Shifting zebrafisk dødbringende skelet Mutant penetrans af afkom test
Summary
Målet med denne protokol er at ændre penetrans af dødbringende skelet mutant fænotyper i zebrafisk ved selektiv avl. Dødbringende mutanter kan ikke dyrkes til voksenalderen og avlet dem selv, derfor denne protokol beskriver en metode til sporing og vælge penetrans gennem flere generationer af afkom test.
Abstract
Zebrafisk mutant fænotyper er ofte utilstrækkeligt penetrant, kun manifesterer sig i nogle mutanter. Interessant fænotyper, der inkonsekvent vises kan være svært at studere, og kan føre til confounding resultater. Protokollen beskrevet her er en enkel avl paradigme kan øge og mindske penetrans i dødbringende zebrafisk skelet mutanter. Fordi dødbringende mutanter ikke kan selektivt avlet direkte, er den klassiske selektiv avl strategi afkom test ansat. Denne metode omfatter også protokoller for Kompetitive allel specifik PCR (KASP) genotypebestemmelse zebrafisk og farvning larve zebrafisk brusk og knogle. Anvende dyrehold strategi beskrevet her kan øge penetrans af en interessant skelet fænotype muliggør mere reproducerbare resultater i downstream applikationer. Derudover kan faldende de mutant penetrans gennem denne selektiv avl strategi afsløre de udviklingsmæssige processer, der kræver mest afgørende funktion af det muterede gen. Mens skelettet betragtes specifikt her, foreslår vi, at denne metode vil være nyttig for alle zebrafisk mutant linjer.
Introduction
For zebrafisk er en kraftfuld modelsystem for at forstå skelet udvikling. Med mutant zebrafisk stammer, kan biologer dechifrere genfunktion under skeletogenesis. Zebrafisk skelet mutant fænotyper kan fremsætte med variabel penetrans1,2,3,4 , som kan hindre udviklingsmæssige og genetiske analyser. Formålet med denne metode er tredobbelt. Først, generere zebrafisk mutant linjer, som hele tiden producerer alvorlige fænotyper muliggør downstream udviklingsmæssige undersøgelser som time-lapse optagelse5 og transplantation6. Disse former for undersøgelser kan blive lammet ved at forsøge at studere fænotyper, der kun manifesterer inkonsekvent. For det andet kan indavl zebrafisk stammer mindske genetiske baggrund variation, således at fremme eksperimenterende konsistens og reproducerbarhed. For eksempel kan udfører alle i situ hybridisering analyser på et selektivt indavlet stamme reducere konfunderende variabilitet og styrke konklusioner. For det tredje vil generering alvorlig og mild stammer afsløre hele fænotypiske serien, der kan skyldes en bestemt mutation.
Ved første øjekast, synes selektiv avl af dødbringende mutanter umuligt. Hvordan kan en race for penetrans når de dyr, der er scoret for udvælgelse er døde? Heldigvis, metoder til selektiv avl af familie udvalg, specielt afkom test, har bevist effektiviteten i husdyravl programmer for mange år7,8. Disse programmer anvendes hovedsageligt til selektiv avl for træk, som kun findes i én sex, som mælkeproduktionen i køer eller ægproduktionen i høns. Hanner af disse arter ikke blive scoret direkte, men deres afkom er scoret og en værdi tildeles derefter til forældrene. Låntagning fra denne strategi, indebærer protokollen præsenteres her scoring den faste og farves mutant afkom fra et par af zebrafisk, der er heterozygous for et mutant gen af interesse. Penetrans af en fænotype i homozygot dødbringende mutant afkom er tildelt forældre når de beslutter hvilke individer vil producere den næste generation i linjen. Vi finder, at denne metode er et effektivt middel til skiftende penetrans i zebrafisk dødbringende skelet mutanter1.
I lighed med andre undersøgelser, selektiv avl protokollen tager under overvejelse kriterier som kobling størrelse, overlevelse af afkom, normal udvikling af embryoner, og kønsfordelingen9. Men disse faktorer anses alle inden for rammerne af en mutant baggrund med formålet at flytte den mutante penetrans. Derfor, denne protokol udvider tidligere selektiv avl paradigmer ved at tilbyde en metode til at styrke udviklingsmæssige mutant analyser samt øge baggrunden homogenitet.
Denne protokol kræver omfattende genotypebestemmelse, så det er vigtigt at udvikle en pålidelig, hurtig genotypebestemmelse protokol på forhånd. Der er mange genotypebestemmelse protokoller findes10,11, men vi finde de KASP genotypebestemmelse12,13,14 koster hurtigere, mere effektiv og mere pålidelige end metoder baseret på begrænsning enzym kløvningen af forstærkede sekvenser10. Derfor, vi medtager en KASP protokol i dette arbejde. Derudover vi fokusere på skelet mutant fænotyper i denne protokol og omfatter en procedure for Alcian blå/Alizarin rød farvning modificeret fra tidligere protokoller15.
Metoden beskrevet her er en enkel strategi for skiftende dødbringende mutant penetrans opad eller nedad. Mens denne protokol fokuserer på skelet mutant fænotyper, mener vi, at det vil være en nyttig strategi for opdræt af alle mutant zebrafisk linjer. I virkeligheden, nytten af denne avl strategi sandsynligvis strækker sig ud over zebrafisk. Vi forudser, at denne protokol kan ændres for at flytte penetrans i en bred vifte af organismer. Shifting dødbringende penetrans af afkom test kan hjælpe fremskynde udviklingen i enhver udviklingsmæssige genetiker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektiv avl afslører finesser af genfunktioner
Shifting mutant fænotyper for at være mere eller mindre alvorlige ved selektiv avl er en enkel måde at få ny indsigt i genfunktion. Sammenlignet med standard metoder af umarkerede avl, kan protokollen præsenteres her give en langt mere komplet forståelse af mutant fænotyper. Specifikt, ved at generere stammer, der er svær, kan den fulde bredde af mutant fænotyper blive afsløret, herunder nogle, der var verificeringspro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Chuck Kimmel vejledning, John Dowd om hjælp til at udvikle denne avl strategi, Macie Walker for hendes arbejde med at perfektionere skelet pletten og Charline Walker og Bonnie Ullmann for nyttige zebrafisk rådgivning. Dette arbejde blev støttet af K99/R00 DE024190 til JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
