Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie
Summary
El objetivo de este protocolo es modificar la penetrancia de fenotipos mutantes esqueléticos letal en el pez cebra por cría selectiva. Mutantes letales no pueden cultivarse a la edad adulta y crían ellos mismos, por lo tanto este protocolo describe un método de seguimiento y selección de penetración a través de múltiples generaciones por prueba de progenie.
Abstract
Pez cebra mutantes fenotipos son a menudo incompleto penetrantes, que se manifiesta sólo en algunas mutantes. Fenotipos interesantes que aparecen sistemáticamente pueden ser difíciles de estudiar y pueden conducir a la confusión de resultados. El protocolo descrito aquí es un paradigma de reproducción directa para aumentar y disminuir la penetrancia en mutantes esquelética letal pez cebra. Porque mutantes letales no pueden ser criados selectivamente directamente, se emplea la estrategia clásica cría selectiva de prueba de progenie. Este método también incluye protocolos para el pez cebra de Genotipado de Kompetitive alelo específico PCR (KASP) y coloración de larvas de pez cebra cartílago y hueso. Aplicación de la estrategia de cría descrita aquí puede aumentar la penetración de un fenotipo esquelético interesante que permite resultados más reproducibles en aplicaciones posteriores. Además, disminuye la penetrancia mutante a través de esta estrategia de cría selectiva puede revelar los procesos del desarrollo que requieren más crucial la función del gen mutado. Mientras que el esqueleto se considera específicamente aquí, proponemos que esta metodología sea útil para todas las líneas de pez cebra mutante.
Introduction
El pez cebra es un sistema potente para comprender el desarrollo del esqueleto. Variedades de pez cebra mutante, biólogos descifrar funciones de los genes durante la skeletogenesis. Sin embargo, pueden presentar fenotipos mutantes esqueleto de pez cebra con penetrance variable1,2,3,4 que puede dificultar el análisis del desarrollo y genéticos. El propósito de este método es triple. En primer lugar, generar líneas de pez cebra mutante que consistentemente producen fenotipos severos permite estudios desarrollo aguas abajo como grabación Time-lapse y transplante de5 6. Este tipo de estudios puede paralizado al intentar estudiar fenotipos que sólo manifiestan constantemente. En segundo lugar, endogamia cepas de pez cebra puede disminuir la variación genética, fomentando así la reproducibilidad y consistencia experimental. Por ejemplo, todos en situ el análisis de hibridación en una cepa consanguínea selectivamente pueden reducir variabilidad confusión y reforzar conclusiones. En tercer lugar, generando severas y suaves cepas revelará toda la serie fenotípica que puede resultar de una mutación particular.
A primera vista, parece imposible la cría selectiva de los mutantes letales. ¿Cómo puede una raza de penetrancia cuando los animales que se anotaron para la selección están muertos? Afortunadamente, los métodos para la cría selectiva por selección de familia, específicamente la progenie pruebas, han demostrado eficacia en ganadería programas muchos años7,8. Estos programas se utilizan principalmente para la cría selectiva para caracteres que sólo están presentes en uno de los sexos, como la producción de leche en vacas o producción de huevos en gallinas. Los machos de estas especies no se anotó directamente, pero su progenie se anotó y luego se asigna un valor a los padres. Préstamos de esta estrategia, el protocolo presentado aquí consiste en anotar la descendencia mutante fija y teñida de un par de peces cebra que son heterocigotos para un gen mutante de interés. La penetrancia de un fenotipo en la descendencia mutante letal homocigótica se asigna a los padres al decidir que los individuos producen la próxima generación en la línea. Encontramos que este método es un medio eficaz de cambio de penetrancia en el pez cebra mutantes esquelética letal1.
Similar a otros estudios, este protocolo de cría selectiva toma bajo criterios de consideración como tamaño de la nidada, supervivencia de crías, desarrollo normal de los embriones y relación de sexo9. Sin embargo, estos factores se consideran en el contexto de un fondo de mutantes con el objetivo de desplazar la penetrancia mutante. Por lo tanto, este protocolo extiende anteriores paradigmas de crianza selectiva, ofreciendo un método para reforzar análisis mutantes del desarrollo así como aumentar la homogeneidad de fondo.
Este protocolo requiere extenso genotipado, así que es importante desarrollar un protocolo de genotipado fiable y rápida de antemano. Hay muchos protocolos de genotipado disponible10,11, sin embargo encontramos el KASP genotyping12,13,14 más rápido, es más coste eficiente y más confiable que los métodos basada en el clivaje enzimático de la restricción de secuencias amplificadas10. Por lo tanto, incluimos un protocolo KASP en este trabajo. Además, nos centramos en esqueléticos fenotipos mutantes en este protocolo e incluyen un procedimiento de Alcian azul/alizarina rojo tinción modificada de protocolos anteriores15.
El método descrito aquí es una estrategia sencilla para cambio de penetrancia mutante letal hacia arriba o hacia abajo. Si bien este protocolo se centra en esqueléticos fenotipos mutantes, creemos será una estrategia útil para la cría de todas las líneas de pez cebra mutante. De hecho, la utilidad de esta estrategia de cría probable se extiende más allá de pez cebra. Predecimos que este protocolo puede ser modificado para cambiar la penetración en una amplia gama de organismos. Cambio mortal penetrancia por pruebas de progenie puede ayudar a impulsar el progreso de cualquier genetista del desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cría selectiva presenta sutilezas de funciones de los genes
Cambio de fenotipos mutantes para ser más o menos graves mediante la cría selectiva es una forma sencilla para obtener nuevos conocimientos sobre funciones de los genes. En comparación con los métodos estándar de cría seleccionada, el protocolo que presentamos puede producir una comprensión mucho más completa de los fenotipos mutantes. Específicamente, mediante la generación de cepas que son graves, puede s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Chuck Kimmel para la dirección, John Dowd para ayuda en el desarrollo de esta estrategia de mejoramiento, Macie Walker por su trabajo en el perfeccionamiento de la mancha esquelética y Charline Walker y Bonnie Ullmann pez cebra útiles consejos. Este trabajo fue apoyado por DE024190 K99/R00 a JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
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