Summary
ミエリンオリゴデンドロ サイトは、迅速な活動電位伝搬と神経細胞の生存を促進します。ここで説明した、切片蛍光タンパク質のオリゴデンドロ サイト固有表現のプロトコルです以降のタイムラプス イメージングと脳スライス。さらに、無染色のミエリンを可視化するための簡単な手順が表示されます。
Abstract
神経細胞は、電気絶縁性およびミエリンオリゴデンドロ サイトの栄養サポートに依存します。オリゴデンドロ サイトの重要性にもかかわらず現在ニューロンを研究に使用する高度なツール部分的にしか撮影されているオリゴデンドロ サイトの研究者。セル型固有のウイルスの伝達による染色は、ライブ オルガネラ動態を研究するための有用なアプローチです。本稿での転写の制御の下で対象となるミトコンドリアの蛍光蛋白質遺伝子を運んでいるアデノ随伴ウイルス (AAV) の伝達によって脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリアを可視化するためのプロトコルミエリン塩基性タンパク質のプロモーター。コロナ マウス脳切片切片を作るためのプロトコルが含まれています。[ミトコンドリアのタイムラプス イメージングのための手順に従います。これらのメソッドは、他の細胞器官に転送することができ、特に髄鞘の細胞小器官を調べる場合に役立ちますがあります。最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) による生活のスライスで無染色のミエリンの可視化を容易に利用できる手法について述べる。コアは、余分な機器を必要としないとライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。
Introduction
脳の白質は神経細胞の軸索が髄鞘、オリゴデンドロ サイトによって形成された特殊な拡張プラズマ膜に包まれたので構成されます。髄鞘が高速かつ信頼性の高い活動電位伝搬と有髄軸索の長期的な生存のため必要と髄鞘の損失は、神経機能障害を引き起こす可能性が。その重要性にもかかわらずオリゴデンドロ サイトのプロパティは、あまり知られてに比べニューロンとアストロ サイト。その結果、オリゴデンドロ サイトを勉強の少ないツールを開発されています。
生きるイメージング細胞小器官のミトコンドリア、endoplasmatic 小胞体 (ER) や小胞構造の異なる時間の経過とともに細胞小器官のダイナミックな変化を研究することができます。伝統的に、リビングのオリゴデンドロ サイトのイメージングをモノカルチャー1,2で行った。単作のオリゴデンドロ サイトはコンパクトなミエリンを表示しないし、切片または急性脳スライスが、局在と細胞内小器官の動きを勉強するときにしたがってより良いオプションをことがあります。細胞小器官と髄鞘蛋白の局在は有髄の軸索と周囲の髄鞘の間の短い距離のために挑戦することができます。したがって、光顕微鏡による免疫染色の手順だけでは、有髄軸索のミエリン鞘の細胞小器官とを区別するため空間分解能を持っていません。これは、細胞型-特異的発現プロモーターによって駆動される細胞小器官をターゲットとした蛍光タンパク質の遺伝子をウイルスの伝達によって解決できます。利点は、オルガネラ局在とダイナミクスの正確な評価を可能にする細胞特異とスパース表現です。トランスジェニック動物は、このような細胞小器官をターゲットとしたセル固有の式3を達成するためにも使用できます。しかし、生産やトランスジェニック動物のメンテナンスは高価です、通常ウイルスの方法によって達成することができますスパース表現を提供していません。
記載されているメソッドはここ (MBP 水戸下流か MBP 水戸 GFP) を視覚化するミエリン塩基性タンパク質プロモーターによって駆動されるミトコンドリアをターゲットとした蛍光蛋白質 (下流または緑色蛍光タンパク質 GFP) とオリゴデンドロ サイトのウイルスの伝達を使用します。脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリア。さらに、別の蛍光蛋白質 (GFP 水戸した dsred と併用または水戸 GFP を使用 tdtomato) 細胞質内の式は、髄鞘の細胞コンパートメントを含む細胞形態の可視化を有効にするためです。プロトコルには、脊髄の脳のスライス (・ デ ・ シモーニとゆう、2006年4,5で記述されたプロトコルの修正されたバージョン) を行うための手順が含まれています。我々 はミトコンドリアの動きを研究するためタイムラプス イメージング手順を説明します。この手順は、イメージング メディア、イメージング中に薬やその他の媒体の変更の簡単なアプリケーションを可能にするセットアップの継続的な交流と直立した共焦点顕微鏡を使用します。タイムラプス イメージング手順は、以下のように生活のスライスを維持するためのいくつかの余分な機器と、共焦点顕微鏡で実行できます。プロトコルには、画像を最適化し、毒性を削減するいくつかのヒントも含まれています。
最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) 無染色ミエリンを視覚化するための迅速かつ簡単な方法を説明します。これは、ライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。近年、いくつかのテクニックは、必要な任意の染色することがなくイメージ ミエリンに開発されているが、これらのほとんどは、特定機器と専門知識6,7,8を必要とします。ここで説明する手順ミエリン鞘の反射のプロパティを使用して、分光共焦点の顕微鏡検査の簡略化された単一励起波長バージョン (スコアは、いくつかのレーザーの波長はミエリンを視覚化する結合されます)9. コアは、488 nm レーザーと 470 500 nm バンドパス排出フィルターまたは可変発光フィルター、共焦点顕微鏡で行うことができます。
