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Medicine

Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

Se presenta un modelo en vitro que permite el estudio y análisis de la coagulación en sangre no anticoagulada todo. Anticoagulación en el sistema depende el efecto de anticoagulación natural de las células endoteliales sanas y activación de células endoteliales resultará en la coagulación.

Abstract

In vivo, las células endoteliales son cruciales para la anticoagulación natural de sangre circulante. En consecuencia, activación de la célula endotelial conduce a la coagulación de la sangre. Este fenómeno se observa en muchas situaciones clínicas, como el trasplante de órganos en presencia de formados anticuerpos de anti-donantes, como xenotrasplante, así como en la isquemia/reperfusión. Con el fin de reducir la experimentación animal según el 3R estándares (reducción, reemplazo y refinamiento), en vitro modelos para estudiar el efecto de la célula endotelial, activación de la coagulación de la sangre sería muy deseable. Sin embargo, sistemas comunes de plano de la cultura de célula endotelial ofrecen una relación superficie a volumen de 1-5 cm2 de endotelio por mL de sangre, que no es suficiente para la anticoagulación natural, mediada por el endotelio. Cultivo de células endoteliales en la cuenta de la potencia puede aumentar la relación superficie-volumen 40-160 cm2/ml. Este ratio mayor es suficiente para asegurar la anticoagulación "natural" de sangre, por lo que puede evitarse el uso de anticoagulantes. Aquí se describe para estudiar los efectos de la modificación genética de las células endoteliales porcinas en coagulación de la sangre no anticoagulada todo, un en vitro potencia-sistema basado. En el análisis descrito, células endothelial aórticas porcinas primarias, ya sea tipo salvaje (WT) o transgénicos para humanos CD46 y trombomodulina, crecido en granos de potencia y luego expuesto a sangre humana recién extraída sin anticoagulante. Este modelo permite la medición y cuantificación de la liberación de citoquinas y activación marcadores de complemento y coagulación en el plasma sanguíneo. Además, la proyección de imagen de células endoteliales activadas y la deposición de inmunoglobulinas, complemento y coagulación de proteínas en los granos endotelizados fueron realizadas por microscopia confocal. Este ensayo también puede utilizarse para probar fármacos que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. Encima de su potencial para reducir el número de animales utilizados para tales investigaciones, el ensayo descrito es fácil de realizar y consistentemente reproducible.

Introduction

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El endotelio vascular consiste en una monocapa de células endoteliales (CE) que recubren el lumen de los vasos sanguíneos. En un estado fisiológico, CE quieto son responsables por el mantenimiento de un entorno antiinflamatorio y anticoagulante. 1 esto es mediado por la expresión de anticoagulantes y antiinflamatorias proteínas en la superficie de la CE. Por ejemplo, activación de CE causada por isquemia/reperfusión lesiones o rechazo vascular (xeno-) trasplantados resultados de órganos en un cambio de la superficie endotelial de un anticoagulante y antiinflamatorio estado Pro coagulante y pro-inflamatoria Estado. 1

Para estudiar la fascinante y compleja interacción entre los factores del endotelio y coagulación, en vitro modelos que imitan como posible la situación en vivo son altamente deseables. Una limitación común que caracteriza a ensayos de coagulación convencional en vitro es el uso de sangre con anticoagulante que hace que el análisis de los efectos de la coagulación mediada por ardua y no se puede reproducir incluso recalcificación de la sangre entera citratado resultados obtenibles con sangre fresca sin anticoagulante. 2 además, en los sistemas de cultivo celular de plano tradicional es imposible explotar las propiedades anticoagulantes del endotelio como una suficiente superficie de la célula endotelial por el volumen de sangre no se puede llegar. El modelo presentado aquí supera estas limitaciones por CE el cultivo en la superficie de los granos de la potencia esférica, de modo que una proporción de superficie a sangre CE de > 16 cm2/ml puede ser alcanzado, que es similar a la situación en las pequeñas arteriolas o venas, y que fue descrito para ser suficiente para permitir la "natural" anticoagulación de la sangre por la superficie de la CE. 3 , 4 puede utilizarse sangre entera sin agregado anticoagulantes en este contexto. Muestras de sangre se pueden recoger durante el experimento y citoquinas, factores de coagulación y marcadores de la activación de complemento soluble pueden ser detectados y cuantificados. Además, granos recubiertos de CE potencia pueden analizarse para la deposición del complemento y de inmunoglobulinas así como la expresión de marcadores de activación de CE por microscopia confocal. Otra aplicación interesante incluye la prueba de drogas que se suponen para evitar la coagulación y, por tanto, la activación endotelial de la célula. 5 aunque este modelo no puede sustituir completamente los experimentos con animales, ofrece un método para probar hipótesis funcionales específicas ex vivo con células y reducir así el número de animales utilizados en investigación básica en isquemia/reperfusión trasplante de la lesión o (xeno).

