Summary
El propósito de este protocolo es demostrar la colocación de un dispositivo constricting retrasada (un ameroid constrictor) alrededor de una arteria coronaria en un modelo porcino. Este dispositivo crea un área isquémico del corazón que es útil para el estudio de nuevas técnicas de imagen diagnósticas y nuevos métodos de tratamiento.
Abstract
Enfermedad cardiovascular sigue siendo la principal causa de mortalidad en los Estados Unidos. Hay numerosos enfoques para el tratamiento de estas enfermedades, pero sin importar el enfoque, un modelo en vivo es necesario para probar cada tratamiento. El cerdo es uno de los modelos animales grandes más usados para la enfermedad cardiovascular. Su corazón es muy similar en anatomía y función a la de un ser humano. La técnica de colocación del ameroid crea un área isquémico del corazón, que tiene muchas aplicaciones útiles en el estudio de infarto de miocardio. Este modelo se ha utilizado para la investigación quirúrgica, estudios farmacéuticos, técnicas de imagen y terapias celulares.
Hay varias maneras de inducir una zona isquémica en el corazón. Cada uno tiene sus ventajas y desventajas, pero la colocación de un constrictor ameroid sigue siendo la técnica más ampliamente utilizada. Las principales ventajas para usar el ameroid son su prevalencia en estudios existentes, su disponibilidad en varios tamaños para acomodar la anatomía y el tamaño del recipiente a ser limitado, la cirugía es un procedimiento relativamente simple y supervisión post-operatoria es mínima, puesto que no hay ningún dispositivo externo para mantener. Este documento proporciona una descripción detallada de la técnica adecuada para la colocación de la constrictor ameroid.
Introduction
Arteriopatía coronaria (CAD), que conduce a isquemia miocárdica, es la principal causa de incapacidad, muerte y los costos de salud en el mundo4 y atribuible para aproximadamente 1 de cada 3 muertes en los Estados Unidos1,2 , 3 , 4 , 5 , 6. aunque ha habido muchos avances en los tratamientos tanto percutáneos como quirúrgicos, no tanto como un tercio de los pacientes afectos de CAD son elegibles para estos tratamientos debido a la edad, mala salud o subóptima anatomía4, 5 , 6 , 7. con el fin de evaluar nuevos métodos de diagnóstico por imágenes o tratamiento, es fundamental el desarrollo de un modelo animal apropiado.
En el desarrollo de un modelo animal para una enfermedad, el desorden inducido cerca debe emular las características anatómicas y fisiológicas de la enfermedad en los seres humanos8,9. Uno de los animales grandes más ampliamente utilizados para estudios cardiovasculares es el cerdo. El corazón del cerdo es más análogo al corazón del hombre en términos de tamaño, anatomía y fisiología3,6. Similar al corazón del hombre, el miocardio del corazón de cerdo no posee una extensa circulación colateral6. Debido a esto, el corazón de cerdo no tolera bien la obstrucción coronaria aguda, pero puede tolerar una gradual obstrucción de coronarias. Si lentamente se ocluye una arteria coronaria, puede ser utilizado como un modelo de isquemia miocárdica crónica, infarto de miocardio crónico e insuficiencia cardíaca5,6,9,10, 11 , 12 , 13. isquemia crónica puede ser inducida a través de la implantación del stent o la colocación de un dispositivo hidráulico de oclusión, una oclusión estenosis fija o un constrictor ameroid. Hay ventajas y desventajas de todos estos métodos que se describen en detalle en varias publicaciones6,9,13 , pero el método más comúnmente utilizado es el de la colocación del ameroid5, 6,10,11.
El constrictor ameroid consiste en material de caseína encerrado dentro de un acero inoxidable, plástico o titanio anillo. Una vez situados alrededor de una arteria (generalmente la izquierda arteria coronaria descendente anterior (da) o la arteria coronaria circunfleja izquierda (LCX)), el material de caseína absorbe el líquido circundante que causa la luz interna a reducir poco a poco, imitando la estenosis lento de una arteria y resultando finalmente en completa oclusión9,13,14. Este procedimiento utiliza por sí sola o conjuntamente con otros métodos de resultados en una región de la isquemia miocárdica crónica o infarto del ventrículo izquierdo del corazón que ha sido útil para desarrollar y evaluar nuevas imágenes técnicas8, 10,15, tratamientos terapéuticos7,16,17,18 y procedimientos quirúrgicos19,20.