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Protocol
ここで説明する手順は、ノルウェーの動物研究の権威によって承認されています。サプライヤーおよび消耗品等のカタログ番号必要な機器が、ドキュメントの最後に材料のリストで利用できる
。1。 切片スライス準備
注: このレシピ使用 2 つのマウスの子犬生後 7-9 (p7-9)、2 つの六つの文化料理に分かれて 24 切片スライスをもたらす。無菌フードで特に記述がない限り、すべての手順を行う必要があり、nitril またはラテックスの手袋を使用する必要があります。細胞培養グレードの材料のみを使用する必要があります
。- オートクレーブ ボトル、解剖ツール (1 鉗子、1 の小さな丸いと尖ったスパチュラ 1 大きい平らなヘラ 1 小さなはさみ 1 大規模なシザーは、マテリアルを参照してください詳細についてはリスト)、ガラス ピペット、ピペット チップ、スライスの準備のために使用される組織綿 。
- ガラス ピペットの半分は、大きな開口部を使用する必要があります、狭い端を断つ。
- ダイヤモンド スクライバーとスコアはピペット ガラスが縮小を開始ポイントのすぐ下周り (ある場合) をペンします。ニトリル手袋にまたは類似した、ピペットの先のとがった端を置きます。慎重に作業台を押しながらピペットを曲げることによって先端を断つ 。
- 、砂紙の上をこすることによって切断端を鈍らせるか、ブンゼン バーナーで少し溶けます。壊れたピペットはゴム球になって壊れた端カット脳スライスを転送に使用される、大規模なオープン エンド ソリューション/スライスに触れて
。 注: これは無菌フードでは行われませんし、数日を事前に行うことができます 。
- 培養皿を準備します
。 メモ: スライスする前にまたはスライスする前に少なくとも 2 時間の日をこれすることができます。- 滅菌ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 膜 (" 紙吹雪 ")。2 滅菌鉗子を使用して周囲の青いプラスチックの部分から単一の紙吹雪を削除し、96% のエタノール (エタノール) を含むペトリ皿に 2 回浸漬による消毒します。乾燥滅菌大型ペトリ皿でフラット紙吹雪を置く
。 注: 紙吹雪は、親水性 PTFE 膜文化挿入で膜のようです。シングル スライスすることができます簡単には転送挿入から顕微鏡のセットアップに鉗子で紙吹雪を持ち上げることによって、ライブ イメージング エイズの紙吹雪の使用 (4.8 を参照してください。 詳細については)。また、脳スライスは (あるスライスは直接に添付文化挿入の膜) 紙吹雪なし培養することができます。この場合、膜挿入顕微鏡お風呂にスライスを転送するメスで切ることです 。
- 培養液 1 mL を追加 (試薬のレシピ ' テーブル) 6 ウェル培養皿の各井戸 。
- の場所の 1 つの文化は、滅菌の鉗子を使用して各ウェルに挿入します。挿入と培養液中の気泡を避けるためします
。 注: お金と環境を節約だ文化挿入を再利用することが可能。これは蒸留 H 2 O (dH 2 O) の徹底した洗浄によって行うことができます 70% で再使用まで 24 h 以上のエタノール。新しい文化を準備するとき乾燥 uv (紫外線) 光 15-30 分の下での細胞培養プレートの挿入 - 文化の両側の 2 つ (滅菌・乾燥) 紙吹雪を挿入します。最小限のオーバー ラップを取得するインサートのエッジに向かって紙吹雪を配置します 。
- 5% CO 2 と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターでプレートを配置します 。
- 滅菌ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 膜 (" 紙吹雪 ")。2 滅菌鉗子を使用して周囲の青いプラスチックの部分から単一の紙吹雪を削除し、96% のエタノール (エタノール) を含むペトリ皿に 2 回浸漬による消毒します。乾燥滅菌大型ペトリ皿でフラット紙吹雪を置く
- バブル冷たい解剖中 (試薬のレシピ ' テーブル) bioxide ガス (95% O 2/5%CO 2)。ソリューションを無菌に保つために、ボンベからのチューブを滅菌注射器フィルター (0.22 μ m 孔サイズ) に接続します。
生殖不能の管に
- 注射器のもう一方の端のカップル フィルター滅菌ガラス ピペットに接続。ガラス ピペットをソリューションに配置、パラフィルムでカバー、ガスをつけます。氷の郭清培地を保つ
- 郭清/スライス領域の準備します
。 注: 理想的には、この手順にされるべき無菌フード。これが可能でない場合、vibratome は作業台に残すことが。この場合、髪のネット、顔のマスクを使用することをお勧めします。- シングル エッジかみそりの刃を使用して agarose のゲルの長方形の部分 (約 2 cm × 0.5 cm) をカット (試薬のレシピ ' テーブル)、長い面を vibratome 刃など vibratome の舞台にこれを接着と 。
- をすべてのサーフェスおよび 70% EtOH vibratome パーツ、オートクレーブ組織ワイプで拭いてきれい
