संतति परीक्षण द्वारा स्थानांतरण Zebrafish घातक कंकाल उत्परिवर्ती Penetrance
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य चयनात्मक प्रजनन द्वारा zebrafish में घातक कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes के penetrance को बदलने के लिए है । घातक म्यूटेंट वयस्कता के लिए नहीं उगाया जा सकता है और खुद को पैदा, इसलिए इस प्रोटोकॉल पर नज़र रखने और संतति परीक्षण द्वारा कई पीढ़ियों के माध्यम से penetrance चयन के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
Zebrafish उत्परिवर्ती phenotypes अक्सर पूरी तरह से व्याप्ति हैं, केवल कुछ म्यूटेंट में प्रकट । दिलचस्प phenotypes है कि लगातार दिखाई मुश्किल हो सकता है अध्ययन करने के लिए, और परिणाम की स्थापना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक सीधी प्रजनन प्रतिमान को बढ़ाने के लिए और घातक zebrafish कंकाल म्यूटेंट में penetrance कमी है । क्योंकि घातक म्यूटेंट चुनिंदा सीधे नस्ल नहीं किया जा सकता है, संतान परीक्षण के क्लासिक चयनात्मक प्रजनन रणनीति कार्यरत है । इस विधि Kompetitive एलील विशिष्ट पीसीआर (KASP) genotyping zebrafish और दाग लार्वा zebrafish उपास्थि और हड्डी के लिए प्रोटोकॉल भी शामिल है । पशुपालन रणनीति लागू यहां वर्णित एक दिलचस्प कंकाल phenotype बहाव अनुप्रयोगों में अधिक प्रतिलिपि परिणाम को सक्षम करने के penetrance बढ़ा सकते हैं । इसके अलावा, इस चयनात्मक प्रजनन रणनीति के माध्यम से उत्परिवर्ती penetrance घटते विकास प्रक्रियाओं है कि सबसे महत्वपूर्ण रूप से रूपांतरित जीन के समारोह की आवश्यकता प्रकट कर सकते हैं । जबकि कंकाल विशेष रूप से यहां माना जाता है, हम प्रस्ताव है कि इस पद्धति सभी zebrafish उत्परिवर्ती लाइनों के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
Introduction
zebrafish कंकाल के विकास को समझने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है । उत्परिवर्ती zebrafish उपभेदों के साथ, जीव skeletogenesis के दौरान जीन समारोह को समझने में कर सकते हैं । हालांकि, zebrafish कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes चर penetrance1,2,3,4 जो विकासात्मक और आनुवंशिक विश्लेषण बाधा कर सकते है के साथ मौजूद कर सकते हैं । इस विधि का उद्देश्य तिगुना है । सबसे पहले, पैदा zebrafish उत्परिवर्ती लाइनों जो लगातार गंभीर phenotypes उत्पादन समय-चूक रिकॉर्डिंग5 और ट्रांसप्लांटेशन6की तरह बहाव के विकास के अध्ययन में सक्षम बनाता है । अध्ययनों के इन प्रकार के अध्ययन के प्रयास से अपंग किया जा सकता है phenotypes कि केवल प्रकट असंगत । दूसरा, रिश् zebrafish उपभेदों आनुवंशिक पृष्ठभूमि भिंनता को कम कर सकते हैं, इस प्रकार प्रयोगात्मक संगति और reproducibility को बढ़ावा देने के । उदाहरण के लिए, सभी सीटू में संकरण विश्लेषण पर एक चयनात्मक रूप से नस्लीय तनाव को कम करने और निष्कर्ष को सुदृढ़ कर सकते हैं । तीसरा, गंभीर और हल्के उपभेदों पैदा पूरे phenotypic श्रृंखला है कि एक विशेष उत्परिवर्तन से परिणाम कर सकते है प्रकट होगा ।
पहली नज़र में, घातक म्यूटेंट के चयनात्मक प्रजनन असंभव लगता है । कैसे penetrance के लिए एक नस्ल जब जानवरों है कि चयन के लिए बनाए गए है मर चुके हैं? सौभाग्य से, परिवार के चयन, विशेष रूप से संतति परीक्षण द्वारा चयनात्मक प्रजनन के लिए तरीके, कई वर्षों के लिए पशुधन प्रजनन कार्यक्रमों में प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है7,8। इन प्रोग्रामों को मुख्य रूप से लक्षण है कि केवल एक सेक्स में मौजूद है के लिए चयनात्मक प्रजनन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, गायों में दूध उत्पादन या मुर्गियां में अंडा उत्पादन की तरह । इन प्रजातियों