El modelo descrito fue utilizado para imitar un xenotrasplante en que células endoteliales aórticas porcinas (PAEC) son cultivadas en los granos de potencia y se incubaron con todo, no anticoagulada sangre humana. Se analizaron diferentes PAEC transgénico, portadores de varios genes humanos como CD46 para la regulación del sistema del complemento o trombomodulina (hTBM) para la regulación del sistema de coagulación, por sus propiedades anticoagulantes. Sistemas de activación de complemento y coagulación de células endoteliales bien controlados y conectadas entre sí. 6 por lo tanto es importante entender cómo se comportan las células transgénicas diferentes tras la exposición a sangre humana con respecto a la expresión de la molécula de adhesión y liberación de citoquinas, vertimiento del glicocálix y pérdida de proteínas anticoagulantes. 7

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Protocol

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se utilizaron cerdos Landrace alemán (tipo salvaje criado en una granja local y transgénico criados en el Instituto de reproducción Animal Molecular y biotecnología, Universidad Ludwig-Maximilian, Munich, Alemania), peso entre 30 kg a 40 kg, en Este estudio. Todos los animales fueron alojados bajo condiciones estándar con alimentos y agua ad lib. Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a la ley de animales de Reino Unido (procedimientos científicos) y la guía de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, así como la ley de protección animal Suiza. Todos los estudios en animales el cumplimiento de las directrices de llegar. El Comité de experimentación animal del servicio veterinario cantonal (Cantón de Berna, Suiza) aprobó todos los procedimientos animales, permiso no. BE70/14. Protocolos experimentales fueron refinados según los principios de las 3R y estado de la técnica anestesia y manejo del dolor fueron utilizados para minimizar el número de animales y reducir la exposición de los animales al estrés y el dolor durante los experimentos.

se extrae sangre de individuos sanos por venopunción sistema cerrado acuerdo con Suiza pautas de competencia y ética del Hospital Universitario de Berna. La frase " sangre sin anticoagulante " significa que la sangre no haya sido tratada con cualquier anticoagulante.

los siguientes pasos se realizan bajo condiciones estériles. Familiaridad con técnica estéril de la cultura de célula básica es necesario.

1. aislamiento de PAEC

Nota: se obtuvieron segmentos de aorta torácica de 6 a 10 cm de sacrificaron cerdos Landrace alemán de 3 a 6 meses de edad (para otros experimentos en vivo) e inmediatamente transferido a una botella de vidrio de 500 mL que contiene medio de transporte (DMEM + 1% de penicilina/estreptomicina).