。 注: 江藤は、細胞を損傷することができますので、脳組織の接触するすべての部分を完全に乾燥重要だ 。
- 滅菌かみそりの刃を付ける、vibratome と、vibratome にこの機能がある場合の振動チェックを実行します 。
- オートクレーブ組織と共にボンネットの場所オートクレーブ解剖ツール ワイプ、4 つの小さなペトリ皿、丸刃メス、ゴムの電球、2 つ開口ガラス ピペット (pt. 1.1 を参照) との 2 のガラス ピペットとスーパー接着剤 (エタノールを散布). Vibratome ボートと 4 つの小さなペトリ皿に、
- 注ぐバブル解剖中です
。 注: この手順のみすべき解剖前にすぐにこの時点から媒体のバブルまたは氷で保管されていないので
- Dissect とマウント脳
。 メモ: 健全なスライスを取得するには、迅速かつ正確にこの手順を実行する必要があります。いくつかの練習が必要です。- 地域のガイドラインによると首の脱臼により動物 #1 を安楽死させるし、大ばさみを首をはねる 。
- 使用して小さな鋭いはさみ、すぐに鼻に首から矢状切開することによって皮膚を削除し、脇を引く頭蓋骨を明らかにします。
- インテリアの一部、頭骨とラムダ縫合線 (大脳と小脳の間の境界線) の上に横切開に続いて、矢状縫合に沿ってカットします 。
- はそれぞれの側に曲げて開きに鉗子を頭蓋骨を使用します。脳神経は脳から脳の腹側下の丸みを帯びた、鋭いへらを挿入し、ゆっくりヘラを横移動で遮断されています 。
- シングル エッジかみそりの刃を使用して小脳に吻側カット コロナ
。 注: このカット、スライスのカットの角度を決定します。それはしたがって、ストレートの角度ですべきである、です 。
- 郭清媒体を含んでいる小さいペトリ皿に頭蓋骨から脳をフリップします 。
- 繰り返し手順 1.6.1-1.6.4。 動物 #2 および場所のこの 2 番目のペトリネット脳料理。
。 注: 動物は無菌ではないです。フードの片側に解剖を行い、脳が頭蓋骨から削除されているしたら、他のきれいな側に移動します 。
- 手袋を変更します 。
- アタッチ脳 vibratome 舞台: マウントされた agarose のゲルの正面ステージにスーパー接着剤の薄層を追加します。大きな平らなヘラで新鮮なカットで (尾) 脳 #1 側を保持するヘラと腹側に触れる (と中に可能な限り近い) agarose のゲル。
- 鉗子のセットでヘラを押すことによって接着剤に脳をそっと置きます。脳 #2 に十分なスペースを残すようにしてください
。 注: それは脳が過剰な接着剤ではなくステージにも接続されていることが重要これは切断を妨げることができるとします 。
- 鉗子のセットでヘラを押すことによって接着剤に脳をそっと置きます。脳 #2 に十分なスペースを残すようにしてください
- #1 の脳の取り付け後すぐに脳の上に郭清中のいくつかの滴を追加する大きなヘラを使用します。これは脳の潤いを保つが、接着剤硬化し、それが脳の両側にくっつかないようにします 。
- 1.6.7 と 1.6.8 の手順を繰り返します脳 #2. 。
- Vibratome ボートにステージをアタッチします 。
- 230 μ m 厚いコロナのスライスを削減振幅を持つ 1 〜 1.5 ミリメートル、85 Hz の周波数と 0.2 mm の速度/s の約 1.4 mm 吻側と 2.1 mm 前に尾間収集スライス。
- 収集スライス後開口ガラス ピペット (第 1.1) を使用して各スライスをカットされています。スライスを郭清媒体を含んでいるペトリ皿に転送します。2 つの半球に分割、2 つの部分にスライスをカットする丸いメスを使用します 。
- すべてのスライスをカットするときは培養皿にスライスを配置します。
- (一時間) 培養皿を取り出し、インキュベーター 。
- 開口ガラス ピペットを使用して慎重に紙吹雪のそれぞれに 1 つのスライスを転送します
。 メモ: スライスは、紙吹雪の真ん中にきっかり置く必要があります。これには、いくつかのスキルが必要です。ただし、いくつかのスライスが完璧ではない場合は、インキュベーターに、できるだけ早くすべてのスライスを得ることは重要であるそれらを移動しようとして時間を費やすより、それらを残すことをお勧めします 。
- ガラス製ピペット (先のとがった端) を使用して優しくスライスに触れることがなく余分なメディアを削除します
。 メモ: スライス浸るべきでなく液体で孵化中。したがって、余分なメディアは、スライス (媒体の薄膜は、スライスを引き続き) 空気にさらされているように吸気する必要があります。液体に浸漬のままスライスは通常健全なできないか、死ぬ (4 と我々 の観察). - すべての紙吹雪が 1 つのスライスにしたら、インキュベーターに皿を移動します 。
- 手順 1.7.8-1.8.4。 料理 #2. 。
- 培養培地を変更します
。 注: これは、スライス (1 in vitro DIV1 の日) の翌日を行われるべき、2-3 日おき。- 水バスやインキュベーターで培養液を予熱します 。
- 無菌フードを使用し真空吸引や通常のピペット滅菌チップ各ウェルから培地を吸引します。これは、優しく (約 30 度) で料理をチップ、ピペット チップ文化挿入の端に配置することで 。
- は、(媒体で覆われている挿入の下を維持する十分な媒体だけを残して) 各ウェルから約 800 μ L を削除します。その後、きれいなピペットを使用して、各ウェルに予熱媒体の 800 μ L を追加します。細胞文化のインキュベーターに料理を配置します 。
2。ウイルス伝達
10 , 11 を前述のように、興味のプラスミド- 購入または通気します
