Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Vurdering af de antikoagulerende og anti-inflammatoriske egenskaber i Endothelial celler ved hjælp af 3D cellekultur og ikke-antikoaguleret blod

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

Vi præsenterer en in vitro- model, som giver mulighed for undersøgelse og analyse af koagulation i hele, ikke-antikoaguleret blod. Antikoagulation i systemet afhænger af den naturlige antikoagulation effekt af sunde endotelceller og endotel celle aktivering vil resultere i koagulation.

Abstract

In vivo, endotelceller er afgørende for den naturlige antikoagulation af cirkulerende blod. Derfor fører endotel celle aktivering til blodets koagulation. Dette fænomen er observeret i mange kliniske situationer, som organtransplantation i overværelse af præformerede anti-donor antistoffer, herunder xenotransplantation, samt i iskæmi/reperfusion skade. For at reducere dyreforsøg ifølge 3R standarder (reduktion, udskiftning og raffinement), in vitro- modellerne til at studere effekten i endothelial celle ville aktivering på blodets koagulation være ønskeligt. Dog giver fælles flatbed systemer i endothelial cellekultur et overflade-til-volumen forhold på 1-5 cm2 af endotel pr. mL blod, der ikke er tilstrækkelig for naturlige, endotel-medieret antikoagulation. Dyrkning endotelceller på microcarrier perler kan forhøje overflade-til-volumen forhold til 40-160 cm2/mL. Denne øgede ratio er tilstrækkelig til at sikre den "naturlige" antikoagulation af fuldblod, således at brugen af antikoagulantia kan undgås. Her er en in vitro- microcarrier-baseret system beskrevet at studere virkningerne af genetisk modifikation af svin endotelceller på koagulation af hele, ikke-antikoaguleret blod. I den beskrevne assay, primære svin aorta endotelceller, enten vildtype (WT) eller transgene for menneskelige CD46 og thrombomodulin, var vokset på microcarrier perler og derefter udsat for frisk tegnede ikke-antikoaguleret blod. Denne model giver mulighed for måling og kvantificering af cytokin frigivelse samt aktivering markører for supplement og koagulation i blodplasma. Derudover blev imaging aktiveret endotel celle og deposition af immunoglobuliner, supplement- og koagulation proteiner på de endothelialized perler udført af Konfokal mikroskopi. Denne analyse kan også bruges til at teste medicin, der er meningen for at forebygge endotel celle aktivering og dermed koagulation. Oven på dens potentiale til at nedbringe antallet af dyr, der anvendes for sådanne undersøgelser, er beskrevet analysen let at udføre og konsekvent reproducerbare.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den vaskulære endotel består af en éncellelag i endothelial celler (EF) som linje lumen af blodkar. I en fysiologisk tilstand, inaktiv EF er ansvarlig for opretholdelsen af en antikoagulans og anti-inflammatoriske miljø. 1 dette er medieret af udtryk af antikoagulans og anti-inflammatoriske proteiner på EF-overflade. For eksempel, EF aktivering skyldes iskæmi/reperfusion skader eller vaskulær afvisning af (xeno-) transplanteres organer resulterer i en ændring i endothelial overfladen fra en antikoagulans og anti-inflammatorisk tilstand til en Pro koagulant og pro-inflammatoriske stat. 1

