テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト
Summary
このプロトコルの目的は、選択的な育成によってゼブラフィッシュにおける致命的な骨格変異表現型の浸透度を変更することです。致命的な突然変異体が大人に成長することはできません彼ら自身を繁殖、このプロトコルが追跡とテストの子孫によって複数の生成を通して浸透度を選択するための方法を記述するため。
Abstract
ゼブラフィッシュ変異体の表現型は、不完全な浸透、のみいくつかの変異で発症しました。一貫性のない表示興味深い表現型は難しいことができ、結果を交絡につながることができます。ここで説明されているプロトコルは、致命的なゼブラフィッシュ骨格変異の浸透度を上げたり下げたりする簡単な繁殖パラダイムです。致命的な突然変異体は、選択的に直接飼育できません、ために、間接検定の古典的な選択的な繁殖戦略を採用します。このメソッドには、Kompetitive の対立遺伝子特定の PCR (KASP) ジェノタイピング ゼブラフィッシュと染色のゼブラフィッシュ稚魚軟骨と骨のプロトコルも含まれています。ここで説明されている飼育方法を適用することは、下流のアプリケーションでより再現性のある結果を有効にする興味深い骨格表現型の浸透度を増やすことができます。さらに、この選択的な繁殖戦略によって突然変異の浸透度を減少させる最も重要な変異遺伝子の機能を必要とする発達のプロセスを表示できます。骨格、特にここと見なされます、この方法論はすべてゼブラフィッシュ突然変異系統の有用であることを提案します。
Introduction
ゼブラフィッシュは、骨格開発を理解するための強力なモデル システムです。ゼブラフィッシュ変異株の生物学者は骨格中に遺伝子の機能を解読できます。ただし、ゼブラフィッシュ骨格変異表現型を発達・遺伝的解析を妨げることができる変数の浸透度1,2,3、4を提示できます。このメソッドの目的は三重です。コマ撮り録画5と移植6のような下流の発達研究が初めに、一貫して重度の表現型を作り出すゼブラフィッシュ突然変異系統を生成できます。研究のこれらの種類は、一貫性のないマニフェストのみ表現型を研究しようとして不自由することができます。第二に、ゼブラフィッシュ系統を近親交配は遺伝的背景変化、実験的一貫性と再現性を促進を減らすことができます。1 つ選択的に交のハイブリダイゼーション解析できますたとえば、すべてその場で実行する交絡のばらつきを抑えることし、結論を強化します。第三に、重度と軽度の株を生成すると、特定の突然変異に起因することができます全体の表現型シリーズが明らかになります。
最初一見で、致命的な突然変異体の選択的な育成は不可能だと思います。選択範囲を獲得している動物が死んでいるとき、浸透のための 1 つの品種をいかにできるか。幸いなことに、家族の選択、テスト、特に子孫によって選択的な育成法は、畜産87,年多くのためのプログラムの有効性を実証しています。これらのプログラムは、のみ牛の牛乳生産や鶏の卵の生産のような 1 つのセックスに存在する形質の選択的な繁殖のため主に使われます。これらの種の男性は直接得点できないが、彼らの子孫を獲得しているし、両親に値が割り当てられます。この戦略から借りて、ここで提示されたプロトコルには、固定と染色変異子孫ゼブラフィッシュのペアからの興味の突然変異遺伝子のヘテロ接合体の得点が含まれます。個人の行に次の世代が生成されますを決定する際、両親にホモ接合体致死突然変異体の子孫の表現型の浸透度が割り当てられます。私たちはゼブラフィッシュ致死の骨格変異体1での浸透度をシフトの効果的な手段をこの方法には見つけます。
他の研究と同様に、この選択的な繁殖のプロトコルは、クラッチ ・ サイズ、子孫の生存、胚および性比9の正常な開発のような検討規準の下でかかります。ただし、これらの要因は、すべての突然変異の浸透度をシフトの目的と変異の背景のコンテキストで考慮されます。したがって、このプロトコルは、背景の均質性を増加し同様、突然変異体の発達の分析を強化する方法を提供することによって前の選択的な繁殖のパラダイムを拡張します。
このプロトコルは、事前に信頼性の高い、迅速なジェノタイピング プロトコルを開発する上で重要な広範な遺伝子型を必要です。多くジェノタイピング プロトコル10、11、しかし我々 は見つける KASP ジェノタイピング報12,13,14はより速くよりコスト効率的、かつより信頼性の高いメソッド増幅されたシーケンス10の制限の酵素の胸の谷間に基づいています。したがって、この作業で KASP プロトコルを含めます。さらに、このプロトコルで骨格変異体の表現型に着目し、, アルシアン ブルー/アリザリン赤染色前のプロトコル15から変更のプロシージャが含まれます。
ここで説明する方法は、上向きまたは下向きに致死突然変異の浸透度をシフトのため簡単な戦略です。このプロトコルは、骨格の変異体の表現型に焦点を当て、すべてのゼブラフィッシュ変異体ラインの飼育のための有用な戦略であろうと信じています。実際には、可能性がありますこの繁殖戦略の有用性は、ゼブラフィッシュを超えて拡張します。我々 は、有機体の広い範囲に浸透度をシフトするこのプロトコルを変更できることを予測します。子孫テストによって致命的な浸透度をシフト任意の発達の遺伝学の進歩を進めることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
選択的な育成は遺伝子機能の機微を発表します。
シフトを詳細または選択的な育成によって重症度の低い突然変異の表現型は、遺伝子の働きに新しい洞察力を得るために簡単な方法です。選択されていない繁殖の標準的な方法と比較すると、ここで提示されたプロトコルは突然変異体の表現型のより完全な理解を得ることができます。具体的には、重度の菌…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
指導のためチャック キンメル、この繁殖戦略の開発に役立つのジョン ・ ダウド、骨格の汚れを完璧に彼女の仕事の Macie ウォーカーとシャーリーン ウォーカーとボニー ウルマン役に立つゼブラフィッシュのアドバイスを感謝したいと思います。この作品は、JTN に K99/R00 DE024190 によって支えられました。
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