。 注: このプロトコルの使用を記述する AAV 血清型 2/8 (AAV 2/8) のミトコンドリアを運ぶとして対象とした dsred や GFP ミエリン塩基性タンパク質プロモーター 12 の転写制御の下でレポーターの遺伝子 (AAV2/8 MBP_mito_dsred または AAV2/8 MBP_mito_GFP) オリゴデンドロ サイト ミトコンドリアを視覚化します。AAV 2/8 一般的な CAG プロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子として GFP や tdtomato を運ぶ (AAV 2/8 CAG_GFP または AAV 2/8 CAG_tdtomato) オリゴデンドロ サイト細胞質を可視化するために使用します。したがって、AAV2/8 AAV 2/8 CAG_GFP と MBP_mito_dsred の組み合わせを与える赤のミトコンドリアとオリゴデンドロ サイト、緑細胞質 AAV2/8 MBP_mito_GFP と AAV 2/8 の組み合わせに対し CAG_tdtomato 緑ミトコンドリアと赤い細胞質を与えます。構造体で記述されています詳しくは 13 では別の場所 。
- 日 7 体外 (DIV7)、変換、通気とオリゴデンドロ サイト
。 注意: 通気での作業に関する安全規則に従います。適切な訓練と必要なバイオ セーフティ レベル承認を持っていることを確認します。次のすべての点は、手袋、白衣を使用してクラス II の安全キャビネットで実施されなければなりません。ここでは、AAV のスライスの皮質領域への応用は、これは最高の回復が表示される領域は、説明します。- Dilute 予熱 (37 ° C) で AAV 培。スライス内の単一セルのイメージングを可能にするオリゴデンドロ サイトのまばらな伝達を得るに 2 × 10 9 ゲノム コピー/ml (GC/mL) 中の希釈を推奨します。ただし、異なる抗体を使用してパイロットは特定の実験に適している導入されたオリゴデンドロ サイトの密度を確保するためにされるべき。同じソリューション内混合し、同時にスライスに追加する必要があります 2 つの異なる通気を使用している場合 。
- は、約 1.3 μ L を各スライスの AAV の希釈を追加: ピペット チップの外側が乾燥を確認してください。1.3 μ L をピペット ピペット チップ (約 1 mm の距離) でスライスに触れることがなくできるだけ近くに、野上ピペットを押し AAV を希釈します 。
- は、ピペットからソリューションをゆっくりとプッシュします。ソリューションに触れるスライス、ピペット チップにソリューションを全皮質部領域に広がる皮質の上移動します
。 注: この手順は、必要以上に長くのためのフードからスライスを保つことを避けるためにできるだけ早く行う必要があります。時これを行う 1 つの皿に、インキュベーターに料理 #2 を開始する前に最初の料理を置きます。いくつかの練習と着実に手を必要とする、組織を損傷せずに AAV の良好な分布を取得する 。
- 文化の時間の間に顕微鏡下で皿を配置することによってタンパク質の発現をチェックことができます直立蛍光顕微鏡の細胞の研究室で使用可能な場合します
。 注意: 皿ない保管すべきインキュベーター外 2 5 分以上します 。
3。タイムラプス イメージング
注: 蛍光マーカーの表現のレベルが十分な健康のスライスを見るたびに、イメージングを実行できます (通常 DIV11-14).
- バブル イメージング ソリューションを入力し、お風呂を終了することができますと加熱して、顕微鏡、灌流、ヒーターが正しくセットアップされていることを確認します
。 注: さまざまなソリューションがありますお風呂の部屋。シンプルなバージョンを次に示します。- で - と鈍化注射器針 (~ 45 ° 曲げ) ブル ・ タック/楽しいタックによってバスの側面に接続されているバスのアウトレット 。
- 加熱管ヒーター ユニットのお風呂の入口の注射針を通して、蠕動ポンプを介して継続的にバブル イメージング ・ ソリューションの瓶からチューブが行くことを確認します 。
- は、注射器の針のコンセントに別のチューブを接続します。このチューブは、蠕動性ポンプとボトルのイメージング ソリューション (または廃液ボトル) に戻る行く 。
- バブルのイメージング ソリューション (試薬のレシピ ' テーブル) bioxide ガスと
。 注: この sta である必要があります。rted 少なくとも 15 分前画像に、と実験を通して継続します 。
- ターン蠕動性ポンプとヒーターと最適な浴温度 (37 ± 0.5 ° C) を取得するバスを介して実行ソリューションです。バス ソリューションに温度の単位に接続されている温度計センサーを浸漬することを確認します 。
- 顕微鏡、蛍光ランプと適切なレーザーをオンにします 。 サンプルの
- セットを適切な光パスです
。 注: これは顕微鏡のセットアップとプローブによって異なります。共焦点の顕微鏡を使用する方法の一般的な知識が必要ですし、ここでは扱いません 。
- は、適切な倍率と開口数 (エヌ) 水浸対物レンズを使用します。我々 は、40 x 水浸計画アポクロマート対物レンズ (エヌ 1.0) を使用します 。 時間経過のビデオを約 2-2.5 μ m の光学セクションを達成するために
- オープン ピンホール。これはミトコンドリアのタイムラプス中のピント移動の発生を低減します 。
- お風呂に転送切片スライス:
- 小さなプラスチック シャーレにイメージング ソリューションまたは培養液中のドロップを追加します 。
- 無菌フードの膜から脊髄スライスの 1 つを転送する使用滅菌鉗子挿入ドロップ。紙吹雪とスライスではなく、鉗子がタッチのみ 。
- 、シャーレに蓋を配置します 。
- インキュベーターにスライスの残りの部分を含む培養皿をすぐに置く 。
- スライス顕微鏡を含むもたらすシャーレ 。
- は、顕微鏡お風呂にスライスを転送中蠕動性ポンプの電源を切ります。まず、鉗子を使用して、(紙吹雪が浮かびます) お風呂の上部にシャーレからスライスで紙吹雪を持ち上げます。紙吹雪の各側に鉗子の 2 つのヒントを置いて、スライスに触れることがなく、紙吹雪をタッチし、お風呂の底に解決する紙吹雪をプッシュします。お風呂の真ん中に紙吹雪をセンターします 。
- スライスに触れることがなく、紙吹雪の上にホールド アンカー (ハープ) を配置する使用鉗子
。 注: ハープは、浮いている、またはお風呂で漂流からスライスを防ぐために使用される馬蹄形のプラチナ アンカーです。急性スライス (音楽ハープに似ている) 他にハープの 1 つの側面から薄い文字列を実行します。脊髄スライス、ハープがミサデジタルでき、それがスライスに触れることがなく、紙吹雪の上に置くことができますこのような方法で紙吹雪のサイズに合わせています 。
- 蠕動性ポンプの電源を入れます 。
- サンプルまで目標を下げる 。
- セルとイメージする領域を選択します
。 注: これは細胞毒性を引き起こす可能性があるレーザー光に対する細胞の過剰な露出を避けるため (以下の点のヒントを参照してください)。- 接眼レンズおよび蛍光ランプを使用して正しい表現と健康なオリゴデンドロ サイトを検索します。通常、蛍光タンパク質の強い発現があるオリゴデンドロ サイトは不健康な表示されます。不健康なオリゴデンドロ サイトがメタボールの外観を持つプロセスとミトコンドリア断片化されたが表示されます。健康的なオリゴデンドロ サイトの相馬とプロセス滑らかに表示し、ミトコンドリアは、さまざまな長さを持つ (ただし通常のニューロンとアストロ サイトの 13 , 14 , よりずっと短いです。 15).
- ビューのフィールドの真ん中に興味のセルを配置します 。
- 使用の " ライブ " 画面上のセルを識別し、いくつかの主要なプロセスまたは髄鞘、または単一のプロセスが含まれているセルの一部 など 関心のある分野を選択 (ライカ、ツァイス顕微鏡) のソフトウェアの機能やミエリン鞘
。 注: 可能な限りプロセス/鞘のイメージすることができるするには、比較的レイアウト プロセスを含む領域は x、y 方向のフラットを選択します 。
- 興味の分野でズームイン (通常 0.14 - ピクセル サイズでイメージを作り出す 0.30 μ m) です 。
- 使用の " 地域 " ツール、領域を囲む四角形を描画し、選択した領域だけをスキャンするオプションを選択します。選択した領域のみをスキャンすることによってスキャン時間、およびこうしてレーザ露光が減少します
。 注: 水平方向の四角形領域をスキャンしたラインが必要な数が短いため垂直領域よりも速くスキャンされます。垂直方向の四角形の領域をスキャンすると、スキャン時間がスキャン フィールドを (自由に回転ツールを使用して) 90 度回転させることで減らすことが 。
- ミトコンドリアの良いビューを得るためのレーザー出力の調整とゲイン
。 注: は、必要最小限のレーザー パワーを使用します。可能であれば、レーザー出力の増加よりもむしろゲインを上げます。細胞毒性を引き起こすだけでなく高すぎるレーザー パワーはレーザー パワーのさらなる増加を必要と時間をかけて、イメージ オブジェクトをブリーチまたはスキャンの間に得る。必要なレーザー パワーとゲイン式レベルで顕微鏡によって異なります。LSM700 共焦点の顕微鏡イメージした dsred 20-40 μ の力で 555 nm のレーザーを使用してまたは GFP (レーザパワー測定目的の背面の開口部に) をイメージに 20-30 μ で tdtomato、488 nm レーザーが使用されます。ゲインは GFP の 700-800 と 850-980 下流の tdtomato の範囲で通常ライブ イメージング用高に設定されます。高利得のいくつかより多くのバック グラウンド ノイズ デジタル オフセット (offset 値は通常 0 から 15 の間レイアウト) を増やすことによって削除される原因します。我々 の経験で、MBP_mito_dsred よりも優れた信号ノイズに-を与える MBP_mito_GFP を使用しています 。
- 選択スキャン速度です
。 メモ: 高速スキャン速度を使用して、小さなスキャン領域を描画することによってスキャン時間を最小化 (を参照してくださいポイント 4.10.5 以下)。また、双方向のスキャンを実行することでスキャン時間を保存することが可能です。ただし、これは画質のため推奨されません 。
- セットの頻度と時間経過の記録、キャプチャ画像のオリゴデンドロ サイトでミトコンドリアのイメージングのための 20 分の合計 2 秒ごと など の期間
。 メモ: 興味の目的の移動によるとに頻度と期間を設定する必要があります。高い頻度はより光をレーザーに標本を公開しますが、高速移動物体も必要なコマ撮り動画 (例えば ミトコンドリアより頻繁とミトコンドリアよりもはるかに高い速度で移動するニューロンの合計持続時間が短いオリゴデンドロ サイト、合計 2 分 16 毎秒が通常に作成されます). - コマ撮り録画を開始します