Protocol
los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el corazón nacional, pulmón, sangre Instituto Animal atención y Comité de uso de los institutos nacionales de salud y cumplir con las políticas descritas en la política de servicio de salud pública en Atención humana y uso de animales de laboratorio, la ley de Bienestar Animal y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Nota: el propósito de este procedimiento quirúrgico es conseguir un modelo animal de isquemia crónica que puede utilizarse para desarrollar tratamientos que son clínicamente relevantes para los pacientes con CAD severa. Esto no puede lograrse usando un modelo en vitro.
1. animales
- utilizar cerdos Yorkshire macho pesa entre 12 y 15 kg.
2. pre-quirúrgica procedimientos
- para un antibiótico profiláctico, utilice amoxicilina y clavulanato de potasio (15 mg/kg) por vía oral dos veces al día comenzando 24 horas antes de la cirugía.
Nota: Este antibiótico oral se inicia antes de la cirugía para asegurarse de que el cerdo trague y también asegurarse de que no tengan una reacción alérgica al medicamento postoperatoriamente. - Retener la comida y el agua de cerdo 12 h antes de la cirugía.
- En el día de la cirugía, anestesiar el cerdo con un cóctel de glicopirrolato (0.01 mg/kg), ketamina (33 mg/kg) y midazolam (0.5 - 0.75 mg/kg) dado intramuscular (IM).
- Colocar un catéter de 20 G intravenoso (IV) en una vena de la oreja e intubar al animal con un tubo endotraqueal 7.0 de p.
Nota: Ajustar el tamaño del catéter IV y el tubo endotraqueal como apropiado para el tamaño del cerdo. - Eliminar el vello (depilación) en el lado izquierdo del cerdo desde el hombro hasta el ombligo y desde la línea media abdominal a la columna vertebral.
- Administrar las profilaxis con antibióticos (piperacilina y tazobactam: 100 mg/kg IV) y medicación del dolor (buprenorfina sostenido lanzamiento: 0,2 mg/kg subcutánea (SC) o un transdérmico de fentanilo parches 25-50 μg/h).
Nota: El antibiótico IV se da porque los animales se ayunaban durante 12 h antes de la cirugía y no reciben el mencionado antibiótico oral durante este tiempo. - Transporte del cerdo a la sala de operaciones y conectar el tubo endotraqueal a la máquina de anestesia, equipada con un sensor de corriente lateral para controlar los gases de las vías respiratorias. Mecánicamente ventilar el cerdo usando un volumen tidal de 10 mL/kg como punto de partida y no exceder una presión de vía aérea de 30 cm H 2 O. sistema la frecuencia respiratoria entre 10-20 respiraciones por minuto (bpm) y ajuste como sea necesario para mantener el fin-de marea (2) CO Niveles de PetCO 2) entre 28 y 35 mm Hg. mantener la anestesia con isoflurano (1-3%) o sevoflurano (2-5%).
- Colocar el lado derecho del cerdo hacia abajo en la mesa de operaciones. Coloque todos los sondeos necesarios para monitorear la temperatura del cuerpo (BT), Electrocardiograma (ECG), oximetría de pulso (SpO 2), etc.
- preparar el sitio quirúrgico mediante tres peelings alternas con 2% de clorohexidina y el 70% de alcohol (se aplica en un movimiento circular, comenzando con el centro y moviéndose hacia afuera).
- Cubra el sitio quirúrgico con técnica aséptica 21.
3. Procedimiento quirúrgico
- exponen el corazón a través de una toracotomía izquierda.
- Hacer una incisión en la piel paralelamente a la 4 th y 5 th intercostal espacio unos 8-9 cm de largo con una hoja de bisturí Nº 10.
- Corte a través del dorsal ancho y Serrato ventralis músculos usando un par de tijeras de Metzenbaum curvas y pinza Adson Brown. Uso de electrocauterización para mantener la hemostasia necesaria.