  1. Pre-recubrir una placa de 6 pozos con fibronectina 12.5 μg/mL en PBS 1 x y colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 1 h.
  2. Caliente previamente estéril PBS 1 x y la célula cultura medio (DMEM).
  3. Sacar la aorta porcina de medio de transporte.
  4. Coloque la aorta en una placa de poliestireno.
  5. Lavar con PBS caliente suavemente antemano.
  6. Cortar la aorta longitudinalmente y fijarla con agujas de.
  7. Agregar medio de cultivo celular caliente en la superficie del recipiente interno.
  8. Aspirar el medio de cultivo celular de fibronectina y agregar medio de cultivo de células frescas (DMEM suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 0.4% de endotelial célula crecimiento medio suplemento Mix).
  9. Empapar una torunda de algodón en el medio de cultivo celular. El capullo de algodón en la parte superior de la superficie del recipiente interno de pads suavemente y poco a poco en la misma dirección.
  10. Frotar las células en un pozo de placa de 6 pozos ronda por ronda.
  11. Lo mismo para el resto de los pozos de.
  12. Verificar las células bajo el microscopio y coloque la placa de 6 pozos en incubadora a 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Cambiar el medio en el segundo día y cambiarla otra vez cada 2-3 días.
  14. Cuando las células van a ser confluentes, trypsinize células y semilla en un frasco de T75 (PAEC P1).

2. Caracterización de PAEC

  1. la capa de un pozo de 8 chamberslide con fibronectina 12.5 μg/mL en PBS 1 x y colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 1 h.
  2. Semilla de 5 x 10 4 células/pocillo e incubar durante la noche en la incubadora a 37 ° C.
  3. Lavan las células dos veces con PBS ++ (PBS suplementado con CaCl 2 y MgCl 2), 300 μL/pocillo.
  4. Fijar las células con paraformaldehido 3,7% por 10 min a temperatura ambiente, 200 μL/pocillo.
  5. Lavar las células 3 veces con PBS ++, 300 μL/pocillo.
  6. Añadir 300 μL de PBS 1 x-3_% BSA (solución amortiguadora de bloqueo) y dejar 30 min a temperatura ambiente.
  7. Aplicar anticuerpos primarios (anti-VE-cadherina, anti-CD31, anti-vWF) diluidos en detergente 1x-1%BSA-0.05% de PBS, 160 μL/pocillo e incubar 1 h a temperatura ambiente.
  8. Lave 3 veces con PBS ++ (200 μL/pocillo).
  9. Aplicar anticuerpos secundarios y DAPI diluida en detergente 1x-1%BSA-0.05% de PBS, 160 μL/pocillo e incubar 1 h a temperatura ambiente.
  10. Lave 3 veces con PBS ++ (200 μL/pocillo).
  11. Montaje de diapositivas con medio de montaje en base de glicerol y verificar la expresión de marcadores de células endoteliales bajo un microscopio de fluorescencia.
    Nota: Se llega a células endoteliales aórticas porcinas cultura en un matraz T175 (DMEM glucosa baja medio + 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1% y 0,4% de células endoteliales crecimiento medio suplemento mezcla) hasta 90% de confluencia. (siembra células de densidad 1 x 10 6, 90% de confluencia corresponden aproximadamente a 5 x 10 6 células).

3. Capa de los granos de la potencia de

  1. 7 mL de granos de la potencia de la mezcla con 42 mL de solución de colágeno en un tubo de 50 mL (100 μg/mL, diluida en una solución de ácido acético del 0,2%) e incubar 1 h a temperatura ambiente.
  2. Lavar granos dos veces con 25 mL de pH 7.4 de PBS (añadir 25 mL de PBS, mezclar bien con la pipeta y espere hasta que los granos se colocan hacia abajo entonces descarte el sobrenadante y repetir) y una vez con 25 mL de medio DMEM.
  3. Cubierta de los granos en el tubo de 50 mL con 10mL de medio 199 suplementado con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1%, 1% L-glutamina, 0.4% de células endoteliales crecimiento medio suplemento mezcla y 25 μL de heparina (5000 UI/mL) y permite equilibrar durante 10 min. antes de cualquier uso.

4. Recolección de células

  1. Retire el medio de cultivo celular del frasco de T175 conteniendo PAEC y añadir 5 mL de pH PBS 7.4.
  2. PBS Retire del frasco T175.
  3. Añadir 5 mL de EDTA Trypsin-0.05% e incubar durante 3-4 minutos a 37 ° C.
  4. Recoger las células enjuagando el frasco con 15 mL de medio de cultivo celular y transferir la suspensión en un tubo de 50 mL.
  5. Centrifugar las células a 1.200 x g por 8 min a temperatura ambiente, quitar exceso medio y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo celular.