के नर सीधे नहीं बनाए जा सकते, लेकिन उनकी संतानें संगीतबद्ध की जाती हैं और एक मान तो माता-पिता को सौंपा जाता है. इस रणनीति से उधार, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल zebrafish की एक जोड़ी से फिक्स्ड और सना हुआ उत्परिवर्ती वंश स्कोरिंग शामिल है कि ब्याज की एक उत्परिवर्ती जीन के लिए heterozygous हैं । homozygous घातक उत्परिवर्ती वंश में एक phenotype के penetrance माता पिता को सौंपा जब निर्णय जो व्यक्तियों लाइन में अगली पीढ़ी का उत्पादन होगा । हम पाते है कि इस विधि zebrafish घातक कंकाल म्यूटेंट1में penetrance स्थानांतरण का एक प्रभावी साधन है ।
अंय अध्ययनों के समान, इस चयनात्मक प्रजनन प्रोटोकॉल क्लच आकार की तरह विचार मानदंड के तहत लेता है, वंश के अस्तित्व, भ्रूण के सामांय विकास, और सेक्स अनुपात9। हालांकि, इन कारकों सभी उत्परिवर्ती penetrance स्थानांतरण के उद्देश्य के साथ एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के संदर्भ में विचार कर रहे हैं । इसलिए, इस प्रोटोकॉल एक विधि की पेशकश के विकास उत्परिवर्ती विश्लेषण को मजबूत बनाने के साथ ही पृष्ठभूमि समरूपता बढ़ाने के द्वारा पिछले चयनात्मक प्रजनन मानदंड फैली हुई है ।
इस प्रोटोकॉल व्यापक genotyping की आवश्यकता है, तो यह अग्रिम में एक विश्वसनीय, तेजी से genotyping प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । वहां कई genotyping उपलब्ध प्रोटोकॉल10,11है, लेकिन हम KASP genotyping12,13,14 तेजी से मिल रहा है, और अधिक लागत कुशल, और तरीकों से अधिक विश्वसनीय प्रतिबंध के आधार पर प्रवर्धित अनुक्रम के एंजाइम दरार10. इसलिए, हम इस काम में एक KASP प्रोटोकॉल शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, हम इस प्रोटोकॉल में कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes पर ध्यान केंद्रित करने और Alcian नीले/Alizarin लाल धुंधला पिछले प्रोटोकॉल15से संशोधित करने के लिए एक प्रक्रिया शामिल हैं ।
विधि यहां वर्णित घातक उत्परिवर्ती penetrance ऊपर या नीचे स्थानांतरण के लिए एक सीधी रणनीति है । हालांकि इस प्रोटोकॉल कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes पर केंद्रित है, हमें विश्वास है कि यह सभी उत्परिवर्ती zebrafish लाइनों के पशुपालन के लिए एक उपयोगी रणनीति होगी । वास्तव में, इस प्रजनन रणनीति की उपयोगिता की संभावना zebrafish परे फैली हुई है । हम भविष्यवाणी है कि इस प्रोटोकॉल जीवों की एक विस्तृत रेंज में penetrance शिफ्ट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । संतति परीक्षण द्वारा घातक penetrance स्थानांतरण किसी भी विकासात्मक आनुवंशिकी की प्रगति को आगे बढ़ाने में मदद कर सकते हैं ।
Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगों को कोलोराडो विश्वविद्यालय और ओरेगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUC) के साथ अनुसार और अनुपालन में पूरा किया गया.
1. अचयनित श?…
Representative Results
Discussion
चयनात्मक प्रजनन जीन समारोह के बारीकियों का खुलासा किया
उत्परिवर्ती phenotypes स्थानांतरण या तो अधिक या कम चयनात्मक प्रजनन द्वारा गंभीर हो जीन समारोह में नए अंतर्दृष्टि लाभ के लिए एक सीधा र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मार्गदर्शन के लिए चक Kimmel शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, इस प्रजनन रणनीति के विकास में मदद के लिए जॉन Dowd, कंकाल दाग ख़तम में उसके काम के लिए Macie वाकर, और सहायक Ullmann सलाह के लिए Charline वाकर और बोनी zebrafish । इस कार्य को K99/R00 DE024190 द्वारा JTN को समर्थन दिया गया ।
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
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