- Entrar en la cavidad pleural a través de los músculos intercostales entre el 4 to y 5 costillas de th con el corte de tijeras de Metzenbaum a lo largo del aspecto anterior del 4 nivel de la costilla. Para reducir la posibilidad de dañar accidentalmente el pulmón, apague el ventilador en la exhalación justo antes de entrar en la cavidad pleural. Una vez que ha sido violada la cavidad pleural, vuelva a encender el ventilador.
- Utilice un pequeño separador de Finochietto para separar las costillas, exponiendo el corazón.
- Uso Debakey pinzas para sujetar y levantar el pericardio. Utilice tijeras de Potts para hacer un pequeño orificio en el pericardio, permitiendo que el aire entrar en el espacio pericárdico. Continúe la incisión con las tijeras de Potts en el cruce de las arterias LAD y LCX.
- Pinza Babcock de uso para retraer la orejuela auricular izquierda. Con Debakey y pinzas de ángulo recto pequeño, disecar la arteria LCX del tejido circundante antes o próximo a la rama obtusa marginal de 1 st.
- Lugar dos bucles de vasos debajo de la arteria disecada de la LCX, uno en cada extremo. Sostenga un constrictor de ameroid de 3,0 mm de tamaño con el fórceps de pequeño ángulo recto y levante los lazos del buque para guiar suavemente la arteria LCX a través de la apertura de la constrictor. Por lo que la apertura es hacia arriba, gire suavemente el constrictor. Eliminar los bucles de vasos. Vea la figura 1.
Nota: Adecuada disección de la arteria es esencial para evitar que se doblen. Seleccione el constrictor de tamaño apropiado para el animal individual. El constrictor tamaño apropiado rodean cerca del buque sin inicialmente constricting los vasos. Los cerdos domésticos pesan entre 12 y 15 kg requieren ameroid constrictor 2.5-3.5 mm de tamaño. La localización del ameroid constrictor en el recipiente depende en el tamaño deseado de la zona isquémica. - Volver a aproximar el pericardio y cierre con suturas de polipropileno 4-0.
- Restablecer la presión negativa torácica mediante la inserción de una sonda Fr 12 o su equivalente en el espacio pleural con el fin de salida hacia fuera entre las capas de cierre, generalmente dos espacios intercostales posteriores al sitio de la toracotomía.
Nota: Observe el atelectasia del pulmón antes de cerrar las costillas. Si se observan signos de inflado, volver a inflar los pulmones manualmente hasta una presión de 30 mm Hg. - Cierre del tórax mediante suturas polipropileno 1 de la capa intercostal, suturas de polipropileno 0 de Serrato y capa fascial, suturas polipropileno 2-0 para la capa subcutánea y las suturas de polipropileno 3-0 para la capa subcuticular. Grapas o la sutura de la piel.
- Acople una llave de tres vías al final del tubo del pecho y Evacue el aire en el pecho con un 40-60 cc jeringa hasta logra un sello negativo. Rodar al animal sobre su lado del esternón o contrario para facilitar el quitar todo el aire. Una vez el pecho mantiene la presión negativa, retire el tubo de tórax y el punto de salida de la sutura. Si los animales están alojados individualmente postoperatoriamente, la incisión puede ser vendada durante varios días.
4. En el post-operatorio
- tras cierre, infiltrarse en la incisión a lo largo de ambos lados del sitio de la toracotomía con bupivacaína 0.25%.
- Destetar al animal apagado el ventilador y apague la anestesia. Retirar el tubo endotraqueal una vez que el animal respira por cuenta propia y de la deglución.
- Vigilar el animal hasta que se recuperó completamente (despierto y esternal). No debe existir ninguna anormalidad o arritmias en el ECG, la BT deben ser 38.7-39,8 ° C, la SpO 2 debe ser de 95-100% y la frecuencia respiratoria debe ser 32-58 bpm.