5. Siembra de células en el matraz de agitador

  1. Añadir 20 mL de medio de cultivo celular para la suspensión de células y resuspender.
  2. Añadir 20 mL medio de cultivo celular (sin células) en el matraz de agitador magnético 500 mL.
  3. Añadir las células a los granos lavados potencia de paso 3.3 y mezclar cuidadosamente con una pipeta serológica de 25 mL.
  4. Transferencia de la mezcla de granos de la célula en la cubeta magnética spinner.
  5. Enjuague el tubo de 50 mL con 10 mL de medio de cultivo celular para recoger las células restantes.
  6. Agregar un adicional 85 mL de medio de cultivo celular en el matraz de spinner y colóquelo en la incubadora durante la noche a 37 ° C en un agitador (100 x g, mezcla de intervalo: 3 min cada 45 min).
  7. Añadir 50 mL de medio de cultivo celular (volumen total 200 mL) y continuar la agitación adicional 24 h a 37 ° C en un agitador (100 x g, mezcla de intervalo: 3 min cada 45 min).
  8. Agregar medio descolorido de RPMI (suplementado con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1%, 1% L-glutamina, 0.4% de células endoteliales crecimiento medio suplemento mezcla y 25 μL de heparina) hasta 320 mL de volumen total.
  9. Cambiar el medio cada 48 h: quitar 100 mL de medio viejo y añadir 100 mL de fresco RPMI incoloro suplido.
  10. Las células de cultivo durante 5 a 7 días. El tiempo depende del estado de la confluencia de los granos recubiertos de celular.
< clase p = "jove_title "> 6. Verificación de confluencia

  1. recoger 200 μL de granos recubiertos de células con una pipeta y transferirlos a un tubo de polipropileno.
  2. Lave los granos 3 veces con 600 μL de PBS 1 x (Añadir PBS, incline el tubo y mezcle suavemente para evitar el desprendimiento de las células, espere los granos para establecerse, descartar el PBS y repetir).
  3. Fijar los granos durante 10 min mediante la adición de 200 μL de ácido parapicric.
  4. Lavar 3 veces con 600 μL de PBS 1 x.
  5. Añadir DAPI diluido en PBS 1 x y se incuba durante 10 minutos
  6. Transferencia de los granos en un portaobjetos de vidrio y se aplica un cubreobjetos usando glicerol base montaje medio.
  7. Visualizar las cuentas debajo de un microscopio confocal.

7. Procedimiento experimental

  1. Quite los granos recubiertos por células del frasco agitador magnético (procedimientos no debe hacerse en condiciones estériles) con una pipeta serológica de 10 mL y transferir a tubos de polipropileno de fondo redondo de 12 mL.
  2. Deja los granos colocan abajo (alrededor 1-2 min) y quitar exceso medio.
  3. Añadir más cuentas a los tubos hasta que cada tubo contiene exactamente 2 mL de granos de.
  4. Añada 5 mL RPMI claro a cada tubo y mezclar cuidadosamente con una pipeta serológica de 10 mL.
  5. Deja los granos colocan abajo y quitar exceso medio.
  6. Repetir el procedimiento de lavado una vez más con RPMI y quitar todo exceso medio.