For at studere den fascinerende og komplekse samspil mellem endotel og koagulation faktorer, in vitro- modeller, som efterligner som muligt i vivo situation er særdeles ønskværdige. En fælles begrænsning, der præger konventionelle in vitro- koagulation assays er brugen af antikoaguleret blod, hvilket gør analysen af koagulation-medierede effekter besværlig og endda recalcification værdier fuldblod kan ikke reproducere resultater fås med frisk ikke-antikoaguleret blod. 2 desuden i traditionelle flat-bed celle kultur systemer er det umuligt at udnytte endotelet antikoagulerende egenskaber som en tilstrækkelig endotel celleoverfladen pr. blodvolumen ikke kan nås. Modellen præsenteres her overvinder disse begrænsninger ved dyrkning af EF på overfladen af sfæriske microcarrier perler, så en EF overflade-til-blod forholdet mellem > 16 cm2/mL kan nås, som ligner situationen i små arterioler eller vener, og som blev beskrevet for at være tilstrækkelige til, at "naturlige" antikoagulation af blodet af EF overflade. 3 , 4 fuldblod kan bruges uden tilsat antikoagulantia i denne indstilling. Blodprøver kan indsamles under eksperimentet og cytokiner, koagulationsfaktorer og opløselige komplement aktivering markører kan påvises og kvantificeres. Desuden kan EF-belagt microcarrier perler analyseres for supplement og immunoglobulin aflejring samt udtryk for EF aktivering markører af Konfokal mikroskopi. En anden interessant program omfatter test af lægemidler, som formodes for at forhindre endotel celle aktivering og dermed koagulation. 5 selv om denne model ikke kan helt erstatte dyreforsøg, det tilbyder en metode til at teste specifikke funktionelle hypoteser ex vivo ved hjælp af celler og dermed mindske antallet af dyr, der bruges i grundforskning på iskæmi/reperfusion skade eller (xeno) transplantation.

Den beskrevne model blev brugt til at efterligne en xenotransplantation indstilling i hvilke svin aorta endothelial celler (PAEC) er vokset på microcarrier perler og inkuberes med hele, ikke-antikoaguleret blod. Forskellige transgene PAEC, bærer flere menneskelige gener såsom CD46 til regulering af komplementsystemet og/eller thrombomodulin (hTBM) for regulering af koagulation system, blev analyseret for deres antikoagulerende egenskaber. Endotel celle aktivering, supplement og koagulation systemer er stramt kontrolleret og indbyrdes forbundne. 6 det er derfor vigtigt at forstå, hvordan de forskellige transgene celler opfører sig efter udsættelse for humant blod vedhæftning molekyle udtryk og cytokin udgivelse, afgivelse af glycocalyx og tab af antikoagulerende proteiner. 7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

tyske Landrace svin (vildtype opdrættet i en lokal gård og transgene avlet på Institut for Molekylær dyr avl og bioteknologi, Ludwig-Maximilian Universitet, München, Tyskland), vejer mellem 30 kg til 40 kg, blev brugt i denne undersøgelse. Alle dyr har været opstaldet under standardbetingelser med vand og mad ad lib. Alle dyreforsøg blev udført efter U.K. dyr Act (videnskabelige procedurer) og NIH vejledning for pleje og brugen af forsøgsdyr, samt den schweiziske dyreværnslovgivning. Alle dyreforsøg overholdt retningslinjerne ANKOMME. Dyreforsøg Udvalget af de kantonale veterinary service (Canton i Bern, Schweiz) godkendt alle animalske procedurer, tilladelse ikke. BE70/14. Eksperimentelle protokoller blev raffineret efter 3R principper og state-of-the-art anæstesi og smertebehandling blev brugt til at minimere antallet af dyr og reducere eksponeringen af dyr til stress og smerter under forsøgene.

blod blev trukket fra raske personer af lukket system venepunktur efter schweizisk kompetence og etiske retningslinjer for Bern University Hospital. Udtrykket " ikke-antikoaguleret blod " betyder at blodet ikke er blevet behandlet med eventuelle antikoagulans.

de følgende trin er udført under sterile forhold. Kendskab til grundlæggende celle kultur steril teknik er påkrævet.

1. isolation af PAEC

NOTE: torakal aorta segmenter af 6 til 10 cm blev indhentet fra aflivede tyske Landrace svin på 3 til 6 måneder i alder (anvendes til andre i vivo forsøg) og straks overføres til en 500 mL glasflaske indeholdende transportmedium (DMEM + 1% penicillin/streptomycin).