- Administrar amiodarona (100 mg, por vía oral dos veces al día) y Bisulfato de clopidogrel (75 mg, por vía oral una vez al día) para prevenir la trombosis y arritmias. Continuar con amoxicilina y clavulanato de potasio (15 mg/kg) por vía oral dos veces al día para operación después de 10 días. Dolor postoperatorio se controla con buprenorfina SR (liberación sostenida) 0,2 mg/kg. SQ cada tres días. La buprenorfina SR puede complementarse con carprofeno (4,4 mg/kg) una vez y luego (2.2 mg/kg) PO o IM BID.
- Mantener todo el material de ropa de cama y forrajeo de los animales ' s área de la vivienda hasta que la incisión haya sanado completamente.
Representative Results
Después de analizar los datos obtenidos de ameroid colocación cirugías realizadas en nuestras instalaciones durante un período de dos años, encontramos la tasa de supervivencia al 80%. El procedimiento fue realizado en 25 cerdos Yorkshire pesa entre 12-15 kg. De los 25 cerdos 20 sobrevivieron al procedimiento de seguimiento, 2 fibrilado y murió poco después de cerrar, 2 fueron sacrificados para la insuficiencia cardíaca severa y edema pulmonar, y 1 tenía una muerte anestésica durante una radiografía de seguimiento. La autopsia reveló un área infartado del ventrículo izquierdo en los animales que murieron dentro de las 24 horas del procedimiento. Se sospecha pero no se podía confirmar que la arteria torcida debido a la presencia del ameroid desde el lumen de la ameroid estaba todavía abierta. Las ameroids obtenidas de los animales que fueron sacrificados por insuficiencia cardiaca fueron examinados. Hubo cierre total de la luz en 18 días.
Los animales sobrevivientes fueron imágenes por resonancia magnética (MRI) en la colocación de 28 días post-ameroid para medir la función del corazón y el tamaño del área isquémico. Figura 2 y figura 3 muestran las imágenes de MRI obtenidas de un cerdo con un ameroid titanio recubierto y un cerdo con un plástico encajonado ameroid, respectivamente. Después de la proyección de imagen, una segunda toracotomía fue realizada para la inyección de células o un procedimiento simulado. Animales siguieron hacia fuera mientras el ameroid post colocación de 16 semanas.
Figura 1: imágenes del cerdo del corazón durante el procedimiento de colocación del ameroid. (A) imagen del corazón de cerdo, mostrando la arteria marginal obtusa (OM), LAD y LCX. (B) imagen de la arteria disecada de la LCX antes de la colocación del ameroid. (C) imagen de la colocación adecuada de la ameroid alrededor de la LCX con la apertura de la ameroid hacia arriba o lejos del corazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen de corazón de cerdo con un titanio recubiertos ameroid. Imagen de un corazón de cerdo tomado cuatro semanas después de la colocación de un constrictor ameroid encajonado de titanio en la arteria LCX. La flecha señala el artefacto creado por el titanio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imagen de un corazón de cerdo con un plástico encajona ameroid. Imagen de un corazón de cerdo tomado cuatro semanas después de la colocación de un plástico encajonado ameroid constrictor en la arteria LCX. La flecha señala el ameroid constrictor. No se observa ningún artefacto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Ameroid constrictor se han utilizado extensivamente para crear modelos animales de isquemia miocárdica crónica, infarto de miocardio crónico e insuficiencia cardíaca5,6,7,9,10 , 11 , 12 , 13 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 22. aunque estos modelos pueden ser creados mediante el uso de stents, los obstructores hidráulicos o estenosis fija los obstructores, la prevalencia del uso de ameroid en la literatura científica permite a los investigadores Comparar con mayor precisión los resultados de su trabajo con han publicado estudios5,6,7,9,10,11,12,13, 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 22. otra ventaja de la utilización de la constrictor ameroid es que el procedimiento es relativamente sencillo y puede realizarse con éxito por cualquier persona con habilidades quirúrgicas razonables y no requiere instrumentos especializados. Los otros métodos mencionados requieren mayor habilidad técnica y, en el caso de la oclusión hidráulico requiere monitoreo postoperatorio intenso debido a los dispositivos externos6,13.