8. Incubación con sangre sin anticoagulante

  1. lenta y cuidadosamente (con jet ni vacutainers) extraer la sangre de un voluntario sano y recoger en tubos polipropileno neutro (sin anticoagulante) con 9 mL.
  2. Transferir lentamente 8 mL de sangre con una pipeta serológica de 10 mL en cada uno de los tubos de polipropileno que contiene 2 mL de granos recubiertos de células (el volumen total será de 10 mL). Siempre Evite el manejo brusco de sangre o granos para evitar la activación prematura de la CE. El procedimiento toma 1-2 minutos
  3. Incline con cuidado la mezcla de sangre/grano para asegurar una mezcla igual y selle la tapa con la película de parafina.
  4. Colocar los tubos sobre una mesa giratoria horizontal (con suave inclinación los ajustes únicamente) dentro de una incubadora de 37 ° C y el registro de tiempos de coagulación.
    1. a intervalos de tiempo, por ejemplo, después de 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, quitar al menos 1.5-2 mL de la mezcla de grano de sangre para análisis de suero o plasma de.
      Nota: para 6 puntos de tiempo sugerimos tener más de 3 repeticiones dentro de un grupo de células, como la toma de muestras de sangre se realizará en diferentes tubos.
    2. Para la recogida de suero, dejar la sangre a coagular. Para recoger el plasma, añadir EDTA o citrato a tubos con 2 mL antes de agregar las muestras de sangre.
    3. Almacenar los tubos en hielo, centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a 4 ° C y almacenar suero o plasma a 80 ° C hasta su uso.
      Nota: Detalles en los materiales son proporcionados en la Tabla de materiales

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Representative Results

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Después de 7-10 días de cultivo en el matraz de spinner (figura 1) las células eran confluentes, cubriendo toda la superficie de los granos de potencia (figura 2). Verificación del estado confluency es un paso importante porque una monocapa no confluentes de CE de los microbeads conducirá a una disminución marcada en el tiempo de coagulación, dada la potencia superficie de granos de la es fuertemente Pro coagulante (tiempo de coagulación: ± 4 min 1) ( Figura 3).

Otro punto importante que requiere atención es la velocidad de la placa basculante. Una inclinación de alta velocidad mejorará la coagulación de la sangre. Se observó una prolongación del tiempo de coagulación si fue de una monocapa de CE presentes en la superficie de los granos de la potencia. El uso de GalTKO/hCD46/hTBM PAEC transgénico mostró un aumento significativo en el tiempo de coagulación en comparación con el WT PAEC (figura 3). La ausencia de la xenoantigen Gal-α-1, 3-Gal en el PAEC (GalTKO) mostró un aumento en la coagulación de tiempo (25 ± 8 min para WT PAEC) y 68 ± 30 min para GalTKO PAEC. Otro fuerte aumento en el tiempo de coagulación se observó cuando estaban presentes en granos de potencia PAEC GalTKO/hCD46/hTBM (205 ± 32 min), que sugiere una modulación acertada de los sistemas de coagulación (hTBM) y complemento (hCD46). Al final del experimento se define cuando se forma un coágulo visible. La variabilidad dentro de muestras del mismo grupo es debido tanto a variabilidad de la prueba y el donante de sangre. Cada experimento tuvo 3 repeticiones y cada vez a diferentes donantes de sangre se utilizó para aumentar la confiabilidad de los datos. Para cada donante, se realizó un análisis de sangre (conteo de plaquetas, WBC, RBC, HCT y otros parámetros) por laboratorios externos de salud. Los resultados que se muestran en la figura 3 se obtienen de diferentes experimentos llevados a cabo con los donantes de sangre diferentes.

Figure 1
Figura 1: representación esquemática de la prueba de potencia. (A) CE se expanden en frascos T175 y (B) transferir en frascos de spinner con perlas recubiertas de colágeno potencia. (C) sangre fresca sin anticoagulante se obtiene de un voluntario sano, (D) mezclado con los granos recubiertos de CE potencia y se incubó a 37 ° C. La frase "la sangre no anticoagulada" significa que la sangre no ha sido tratada con ningún anticoagulante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: tinción de inmunofluorescencia en granos recubiertos de CE potencia. Granos de potencia obtenidos y teñidos para CD31 (PECAM-1) para evaluar la confluencia. Los núcleos fueron teñidos en azul (DAPI) y CD31 fue manchado en rojo (Cy3). Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: coagulación de diferentes CE. Tiempos de coagulación se determinó visualmente y se definió el final del experimento cuando observó un coágulo visible. Se observó un efecto procoagulante fuerte cuando potencia CE no-revestido granos fueron expuestos a la sangre humana entera no anticoagulados. La ausencia de la xenoantigen Gal-α-1, 3-Gal en el PAEC (GalTKO) mostró un aumento en la coagulación de tiempo (25 ± 8 min para WT PAEC) y 68 ± 30 min para GalTKO PAEC. Un aumento posterior en el tiempo de coagulación se observó cuando PAEC GalTKO/hCD46/hTBM estaban presentes en granos de potencia, lo que sugiere una modulación acertada de los sistemas de coagulación (hTBM) y complemento (hCD46). Datos se muestran como media ± desviación estándar. Análisis estadístico se ha realizado utilizando ANOVA para comparaciones múltiples con corrección de Bonferroni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El modelo presentado aquí es conveniente para la coagulación relacionados con estudios, que permite el análisis de diferentes aspectos de la coagulación y su interacción con EC. 8 en la investigación del xenotransplantation, es un sistema útil para probar las propiedades anticoagulantes de la ECs porcinos genéticamente diferentes después de la incubación con sangre humana 9.