  1. Pre pels 6-godt plade med fibronektin 12,5 µg/mL i PBS 1 x og placere det i en inkubator ved 37 ° C for 1 h.
  2. Pre varm steril PBS 1 x og celle kultur medium (DMEM).
  3. Tegne svin aorta fra transportmedium.
  4. Placer aorta på en polystyren plade.
  5. Flugter med varm PBS forsigtigt på forhånd.
  6. Skære aorta på langs og ordne det med nåle.
  7. Tilføje varm cellekulturmedium på indre fartøj overflade.
  8. Opsug fibronektin cellekulturmedium og tilføje frisk cellekulturmedium (DMEM suppleret med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 0,4% i Endothelial celle vækst Medium Supplement Mix).
  9. Blød en vatpind i cellekulturmedium. Svaber vat bud på toppen af den indre fartøj overflade forsigtigt og langsomt i samme retning.
  10. Gnide celler i en godt 6-godt plade runde af runde.
  11. Gør det samme for resten af brøndene.
  12. Se celler under mikroskop og 6-godt pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Ændre medium på andendagen og ændre det igen hver 2-3 dage.
  14. Når celler skal være sammenflydende, trypsinize celler og seed dem ind i en T75 kolbe (PAEC P1).

2. PAEC karakterisering

  1. pre coat en 8-godt chamberslide med fibronektin 12,5 µg/mL i PBS 1 x og placere det i en inkubator ved 37 ° C for 1 h.
  2. Frø 5 x 10 4 celler/brønd og Inkuber natten over i varmeskab ved 37 ° C.
  3. Cellerne vaskes to gange med PBS ++ (PBS suppleret med CaCl 2 og MgCl 2), 300 μL/brønd.
  4. Fix celler med 3,7% PARAFORMALDEHYD i 10 min. ved stuetemperatur, 200 μl/brønd.
  5. Vaske cellerne 3 gange med PBS ++, 300 μL/brønd.
  6. Tilsættes 300 μl af PBS 1 x-3_% BSA (blokerende buffer) og forlade 30 min ved stuetemperatur.
  7. Anvender primære antistoffer (anti-VE-cadherin, anti-CD31, anti-vWF) fortyndes i PBS 1x-1%BSA-0.05% vaskemiddel, 160 μL/brønd og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  8. Vask 3 gange med PBS ++ (200 μl/brønd).
  9. Anvende sekundære antistoffer og DAPI fortyndes i PBS 1x-1%BSA-0.05% vaskemiddel, 160 μL/brønd, og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  10. Vask 3 gange med PBS ++ (200 μl/brønd).
  11. Montere dias med glycerol baseret montering medium og kontrollere endotel celle markører udtryk under et fluorescens mikroskop.
    Bemærk: Kultur svin aorta endotelceller i T175 kolbe (DMEM lav glucose medium + 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 0,4% i Endothelial celle vækst Medium Supplement Mix) indtil 90% sammenløbet er nået. (såning tæthed 1 x 10 6 celler, 90% sammenløbet svarer nogenlunde til 5 x 10 6 celler).

3. Belægning af Microcarrier perler

  1. 7 mL microcarrier perler blandes med 42 mL af kollagen i en 50 mL tube (100 μg/mL, fortyndet i en 0,2% eddikesyreopløsning) og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  2. Vaske perlerne to gange med 25 mL PBS pH 7,4 (tilsættes 25 mL PBS, bland godt med en pipette og vente, indtil perlerne er slog sig ned så Fjern supernatanten og gentag) og en gang med 25 mL af DMEM medium.
  3. Dækker perler i 50 mL tube med 10mL af medium 199 suppleret med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% L-glutamin, 0,4% i Endothelial celle vækst Medium Supplement Mix og 25 μL af heparin (5000 IU/mL) og tillade ækvilibrering for 10 min brug.

4. Indsamling celler

  1. fjerne cellekulturmedium fra T175 kolbe indeholdende PAEC og tilsættes 5 mL PBS pH 7,4.
  2. Fjerne PBS fra T175 kolben.
  3. Tilsættes 5 mL af Trypsin-0.05% EDTA og Inkuber i 3-4 min ved 37 ° C.
  4. Indsamle cellerne ved at skylle kolben med 15 mL i cellekulturmedium og overføre suspension i en 50 mL tube.
  5. Centrifugeres celler på 1.200 x g for 8 min ved stuetemperatur, fjerne overskydende medium og resuspenderes i 5 mL i cellekulturmedium.