。 注: ミトコンドリアはピント移動や録画中にイメージ化された地域からずれた場合があります。振動や動きを抑える調整とお風呂のアウトレットと必要な場合は、ポンプの速度を減らします。通常まだフォーカスの小さな変化が発生します。したがって、イメージング中に画面の継続的な監視が必要、記録中に、フォーカスの微調整と 。
- セルの将来の識別のため全体のセルの z スタックをキャプチャし、プロセス イメージを作成します
。 注: より良い解像度のピンホールに z スタック 1 風通しの良いユニットをリセットする 。
- オプション: 無染色ミエリンを視覚化します
。 注: でオリゴデンドロ サイト (細胞質) GFP 増殖型、ミエリン鞘通常識別できます (を参照してください 図 2 A および B) プライマリ プロセスに接続されている細胞質 (細胞質尾根) の直線として。ただし、GFP 表現があまりにも弱いまたは細胞質マーカーが使用されていない場合、ここで説明したように、共焦点反射顕微鏡 (コア) 髄鞘を視覚化することが可能です。- 488 でレーザー励起とソフトウェアの新しい光パスを設定、例えば 同じ波長の周り nm と放出されるキャプチャ光 470 500 nm 。
- 調整レーザ出力と髄鞘が表示されるまでを得る (の例を参照してください < 強いクラス ="xfig"> 図 3)。LSM 510 メタ顕微鏡を使用して、我々 は通常 7 12 μ (目的の背面の開口部で測定) のレーザー出力を使用します 。
- オプション: 免疫染色のスライスの準備。
- 免疫染色後イメージの細胞を識別する必要がある場合は、セルの低倍率イメージ (10 倍) をキャプチャし、矢印を描画することによって、イメージ内での位置を示すまたは類似。セルの検出を支援するためにもマニュアル全体のスライスは、セルの位置を示す地図を描画することは勧めします 。
- 修正プログラム スライス 4% パラホルムアルデヒド (PFA) シェーカーの室温で 1 時間
。 注意: PFA は、有害です。防護服を使用し、換気フードにのみ使用します 。
- 定着剤を 1:10 PBS で希釈し、免疫も 17 を開始するまで 4 ° C のまま
。 メモ: スライスは、数週間の希釈液で残すこともできます、蛍光が衰退します。免疫組織化学固定の 10 日以内に実行することをお勧めします 。
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Representative Results
脊髄脳スライス培養され、上記のように導入は、mito_dsred と GFP を表現する皮質のオリゴデンドロ サイトの疎な分布を示した。Olig2 および MBP 抗体で免疫染色式がオリゴデンドロ サイト (図 1) に固有であることを確認しました。
ライブ イメージングのため導入されたオリゴデンドロ サイトは並行 (図 1および図 2 a) を実行しているいくつかのミエリン鞘の彼らの特徴的な形態によって認識されました。導入されたオリゴデンドロ サイトのタイムラプス イメージングを実行すると、プライマリ プロセスとミエリン鞘 (図 2 b-D) 内のミトコンドリアの動きを監視することが可能です。
低の GFP 発現細胞、髄鞘が 488 でサンプルの照明によってライブ イメージング中に識別でした nm、出力をキャプチャ光 470 500 nm (図 3 a)。この共焦点反射顕微鏡 (コア) の手法も取り組んだ固定 PFA と immunostained 組織がミエリン鞘登場調光器 (図 3B-C)。ミエリン塩基性タンパク質 (MBP) に対する抗体を用いた免疫染色で分かった敷設ミエリン鞘の 100% に近い水平方向 (矢印、図 3B-Cで示される) 画像の平面にミエリン鞘に対しコアと表示されます(アスタリスク、図 3B-Cで示される) ビューのフィールドにそのレイアウトの垂直は、以下またはすべてではない目に見えるです。ほぼすべての節は、可視化、多くの節は鞘は表示されていない (図 3 aを挿入) の小さい部分と不連続、表示します。髄鞘のこれらの小さな「ギャップ」は、3 つの相補的な波長、いわゆるスコア9の画像入力できます。
図 1:免疫組織化学は、MBP 水戸下流が免疫陽性 Olig2 および MBP は、オリゴデンドロ サイトで選択的に表現されることを確認します。 画像、培養マウスの脳スライスの大脳新皮質 (AAV2/8) で導入された MBP-水戸-下流 (赤、ミトコンドリア マーカー) と CAG GFP (緑、細胞質)。スライスされたミエリン マーカー ミエリン塩基性タンパク質 (MBP、青) と Olig2 カルビンディン抗体 (オリゴデンドロ サイト系列細胞核のマーカー、マゼンタ)。(図参照13から変更)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: オリゴデンドロ サイトでミトコンドリアの動きを追跡するタイムラプス イメージングします。Z スタック (光学セクション 10.35 μ m) を MBP_mito_dsred (赤いミトコンドリア) と CAG_GFP (蛍光グリーン) 増殖型オリゴデンドロ サイトの (A) の投影。(B) 単一のコンフォーカル画像 (光学セクション 1.04 μ m) 同じセル。広場はタイムラプス イメージング (C) に対して選択された地域を表し、(d) kymographs (キム) に描画された線が示されます。A のセルのコマ撮り録画から (C) の画像と B の異なる時点で撮影します。移動のミトコンドリアが示されている (赤矢印) です。(D) Kymographs の軌道からは、(B) で示されます。