Los pasos más críticos del protocolo son los asegurar cobertura completa de la célula (confluencia) de los microbeads antes de comenzar el experimento y los pertenecientes a la colección de cuidado y manejo de la sangre no anticoagulada para evitar prematuros activación de las plaquetas debido a la alta tensión de esquileo, que puede ocurrir si vacutainers se utilizan para recoger la sangre. 10 sin embargo, este sistema tiene algunas limitaciones, incluyendo la ausencia de un sistema cerrado de recirculación y la ausencia de tensión de esquileo fisiológica que mejor representan las condiciones en vivo .

A pesar de estas limitaciones, el modelo descrito ofrece ventajas importantes sobre actualmente existentes modelos. Debido al uso de granos de la potencia, se aumenta la superficie de la CE al cociente del volumen de sangre, permitiendo el establecimiento del entorno anticoagulante y antiinflamatorio y uso de sangre no anticoagulada. En modelos actuales de cama plana de la célula cultura, esto no es posible y mecanismos que implican la coagulación de la sangre debido a la activación de la CE, por tanto, a menudo requieren el uso de la experimentación animal. En parte, esto puede evitarse usando el modelo de grano potencia descrito.

Además, este sistema permite un amplio espectro de aplicaciones. Su versatilidad reside en la posibilidad de probar diferentes fármacos o compuestos que son no sólo trasplante relacionados con (xeno-) sino también a humanas enfermedades. Los efectos de las drogas en el endotelio y en el sistema de coagulación pueden evaluarse fácilmente por inmunofluorescencia, ELISA y análisis de matriz múltiplex de la suspensión. Esto fue hecha previamente en un estudio sobre el efecto de la expresión transgénica de trombomodulina humana en un entorno de xenotrasplante. 11

Una posible modificación del método descrito podría ser la colección de sangre no anticoagulada directamente en tubos que se llenan previamente los granos recubiertos de células con el fin de reducir la activación del contacto del aire y la sangre mediante el uso de la pipeta. El uso de las células endoteliales aórticas humanas (HAEC) puede ser un control interesante y ya se incorpora en planes para el futuro. Relleno de argón de los tubos podría utilizarse para reducir el contacto de la sangre no anticoagulada con aire, que se sabe para llevar en contacto con la activación de la cascada de coagulación. Si la sangre se extrae demasiado rápido, por ejemplo usando tubos de aspirado con llaves de paso de goma y introducir sangre en el tubo con un chorro fino, entonces se activan las plaquetas y la coagulación se producirá más pronto. Para evitar la activación de las plaquetas, uso de agujas hipodérmicas de diámetro grande (21ɢ - 16ɢ).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la Fundación Suiza de ciencia nacional (FNS, Grant No. 320030_156193). Los autores agradecen a Dr. Benoît Werlen para proporcionar los granos de potencia Biosilon. También agradecemos el Prof. Hans Peter Kohler y Prof. André Haeberli ayuda para configurar el modelo de grano potencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
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  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
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  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada
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Cite this Article

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

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