5. Såning celler i omrører kolben

  1. tilsættes 20 mL i cellekulturmedium til cellesuspension og resuspend.
  2. Tilføje 20 mL cellekulturmedium (w/o celler) i en kolbe på 500 mL magnetomrører.
  3. Tilføje cellerne til vasket microcarrier perler fra trin 3.3 og bland forsigtigt med en 25-mL serologisk pipette.
  4. Overføres perler/celle blandingen til den magnetiske spinner målekolbe.
  5. Skylles 50 mL tube med 10 mL i cellekulturmedium at indsamle de resterende celler.
  6. Tilføje en ekstra 85 mL i cellekulturmedium i spinner kolben og læg det i inkubator natten over ved 37 ° C på en shaker (100 x g, blande interval: 3 min hver 45 min.).
  7. Tilsættes 50 mL i cellekulturmedium (samlet mængde 200 mL) og fortsætte omrøring i yderligere 24 timer ved 37 ° C på en shaker (100 x g, blande interval: 3 min hver 45 min.).
  8. Tilføj farveløs RPMI medium (suppleret med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% L-glutamin, 0,4% i Endothelial celle vækst Medium Supplement Mix og 25 μL af Heparin) indtil 320 mL af det samlede volumen er nået.
  9. Erstatte mediet hver 48 h: fjerne 100 mL af gamle medium og der tilsættes 100 mL frisk suppleres med farveløse RPMI.
  10. Kultur cellerne i 5 til 7 dage. Tiden afhænger af tilstanden sammenløbet af celle-belagte perler.
< p class = "jove_title "> 6. Sammenløbet kontrol

  1. indsamle 200 μl af celle-belagte perler ved hjælp af en pipette og overføre dem til en polypropylen tube.
  2. Vaske perlerne 3 gange med 600 μl af PBS 1 x (tilføje PBS, tilt rør og bland forsigtigt at undgå detachment af cellerne, vente perler for at slå sig ned, kassere PBS og gentag).
  3. Lave perler i 10 min ved at tilføje 200 μl af parapicric syre.
  4. Vask 3 gange med 600 μl af PBS 1 x.
  5. Tilføje DAPI fortyndes i PBS 1 x og inkuberes i 10 min.
  6. Overføre perler i et glas dias og dækglas bruger glycerol baseret montering medium.
  7. Visualisere perler under en Konfokal mikroskop.

7. Eksperimentel Procedure

  1. fjerne de celle-belagte perler fra magnetomrører kolben (procedurer ikke behøver at være gjort under sterile forhold) med en 10-mL serologisk pipette og overføre dem til 12 mL runde-bunden polypropylen rør.
  2. Lad perlerne bundfælde sig (omkring 1-2 min.) og fjerne overskydende medium.
  3. Tilføje flere perler til rør, indtil hver tube indeholder præcis 2 mL af perler.
  4. Tilføje 5 mL klar RPMI til hver tube og bland omhyggeligt ved hjælp af en 10-mL serologisk pipette.
  5. Lad perlerne slå sig ned og fjerne overskydende medium.
  6. Gentage proceduren vask en gang med RPMI og fjerner alle overskydende medium.