静止したミトコンドリアがまっすぐ垂直線と見られているし、移動のミトコンドリアは、斜めの線と見られています。Kymographs、および (C) の経時的画像で見ることができる、マーク Kymograph 1 (Kym 1) プライマリ プロセス内のミトコンドリアだけが動いています。他の 3 つの kymographs 内のミトコンドリアは、時間経過の記録中に固定されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 共焦点反射顕微鏡 (コア) 無染色ミエリンの可視化します。(A) z スタック (光学セクション 10.35 μ m) をライブ脊髄脳スライスの大脳皮質からの投射。(緑細胞体) を示すオリゴデンドロ サイトの GFP 発現が主なプロセスとミエリン鞘の同定のため暗すぎます。代わりに、ミエリン鞘は、488 nm で励起し、キャプチャ発光 (マゼンタで表示されます) 470-500 nm, 可視化されました。GFP + オリゴデンドロ サイトの細胞質が豊富な paranodes のいくつかは、髄節間 (矢印) のヒントを見ることができます。挿入: ミエリン鞘の一部を拡大表示、コアと可視化ミエリン「まだら」または不連続 (詳細については本文を参照してください)。(B ・ C)共焦点線条体 (B) そして海馬 CA1 の地層結腸寄生虫から (C) の画像は 4 %pfa、ミエリン塩基性タンパク質 (MBP) の immunostained で固定された急性マウスの脳スライス。水平ミエリン鞘 (矢印) は、ビューのフィールド (アスタリスク) に垂直な鞘が表示されない最も頻繁に対しコアと表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明した切片の文化を作るためのプロトコルは・ デ ・ シモーニと優 (2006 年)5で記述されたプロトコルの修正版18です。最も重要な変更は、以下に概説されています。Tris バッファーは、ウイルス伝達の間にインキュベーター外スライスの生存率と細胞培地の変更を向上させる文化メディアに追加されます。紙吹雪の殺菌のプロシージャも変更されます。他のプロトコルは、オートクレーブに入れることによって紙吹雪を殺菌しながらお勧めしませんこのカールに紙吹雪のいくつかを引き起こすので。これらの成長のスライスは健康ではないがちとカールの紙吹雪を使用しないでください。私たちプロトコル マウスを使用して、ないラット、および海馬ではなく野の文化へ変更我々 を見つけるは薄くスライス (230 μ m 対 300 μ m) で十分に働きます。生後から作られたマウスおよびラット19文化 10-20 周辺髄鞘形成のピークとしてマウス p7 9 (と、11-14 日の培養)、ミエリンオリゴデンドロ サイトを勉強して最適です。11-14 日 in vitro、には文化がコンパクトなミエリン鞘13成熟オリゴデンドロ サイトいくつか含まれます。若いマウスから作られた文化は、古いマウスから文化が作られたに対し20健康を保つためにより挑戦的な示されている培養期間の終わりに少ない成熟オリゴデンドロ サイトが含まれます。
脊髄スライスを行うための手順には、いくつかの重要な手順が含まれます。解剖と脳のマウントし同様、紙吹雪、上にスライスを配置することを行う必要があります高速し、いくつかのスキルが必要です。通常、脊髄スライス培養することを最初の試みはより少なく成功した、練習の 2 〜 3 ラウンドは健全な文化を作るために必要なスキルを取得する十分なはず。文化の汚染を避けるためにプロシージャ全体の無菌環境を保つことが重要です。また、生きた細胞を操作するときは、正しい pH および細胞の健康を維持するために溶液の浸透圧を確保することが不可欠は常に。それは、したがって、浸透圧 (270-310 mOsm/kg をする必要があります) と初めての実験を行うとき、特にスライスで使用されているすべてのソリューションの pH をチェックする良いアドバイスです。PH 指示薬 (フェノールレッド) を切片文化の文化と郭清のソリューションに含めるが、培養培地で黄色の血清はより低いの印象を与えることができる実際の ph 値よりも。培養液には、感染の可能性を最小限に抑えるために、ペニシリン、ストレプトマイシン、ナイスタチンが含まれています。そのためラボで脊髄スライス培養技術を設定するとき、これらの抗生物質と抗を使用する勧めが専門家の無菌技術を適用すると後で回避できます。現在のプロトコルは、細胞生存率を評価するために、細胞の形態を使用します。もっと定量的な検査のためのスライスを読み込める propidium ヨウ化や前述のような染料他21。ただし、下流、tdtomato その他の赤い指標と propidium ヨウ化物イオンの発光スペクトルが重なっていることに注意してくださいすることが重要です。Propidium ヨウ化と同じような試薬の別の制限は、セル5のトップ層に細胞生存率の評価が少なくてスライスのより深い層を容易に入力しないことです。
遺伝子送達のためにさまざまな方法が存在しています。細胞内小器官を視覚化する脊髄スライス培養の AAV 伝達を使用しての主な利点は次のとおりです: AAV 伝達は非ウイルス性遺伝子導入方法22と比較して後オリゴデンドロ サイトのより良い成功率。さらに、切片培養におけるすべての脳細胞の種類があるとオリゴデンドロ サイト、見られる生体内で、コンパクトなミエリン13を含むような形態があります。これは軸索との通信がないと、コンパクトなミエリンを作らないためで、オリゴデンドロ サイトが違います。体外イメージング体内で簡単と比較してより良い空間分解能、ミトコンドリアなどの細胞小器官をイメージングするとき、特定の関心のあるを提供しています。今後の研究は、生体内イメージ、しかし脂質豊富な髄鞘によって引き起こされる光学収差を持つ偉大な挑戦の顔を目指します。さらに、体内と体外の条件13,23間 AAV 血清型の親和性とプロモーターの特異性が異なる場合があります。ここで提示されたプロトコル、AAV2/8 MBP_mito_dsred と AAV2/8 MBP_mito_GFP は、オリゴデンドロ サイトのミトコンドリアを視覚化する使用されます。AAV 血清型 2/1 MBP_mito_dsred でテストされましたが、感染 (図示せず) 切片スライスのオリゴデンドロ サイトの数を減らす。AAV2/8 CAG_GFP および AAV2/8 CAG_tdtomato は、オリゴデンドロ サイトの細胞質を可視化する使用されました。にもかかわらず、この一般的な CAG プロモーターを使用して、AAV 2/8 CAG_GFP、CAG_tdtomato 選択的に感染して感染しているニューロンとアストロ サイトの数が少ないと、オリゴデンドロ サイト (これらが簡単に識別する彼らの特性の形態で)。この選択性オリゴデンドロ サイトはおそらく AAV 2/8 血清型24の親和性のためです。しかし、細胞小器官をターゲットとした式 MBP - 高い細胞特異性を実現または他オリゴデンドロ サイト特異的発現プロモーターをお勧めします。私たちは CAG_GFP テストその他の血清型は、AAV 2/1、2/2、2/5、2/7、2/9、最もうち感染ニューロンとアストロ サイト (非表示) 主にだった。
構築と実験的条件に応じて細胞伝達の変更必要になります。導入された細胞が暗すぎる場合、表現させる導入後の in vitro長い時間みてください。セル表示明るいが、不健康な場合は、導入後時間を短縮します。非常に少数の細胞が導入、AAV の濃度を増やすことができます。しかし、それも体外伝達後の時間が長すぎると、導入された細胞が死亡していることは可能です。ここで使用される構造、発現レベル伝達最適な 4 〜 6 日であった。伝達後 7-8 日、セル登場少なくヘルシーで、メタボール プロセスと導入後、10 日間、いくつか導入されたセルのみ表示されていた (表示されていません)。
このプロトコルは、切片スライスのライブ イメージングの正立型顕微鏡を使用します。これほとんどモノラルとは異なります- と共培養倒立顕微鏡を使用します。スライスし、おそらくより少なく健康であるスライスを引き起こす上向き、紙吹雪をオンする必要があるので、ここで倒立顕微鏡を使用する最適です。正立顕微鏡の利点の 1 つは、セットアップに電気生理学を追加する可能性です。また、薬液を追加およびタイムラプス イメージング中に削除できますは簡単に媒体を変更するポンプの使用を意味します。ポンプの欠点は振動とお風呂で電流によるフォーカスを維持する問題です。細胞は顕微鏡の下で徐々 に少ない健康的です。したがって、1 時間に最大を顕微鏡下でスライスを維持します。イメージ スライスは、(特殊な廃棄物) が破棄されます。最適な撮影条件をように、ミトコンドリアの動きはすでによく特徴付けられる、制御の細胞のイメージングを並行して実行する必要があります。(免疫染色に続いて 2/1 CAG_mito_dsred が伝達 (どの下流式は神経特異 synapsin プロモーターによって駆動される) 2/1 Syn_mito_dsred または AAV AAV とスライスによってイメージを作成することができます例、ミトコンドリア運動軸索や樹状突起の携帯の本人を確認)ミトコンドリアの動態解析を行うことができます ImageJ25を他の場所で説明されているように複数の kymograph ツールを使用します。
ここでライブ イメージング中無染色ミエリンの可視化のコアについて述べる。スコア9、3 つの励起波長を使用すると比較してコアのみを使用して 1 つ (488 nm) を実装する方が簡単と。スコア、3 つの波長がそれぞれ異なる「ピース」髄鞘と一緒に鞘の完全なイメージを与えるを明らかにします。さらに、スコアは、細胞質のポケットのような髄鞘構造を検出する使用できます。コアで使用される単一波長より詳細なビューが与えられ、粒状または不連続に鞘が表示されます (図 3)。それにもかかわらず、コアは、ビューのフィールドに水平がミエリン鞘の 100% に近い可視化します。したがって、コア、ミエリン鞘の検出ではなく、ミエリン構造または整合性の解析に便利です。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
リンダ ヒルデガルト Bergersen とアクセス用 Magnar Bjørås 細胞研究室と装置、プラスミドのウイルス産生 Janelia 分子生物学共有リソース スタッフ、レーザー パワー測定について公園 Vervaeke に感謝しますノルウェーの健康協会、ノルウェーの研究評議会によって資金が供給されたこの作品、顕微鏡装置 Norbrain によって資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller - thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller - heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
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