar en högre stabilitet än andra rapporter 26 . Därför hänvisas läsaren till andra lagringsprocedurer vid hantering av längre RNA 27 .
De stegvisa utbytena (beräknade genom detrityleringsteget) i den automatiserade syntesen var mellan 97-100% och är en indikation på bra kopplingseffektiviteter, särskilt de som har modifierats. Totala utbyten av 30-75% erhölls efter klyvning från hartset, avskyddning och rening ( via gelelektrofores), vilket motsvarar ~ 300-750 nmol isolerade oligonukleotider. Tillfredsställande påverkar införlivandet av modifieringarna inte det totala utbytet av RNA-strängarna. Medan dessa områden kan betraktas som acceptabla mängder, kan syntesen av oligonukleotider större än ~ 50 nukleotider (tidigare, opublicerade data i vårt laboratorium) Kan påverkas signifikant av stegvisa utbyten under 98%. Sålunda måste vissa försiktighetsåtgärder vidtas om strängar större än 50 nukleotider är önskade, t.ex. byta acetonitrilkällan till högre kvalitet, minimera tiden för exponering av fosforamiditerna i atmosfären, programmera instrumentet för att späda fosforamiditerna till en uppsättning Värde vid användning av nya flaskor av de kanoniska fosforamiditerna varje gång, använd HPLC-rening istället för elektroforetisk analys och / eller använd mildare avskyddningsbetingelser.
Masspektra (MALDI-TOF MS) för alla oligonukleotider utfördes på en ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF-masspektrometer i det positiva läget. Alla prover framställdes med användning av förfarandet beskrivet häri och exempel på spektra för ON 1 - 3 visas i figur 5.
Alla experiment utförs typiskt i triplikat. Alla spektra och experimentell inställning utfördes på en spektropolarimeter utrustad med en rektangulär 6-cellshållare. Alla glasvaror tvättades med en RNase-avlägsnande lösning och sköljdes noggrant med RNas-fritt vatten. Alla prover kasseras efter varje mätning. Det är viktigt att påpeka att högspänningsspänningen bör vara noggrann (HT är en parameter som mäts av instrumentet). Detta kan vara en indikation på mättnaden i signalen och utgör därmed ett hot mot dataens noggrannhet och giltighet. Denna parameter är provberoende och bör hållas så att signalen inte går över 500 mV vid någon given tidpunkt. Exempel för CD-spektra som erhållits före och efter hybridisering av ON 1 - 3 är visade på figur 6.
Dessutom ökar koncentrationen i natriumsalterna (och andra buffertsystem) eller med användning av andra buffertsystem, T.ex. HEPES, eller MOPS, resulterar i ökat brus under 220 nm. Eftersom bandet vid 210 nm är av särskild betydelse för att följa bildandet av en A-form duplex, behölls därför den maximala koncentrationen i natriumjoner till ~ 10 mM.
Vi visar också att användningen av CD ger samma parametrar som de som erhållits från ultraviolett spektroskopi. Sammanfattningsvis beskriver och illustrerar vi förfarandet för att syntetisera, rena och karakterisera modifierade och omodifierade RNA-oligonukleotider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Förberedelse av detta manuskript stöddes via startfonder från University of Colorado Denver (JMRE). AF skulle vilja erkänna stöd från en utmärkelse för forskning och kreativ verksamhet (RaCAS, CU Denver). Finansiering från Office of Research Services, University of Colorado Denver för att täcka publikationsavgifterna erkänns. Vi skulle vilja tacka labmedlemmarna Cassandra Herbert och Herr Yannick K. Dzowo för deras bidrag i videodelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T.
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -L., Lacroix, L.
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D.
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).