La principal limitación de la utilización de la constrictor ameroid es la variabilidad en la tasa de oclusión9,13. En general, la mayoría de los estudios usando el ameroid constrictor ha encontrado la tasa de estenosis que en las dos primeras semanas y luego poco a poco forma cónica de hasta obstrucción completa produce23,24. Estudios ex vivo de medir directamente la tasa de cierre del lumen del ameroid han confirmado que la mayor reducción en el diámetro de la luz ocurre en las primeras dos semanas y disminuye después de eso25,26. Sin embargo, estos mismos estudios también han demostrado que alrededor de las concentraciones de glucosa y proteínas puede afectar la tasa y la integridad del cierre ameroid, así sugiriendo que en vivo condiciones son probablemente responsables de la variabilidad en ameroid oclusión tasas25,26. Otros investigadores han sugerido que el trauma mecánico, inflamación, fibrosis y formación de trombos causados por el procedimiento de colocación del ameroid sí mismo pueden contribuir a esta variabilidad5,6,25 . El último escenario es probablemente la razón de las muertes prematuras y paros cardíacos observados en este estudio. No puede ser bastante tensionado la importancia de hacer delicado, pero adecuada, disección de la arteria a ambos lados del ameroid para prevenir retorcimientos de la embarcación.
La colocación correcta de la constrictor ameroid es fundamental para desarrollar un área isquémico del corazón que es lo suficientemente grande para tratar pero no tan grande que resulta en la muerte. Colocar el ameroid constrictor la LCX antes de la primera rama obtusa marginal parece funcionar mejor en los cerdos de Yorkshire. Como se informó en otros lugares, esto dio lugar a una zona isquémica de alrededor del 25-30% del ventrículo izquierdo6. Colocar el ameroid cualquiera inferior resultó en un área isquémico que fue insuficiente para el tratamiento específico que estaba siendo investigado en este estudio.
Las arritmias que se producen durante el procedimiento quirúrgico son raras. Administrar amiodarona oral después de la operación hasta el final del estudio, puede prevenir las arritmias durante la operación después de 2 a 3 semanas, cuando se está cerrando el ameroid. Además, conserjería y personal médico debe ser especialmente vigilante en observando cualquier tos durante este tiempo, que podría ser una señal temprana de insuficiencia cardíaca edema pulmonar.
Con los años, se ha mejorado el diseño de la constrictor ameroid sobre. Ameroids están disponibles en numerosos tamaños, permitiendo al cirujano seleccionar un ameroid que coincide con el diámetro del vaso a ser ocluido. El anillo exterior de la ameroid está disponible en acero inoxidable, titanio o plástico. Esto es especialmente importante cuando se evalúan los corazones afectados usando MRI. Todo el metal puede causar un artefacto en las imágenes de MRI. Titanio ameroids causar menos de un artefacto de acero inoxidable, mientras que el plástico no deja en absoluto. Imágenes de IRM que muestra la diferencia entre un ameroid de titanio y un plástico ameroid se muestran en la figura 2 y figura 3, respectivamente. El artefacto en el lado derecho del corazón en la figura 2 es causado por el anillo de titanio encajonar el ameroid. Hasta hace poco, el anillo de contención en el ameroid plástico era demasiado voluminoso para colocar alrededor de una arteria coronaria sin enroscar el vaso. El ameroid constrictor utilizado en este estudio (véase Tabla de materiales) es una versión mucho más simplificada, que tiene el mismo diámetro externo que el metal ameroids.
Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.
