Summary

通过子代检测改变斑马鱼致死性骨骼突变显

Published: September 01, 2017
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Summary

本议定书的目的是改变显致命的骨骼突变体表型在斑马鱼的选择性育种。致命的突变体不能成长为成年和繁殖, 因此本协议描述了通过后代测试来跟踪和选择显的方法。

Abstract

斑马鱼变种的表型往往是不完全渗透, 只是在一些变种的显着。有趣的表型, 不一致的出现可能是很难研究, 并可能导致混淆的结果。这里描述的协议是一个简单的繁殖范例, 以增加和减少显在致命的斑马鱼骨骼突变体。由于致命突变体不能直接繁殖, 因此采用了典型的子代检测育种策略。该方法还包括 Kompetitive 等位基因特异性 PCR (KASP) 基因分型斑马鱼和染色幼虫斑马鱼软骨和骨的协议。应用这里描述的畜牧业战略可以增加一个有趣的骨骼表型的显, 使下游应用更具可重现性的结果。此外, 通过这一选择育种策略减少突变显, 可以揭示最关键的发展过程, 需要突变基因的功能。虽然骨骼是在这里被特别考虑, 我们建议, 这一方法将是有用的所有斑马鱼突变线。

Introduction

斑马鱼是一个强大的模型系统, 了解骨骼的发展。与变种斑马鱼菌株, 生物学家可以破译基因功能在骨化。然而, 斑马鱼骨骼突变表型可以出现可变显1,2,3,4 , 这可能会阻碍发展和遗传分析。这种方法的目的是三重的。首先, 生成斑马鱼突变线, 持续产生严重的表型, 使下游的发展研究, 如延时记录5和移植6。这类研究可能会因为试图研究表型而被削弱, 而这只是表现出不一致。其次, 近亲繁殖的斑马鱼菌株可以减少遗传背景的变化, 从而促进实验的一致性和重现性。例如, 对一个选择性的近亲繁殖菌株进行所有的原位杂交分析, 可以减少混杂的变异性并加强结论。第三, 产生严重的和轻度的菌株将揭示出整个表型系列, 可能产生的一个特定的突变。

乍一看, 选择性繁殖致命突变体似乎是不可能的。当被选入的动物死了的时候, 你怎么能为显繁殖呢?幸运的是, 选择育种的方法, 特别是子代试验, 在家畜育种项目中已经证明了许多年的有效性7,8。这些程序主要用于选择性育种的性状, 只存在于一个性别, 如牛奶生产的奶牛或鸡蛋生产母鸡。这些物种的雄性不能直接得分, 但他们的后代得分, 然后将价值分配给父母。从这一策略中, 这里所提出的协议包括对斑马鱼的固定和染色的突变后代进行评分, 这两个杂是为了一个感兴趣的突变基因。在决定哪些个体会产生下一代的时候, 显的一个表型会被分配给父母。我们发现这种方法是一种有效的方式转移显在斑马鱼致死性骨骼突变体1

与其他研究类似, 这一选择育种协议考虑的标准, 如离合器大小, 后代的生存, 胚胎的正常发育和性别比例9。然而, 这些因素都是在一个突变背景下考虑的, 目的是转移突变显。因此, 该协议扩展了以往的选择育种范式, 提供了一种加强发育突变体分析和增加背景均匀性的方法。

这项协议需要广泛的基因分型, 所以必须事先制定一个可靠的快速基因分型协议。有许多基因分型协议可用10,11, 但是我们发现 KASP 基因分型12,13,14的速度更快, 成本效率更高, 比方法更可靠基于限制性酶裂解的扩增序列10。因此, 我们在这项工作中包括了一个 KASP 协议。此外, 我们的重点是在这个协议的骨骼突变表型, 并包括一个过程的新蓝/茜素红染色修改以前的协议15

这里描述的方法是一个简单的策略, 转移致死突变显向上或向下。虽然这个协议的重点是骨骼突变的表型, 我们相信这将是一个有用的战略, 畜牧业的所有变种斑马鱼线。事实上, 这种育种策略的效用可能超越斑马鱼。我们预测, 这一协议可以修改, 以转移显在一个广泛的有机体范围。通过子代测试转移致死显可以帮助推动任何发展遗传学家的进步。

Protocol

本协议中描述的所有实验都是按照科罗拉多大学和俄勒冈大学机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的要求完成的. 1. 准备未选定的起始库存 通过鳍片剪辑 11 , 通过选择的方法对 full-sibling 动物的基因型基因进行分型, 以确定杂携带者的兴趣KASP 12 , 13 , 14 。此协议是使用斑马?…

Representative Results

该协议是一种长期饲养技术, 有助于了解斑马鱼骨骼突变体 (图 1)。后代测试的选择育种应该在几代人的显中产生一个整体的向下和向上的转变 (图 2)。在我们以前的工作中, 两轮的选择性育种使平均显向下, 从17% 到 3%1。同样, 在我们的上行线, 我们把平均显从63% 代上升到93% 在三世代。如果在四轮的选择育种后,…

Discussion

选择性育种揭开基因功能的微妙之处

通过选择性育种, 改变突变型的表现形式或多或少是严重的, 这是获得基因功能新见解的直接途径。与未选定育种的标准方法相比, 本文所提出的协议可以更全面地了解突变表型。具体来说, 通过产生严重的菌株, 突变型的全广度可能会被揭示, 包括一些观测与未选定的股票。因此, 研究中的基因的新的发展作用可以被发现。相反,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们要感谢恰克的指导, 约翰·多德帮助制定这一育种战略, 马西埃沃克为她的工作, 完善的骨骼染色, Charline 沃克和邦尼乌尔曼为有益的斑马鱼的建议。这项工作得到了 K99/R00 DE024190 对 JTN 的支持。

Materials

Paraformaldehyde, pelleted, solid Ted Pella Co. 18501 Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solid Acros Organics 223210010
10x PBS, Aqueous Fisher BP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solid Anatech Ltd. 867 Must be from Anatech
Alizarin Red, solid Sigma A5533-25G
Glycerol, liquid Fisher BP229 1
Hydrogen peroxide, liquid Fisher BP263500
Potassium hydroxide,  solid Fisher P250 500
StepOnePlus Real-time PCR Machine Applied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) Applied Biosystems 4346906
Microseal 'B' seal BioRad MSB1001
KASP Master Mix, High ROX LGC KBS-1016-022 https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer Mix LGC KBS-2100-100
Tris HCl, solid Fisher BP153 500
potassium chloride, solid Fisher BP366 500
Tween-20, liquid Fisher BP337 100
Nonidet P40 ThermoFisher 28324
Tricaine-S Western Chemicals
Proteinase K Fisher BP1700 100
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
Controlled Drop Pasteur Pipets Fisher 13-678-30
Nanodrop ThermoFisher for DNA quantitation

References

  1. Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
  2. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
  3. Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
  4. DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
  5. McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
  6. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
  7. Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
  8. Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
  9. Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
  10. Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
  11. Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
  12. He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
  13. Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
  14. Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
  15. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
  16. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  18. Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
  19. McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
  20. Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
  21. Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
  22. McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
  25. Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
  26. Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
  27. Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).

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Cite This Article
Brooks, E. P., Nichols, J. T. Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing. J. Vis. Exp. (127), e56200, doi:10.3791/56200 (2017).

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