8. Inkubering med Non-antikoaguleret blod

  1. forsigtigt og langsomt (ved hjælp af hverken jet eller vacutainere) trække blod fra en sund frivillige og samle det i 9 mL neutral polypropylen rør (ingen antikoagulans).
  2. Overføres langsomt 8 mL af blod med en 10-mL serologisk pipette til hver af polypropylen rør indeholdende 2 mL af celle-belagte perler (det samlede rumfang bliver 10 mL). Altid undgå hårdhændet behandling af blod eller perler til at undgå for tidlig EF aktivering. Proceduren tager 1-2 min.
  3. Omhyggeligt vippe blod/perle blandingen for at sikre lige blanding og forsegle fælles landbrugspolitik med paraffin film.
  4. Der rør på et vandret vippe bordet (med blid vippe indstillinger kun) inde i et 37 ° C inkubator og post størkning tider.
    1. Med faste tidsintervaller, fx efter 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, fjerne mindst 1,5-2 mL blod-perle blanding for serum eller plasma analyse.
      Bemærk: for 6 gang punkter foreslår vi at have mere end 3 gange inden for en gruppe af celler, som udtagning af blodprøve vil ske i forskellige rør.
    2. Til samling af serum, forlader blodet til at størkne. For at indsamle plasma, tilføje EDTA eller citrat til 2 mL rør før du tilføjer blodprøver.
    3. Gemme rør på is, centrifugeres ved 2.500 x g i 10 min. ved 4 ° C og gemme serum/plasma ved 80 ° C indtil brug.
      Bemærk: Oplysninger om materialer leveres i Tabel af materialer

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter 7-10 dage af kultur i spinner kolbe (figur 1) var cellerne sammenflydende, der dækker hele overfladen af microcarrier perler (figur 2). Verifikation af den confluency stat er et vigtigt skridt, fordi en ikke-sammenflydende éncellelag af EF på microbeads vil føre til et markant fald i koagulationstid, i betragtning af microcarrier perler overflade er stærkt Pro koagulant (koagulation tid: 4 ± 1 min) ( Figur 3).

Et andet vigtigt punkt, som kræver opmærksomhed, er hastigheden af vippe pladen. En høj vippe hastighed vil forbedre blodpropper. En forlængelse af koagulationstid kunne konstateres, hvis en éncellelag af EF var til stede på overfladen af microcarrier perler. Brug af GalTKO/hCD46/hTBM transgene PAEC viste en betydelig stigning i koagulationstid i forhold til WT PAEC (figur 3). Fravær af Gal-α-1,3-Gal xenoantigen på PAEC (GalTKO) viste en stigning i koagulation tid (25 ± 8 min til PAEC WT) og 68 ± 30 min for PAEC GalTKO. En anden stærk stigning i koagulation tid blev observeret, når PAEC GalTKO/hCD46/hTBM var til stede på microcarrier perler (205 ± 32 min), hvilket tyder på en vellykket graduering af både supplement (hCD46) og koagulation systemer (hTBM). I slutningen af forsøget er defineret, når en synlig blodprop er dannet. Variation inden for prøver af den samme gruppe skyldes både til inter assay-variation og bloddonor. Hvert eksperiment havde 3 gange og hver gang en anden bloddonor blev brugt til at øge pålideligheden af dataene. For hver donor, blev blod analyse (trombocyttallet, WBC, RBC, HCT og andre parametre) udført af eksterne healthcare laboratorier. Resultaterne vist i figur 3 er fremstillet af forskellige eksperimenter udført med forskellige bloddonorer.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af Microcarrier-baseret analysen. (A) EF er udvidet i T175 kolber og (B) overføres til spinner flasker med kollagen-belagt microcarrier perler. (C) frisk ikke-antikoaguleret blod er indsamlet fra sunde frivillig, (D) blandes med EF-belagt microcarrier perler, og inkuberes ved 37 ° C. Udtrykket "ikke-antikoaguleret blod" betyder, at blodet ikke er blevet behandlet med eventuelle antikoagulans. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: immunofluorescens farvning på EF-belagt Microcarrier perler. Microcarrier perler blev hentet og farvet for CD31 (PECAM-1) til at vurdere confluency. Atomkerner var farvet i blå (DAPI) og CD31 var plettet med rødt (Cy3). Skalalinjen: 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: størkning tider med forskellige EF. Blodpropper gange blev bestemt visuelt og slutningen af forsøget var defineret, når en synlig blodprop blev observeret. En stærk prokoagulant effekt blev observeret, når ikke-EF-belagt microcarrier perler blev udsat for hele ikke-antikoaguleret blod. Fravær af Gal-α-1,3-Gal xenoantigen på PAEC (GalTKO) viste en stigning i koagulation tid (25 ± 8 min til PAEC WT) og 68 ± 30 min for PAEC GalTKO. En yderligere stigning i koagulation tid blev observeret, når PAEC GalTKO/hCD46/hTBM var til stede på microcarrier perler, hvilket tyder på en vellykket graduering af både supplement (hCD46) og koagulation systemer (hTBM). Data er vist som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske analyser er udført ved hjælp af ANOVA for flere sammenligninger med Bonferroni korrektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Modellen præsenteres her er velegnet til koagulation relaterede undersøgelser giver mulighed for analyse af forskellige aspekter af koagulation og dens samspil med EF. 8 i xenotransplantation forskning, det er et nyttigt system til at teste de antikoagulerende egenskaber af forskellige genmanipulerede svin ECs efter inkubation med humant blod 9.