Acknowledgments
Financiación de intramuros fue proporcionada para este proyecto por la división de investigación intramuros, National Heart, Lung and Blood Institute en los institutos nacionales de salud. Agradece a Dr. James Hawkins, Dr. Robert Hoyt, la división de NIH de recursos veterinarios y el personal del programa de investigación de cirugía cardiotorácica en el NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia: ketamine | Putney, INC | Dose: 25mg/kg, IM | |
| Anesthesia: midazolam | App Pharmaceuticals | Dose: 0.75mg/kg, IM | |
| Anesthesia: isoflurane | Baxter | Dose: 1-3%, INH | |
| Antibiotics: amoxicillin and clavulanate potassium | WG Critical Care | Dose: 15mg/kg, IV | |
| Antibiotics: piperacillin and tazobactam | Fresenius Kabl | Dose: 100mg/kg, PO | |
| Analgesia: buprenorphine (sustained release) | Zoo Pharm | 10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC | |
| Analgesia: fentanyl patch | Mylan | Dose: 25-50mcg/hr, TD | |
| Analgesia: bupivicaine 0.25% | Hospira | Give SC at incision site for analgesia | |
| Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | for scrubbing surgical site |
| Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | for scrubbing surgical site |
| Datex-Ohmeda Aestiva /5 anesthesia machine | GE Healthcare Madison WI. | ||
| Pediatric anesthesia circuit | Westmed | 7-8901 | www.westmedinc.com |
| Water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | |
| EKG | Medtronics- Physiocontrol | LifePak 20 | |
| Oxygen saturation monitor | GE Healthcare Madison WI. | ||
| Temperature probe | GE Healthcare Madison WI. | ||
| Electrical cautery unit | Valley Labs | Force 2 | Cut-30 Coag-40 |
| Endotracheal tube | Hudson RCI | HUD510312 | Hudson brand - appropriate size for animal |
| Intravenous catheter, size 20 gauge | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-360097 | Fluid and drug administration |
| Lactated Ringers Solution | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
| Macro IV drip set 15 drops/ml | Hospira | 12672-28 | |
| Surgical gowns | Kimberly Clark | 90142 | |
| Utility drapes | Kimberly Clark | 89731 | |
| Adult laparotomy drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Sterile surgical gloves | Cardinal Health (Allegiance) | 22537-570 | Size 7 - use appropriate size for surgeon |
| Needle mat - sterile | Medline | NC30MBR | |
| Cautery pencil | Medline | ESPB 2000 | |
| Suction tubing | Medline | DYND50251 | |
| Suction tip; Yankauer | Medline | DYND50130 | |
| Suction cannister | Cardinal Health (Allegiance) | 65651-220 | |
| Ameroid constrictors sizes 2.5mm -3.5mm | Research Instruments SW, Inc. | 760-764-9411 | Types: Stainless steel, titanium, or plastic |
| 3-way stopcock | Cardinal Health (Allegiance) | 455991 | For chest tube |
| Stomach tube - 18 Fr | Cardinal Health (Allegiance) | DC4418 | For chest tube |
| 60cc syringe | Cardinal Health (Allegiance) | SY35060LL | For chest tube |
| 3cc syringe | Cardinal Health (Allegiance) | SY35003LL | For post-op analgesia injection |
| Skin stapler - 35W | Ethicon Endo-Surgery | PMW 35 | skin closure |
| Scalpel blade - size #10 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-010 | |
| Mini silicone vessel loops 1 Pak | Aspen Surgical | 011001PBX | for elevating circumflex artery to apply ameroid |
| 1 (polypropylene) taper | Ethicon | BB #8425H | close ribs |
| 2-0 (polypropylene) taper | Ethicon | SH #8523 | close muscle layers |
| 4-0 (polypropylene) taper | Ethicon | BB #8581H | close pericardium |
| 20 gauge needle | Cardinal Health (Allegiance) | 81-200219 | post-op analgesia injection |
| antimicrobial drape | 3M | 6640EZ | |
| Finochietto rib retractor - infant size | Codman | 50-8057 | |
| Potts-Smith scissors | Roboz | RS-6043 | |
| Babcock forceps | Roboz | RS-8022 | |
| Pean hemostatic forceps curved | Codman | 30-4565 | |
| scalpel handle #7 | Codman | 11-5534 | |
| Brown Adson forceps | Roboz | RS-5231 | |
| Debakey forceps | Roboz | RS-7562 | |
| Mayo scissors | Roboz | RS-6870SC | |
| Metzenbaum dissecting scissors | Codman | 36-5011 | |
| Metzenbaum dissecting scissors | Codman | 36-5016 | |
| Mayo-Hegar needle holder | Codman | 36-2017 | |
| Ryder needle holder | Codman | 36-3012 | |
| Kelly hemostatic forceps | Roboz | RS-7130 | |
| Reynolds hemostatic forcep | Roboz | RS-7211 | |
| Weitlander retractor | Roboz | RS-8612 | |
| Yorkshire domestic pigs |
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