De mest kritiske trin i protokollen er dem at sikre komplet celle dækning (confluency) af microbeads før du starter eksperimentet og dem vedrørende omhyggelig indsamling og håndtering af den ikke-antikoaguleret blod at undgå for tidlig trombocyt aktivering på grund af høj shear stress, som kan opstå, hvis vacutainere bruges til at indsamle blod. 10 alligevel dette system har nogle begrænsninger, herunder manglen på et recirkulerende lukket system og fravær af fysiologiske shear stress, som ønsker bedre repræsenterer i vivo betingelser.

Trods disse begrænsninger beskrevet model tilbyder betydelige fordele over aktuelt eksisterende modeller. På grund af brugen af microcarrier perler, er EF overfladen til blod volumen ratio steget, giver mulighed for oprettelse af antikoagulerende og anti-inflammatoriske og brug af ikke-antikoaguleret blod. I aktuelle fladskærms-seng celle kultur modeller, er det ikke muligt og mekanismer, som inddrager blodpropper skyldes EF aktivering derfor kræver ofte brug af dyreforsøg. Dette kan delvis undgås, ved hjælp af den beskrevne microcarrier perle model.

Desuden, dette system giver mulighed for et bredt spektrum af programmer. Dens alsidighed er bosat i mulighed for at teste forskellige stoffer eller stoffer, som ikke kun vedrører (xeno-) transplantation, men også til menneskelige sygdomme. Virkningerne af narkotika på endotelet og koagulation system kan vurderes nemt ved immunfluorescens, ELISA og multiplex suspension array analyse. Dette skete tidligere i en undersøgelse af virkningen af transgene udtryk for menneskelige thrombomodulin i xenotransplantation omgivelser. 11

En eventuel ændring af den beskrevne metode kunne være indsamling af ikke-antikoaguleret blod direkte i rør, som er fyldt tidligere med celle-belagte perler for at reducere luft-kontakt og blod aktivering ved hjælp af en pipette. Brugen af menneskelige aorta endotelceller (hvis) kan være en interessant kontrol og er allerede indarbejdet i fremtidige planer. Argon topping af rørene kan anvendes til at mindske kontakten mellem ikke-antikoaguleret blod med luft, som er kendt for at føre til at kontakte aktivering af de blodpropper kaskade. Hvis blod er tegnet for hurtigt, for eksempel ved hjælp af støvsuges rør med gummi stopcocks og indføre blod ind i røret i en fin stråle, derefter blodplader blive aktiveret og koagulation vil ske før. For at undgå trombocyt aktivering, bruge store diameter kanyler (21ɢ - 16ɢ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af den schweiziske National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). Forfatterne takke Dr. Benoît Werlen for at give Biosilon microcarrier perler. Vi takker også Prof. Hans Peter Kohler og Prof. André Haeberli hjælp til opsætning af microcarrier perle model.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
Vurdering af de antikoagulerende og anti-inflammatoriske egenskaber i Endothelial celler ved hjælp af 3D cellekultur og ikke-antikoaguleret blod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter