Summary
Oligodendrocytes myelinating promoción la propagación del potencial de acción rápida y la supervivencia neuronal. Descrito aquí es un protocolo específico de oligodendrocyte expresión de proteínas fluorescentes en organotypic rebanadas de cerebro con imágenes de lapso de tiempo posterior. Además, se presenta un procedimiento sencillo para la visualización de mielina sin manchas.
Abstract
Las neuronas dependen del aislamiento eléctrico y soporte trófico de oligodendrocytes myelinating. A pesar de la importancia de los oligodendrocitos, las herramientas avanzadas actualmente utilizadas para estudiar las neuronas, sólo en parte se han tomado por los investigadores del oligodendrocyte. Celular tipo-específicas de tinción por transducción viral es un enfoque útil para estudiar dinámica organelo vivo. Este papel describe un protocolo para visualizar las mitocondrias oligodendrocyte en rebanadas de cerebro organotypic por transducción con virus adeno-asociado (AAV) portadores de genes para proteínas mitocondriales de fluorescentes específicos bajo el control transcripcional de el promotor de la proteína básica de mielina. Incluye el protocolo para hacer organotypic rodajas de cerebro de ratón coronal. Un procedimiento para Time-lapse de imágenes de las mitocondrias luego sigue. Estos métodos pueden ser transferidos a otros organelos y pueden ser particularmente útiles para el estudio de organelos en la vaina de mielina. Finalmente, describimos una técnica fácilmente disponible para la visualización de la mielina sin manchas en rebanadas de vida por microscopia Confocal de la reflexión (núcleo). No requiere ningún equipo adicional y puede ser útil para identificar la vaina de mielina durante proyección de imagen vivo.
Introduction
Sustancia blanca del cerebro se compone de axones de neuronas envueltas en mielina, membrana plasmática prolongada especializada formada por oligodendrocitos. Mielina es necesaria para la supervivencia a largo plazo de axones myelinated y propagación del potencial de acción rápido y confiable, y una pérdida de mielina puede causar disfunción neurológica. A pesar de su importancia, las propiedades de los oligodendrocitos son menos conocidos en comparación con las neuronas y astrocitos. En consecuencia, menos herramientas han sido desarrolladas para el estudio de oligodendrocitos.
Vivo la proyección de imagen de orgánulos celulares como mitocondrias, retículo endoplasmatic (ER) o diferentes estructuras vesiculares pueden ser útiles para el estudio de los cambios dinámicos en los organelos en el tiempo. Tradicionalmente, se ha realizado la proyección de imagen de los oligodendrocitos de la vida en monocultivos1,2. Sin embargo, oligodendrocitos en monocultivo no muestran mielina compacta y organotypic o rebanadas de cerebro agudo por lo tanto, pueden ser una mejor opción al estudiar la localización y movimiento de organelos. Localización de pequeños orgánulos y las proteínas en la mielina puede ser difícil debido a la corta distancia entre el axón mielinizado y la vaina de mielina alrededor. Así, luz microscópico immunostaining procedimientos solo no tiene la resolución espacial para discriminar entre orgánulos en la vaina de mielina y el axón mielinizado. Esto se puede solucionar por transducción viral con genes de proteínas fluorescentes dirigidos a organelo impulsados por promotores específicos del tipo de célula. Las ventajas son una expresión celular específicos y escasa, que permite la evaluación precisa de la localización de organelas y dinámica. Animales transgénicos pueden también utilizarse para lograr tal una expresión célula-específica orientada a organelas3. Sin embargo, la producción y mantenimiento de los animales transgénicos es caros y generalmente no ofrece la expresión escasa que puede lograrse mediante métodos virales.
El método descrito aquí utiliza transducción viral de oligodendrocitos con proteínas fluorescentes dirigidos a mitocondrial (dsred o verde fluorescente protein, GFP) impulsado por el promotor de la proteína básica de mielina (MBP-mito-dsred o MBP-mito-GFP) para visualizar mitocondrias de oligodendrocyte en rebanadas de cerebro organotypic. Además, la expresión de otra proteína fluorescente en el citoplasma (GFP con dsred mito o tdtomato con mito-GFP) se utiliza para permitir la visualización de la morfología de la célula, incluyendo los compartimientos citoplásmicos de la vaina de mielina. El protocolo incluye el procedimiento para hacer rebanadas de cerebro organotypic (una versión modificada del protocolo descrito por De Simoni y Yu, 20064,5). A continuación describimos el procedimiento Time-lapse de imágenes para estudiar movimiento mitocondrial. Este procedimiento utiliza un microscopio confocal vertical con un intercambio continuo de medio de imágenes, una configuración que permite la fácil aplicación de drogas u otros cambios medio durante proyección de imagen. El Time-lapse imagen puede realizarse en cualquier microscopio confocal, con algún equipo adicional para el mantenimiento de sectores de la vida como se describe a continuación. El protocolo también contiene varios consejos para optimizar la proyección de imagen y reducir fototoxicidad.
Por último, se describe una forma rápida y simple para visualizar la mielina sin manchas por Microscopía Confocal de la reflexión (núcleo). Esto puede ser útil para identificar la vaina de mielina durante proyección de imagen vivo. En los últimos años, varias técnicas se han desarrollado para mielina imagen sin ninguna tinción requiere, pero la mayoría de estos requieren específicos equipo y experiencia6,7,8. El procedimiento descrito aquí utiliza las propiedades reflectantes de la vaina de mielina y es una versión de longitud de onda de excitación única simplificada de la Microscopía Confocal espectral de la reflexión (la puntuación, en el que varias longitudes de onda del laser se combina para visualizar la mielina) 9. núcleo puede hacerse en cualquier microscopio confocal que tiene un 488 nm láser y un filtro de emisión de banda 470-500 nm o un filtro de emisión ajustables.
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Protocol
los procedimientos aquí descritos han sido aprobados por la Autoridad Noruega de investigación Animal. Proveedores y números de catálogo de consumibles y otros requieren equipos están disponibles en la lista de materiales al final del documento.
1. preparación de Organotypic rebanadas
Nota: esta receta utiliza dos crías de ratón en el día postnatal 7-9 (p7-9), que rinden 24 rebanadas organotypic divididos en dos platos de seis-bien cultura. A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos deben realizarse en una campana estéril y deben utilizarse guantes de nitrilo o látex. Deben usarse sólo los ingredientes grado cultivo celular.
- Autoclave botellas, herramientas de disección (1 tijera grande, 1 tijera pequeña, 1 espátula plana grande, 1 pequeña espátula afilada y redondeada y 1 fórceps, ver materiales lista para más detalles), pipetas, puntas de pipeta y paños de tejido utilizados para la preparación de corte de cristal.
- Como la mitad de las pipetas de vidrio debe ser utilizada con la abertura grande, romper el extremo angosto.
- Cuenta con una punta de trazar de diamante la pluma (si está disponible) alrededor de la pipeta justo por debajo del punto donde el vidrio comienza estrechamiento. Luego coloque el extremo puntiagudo de la pipeta en un guante de nitrilo o similares. Romper con cuidado la punta doblando la pipeta mientras se empuja contra un banco de trabajo.
- Entonces embotado el extremo roto frotando sobre un trozo de papel de lija o derretir levemente en un mechero de Bunsen. Las pipetas rotas se utilizan para transferir rebanadas de cerebro corte con el extremo roto se convirtió en el bulbo de goma y los grandes con el extremo abierto tocando las rebanadas de solución.
Nota: Esto no se realiza en una campana estéril y se puede hacer varios días de antelación.
- Platos de cultura.
Nota: Esto se puede hacer el día antes de cortar o al menos 2 horas antes de rebanarlo.- Las membranas de esterilización del politetrafluoetileno (PTFE) (" confetti "). Utilizar dos pinzas estériles para remover confeti sola de las piezas de plástico azul circundantes y esterilizar sumergiendo dos veces en una placa Petri que contiene 96% de etanol (EtOH). Luego poner confeti en un plato de Petri grande estéril para secar.
Nota: El confeti son membranas PTFE hidrofílicas similares a las membranas en los insertos de la cultura. El uso de confeti ayuda la imagen vivo porque rodajas solo se pueden transferir fácilmente desde la inserción a la configuración del microscopio levantando el confeti con fórceps (ver 4.8. para más detalles). Por otra parte, las rebanadas de cerebro pueden ser cultivadas sin el confeti (en el que las rebanadas se conecte directamente a la membrana de la inserción de la cultura). En este caso, la inserción de la membrana debe cortarse con un escalpelo para transferir la rebanada al baño microscopio. - Añada 1 mL de medio de cultivo (receta en reactivos ' mesa) a cada pocillo de los platos de seis-bien cultura. Una cultura de
- lugar insertar en cada pocillo utilizando pinzas estériles. Evitar las burbujas de aire entre el inserto y el medio de cultivo.
Nota: Para ahorrar dinero y el medio ambiente, es posible reutilizar los insertos de la cultura. Esto se puede hacer un enjuague en agua destilada H 2 O (dH 2 O) seguido por la incubación en el 70% EtOH durante un mínimo de 24 h hasta su reutilización. Al prepararse para la nueva cultura, los rellenos en una placa de cultivo celular bajo ultravioleta (UV) de 15-30 min. en seco
Insertos - confeti (esterilizada y seca) dos en cada uno de la cultura. Coloque el confeti hacia los bordes de los rellenos para obtener mínima superposición.
- Poner las placas en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C con 5% CO 2.
- Las membranas de esterilización del politetrafluoetileno (PTFE) (" confetti "). Utilizar dos pinzas estériles para remover confeti sola de las piezas de plástico azul circundantes y esterilizar sumergiendo dos veces en una placa Petri que contiene 96% de etanol (EtOH). Luego poner confeti en un plato de Petri grande estéril para secar.
- Medio de la disección en frío de burbuja (receta en reactivos ' mesa) con gas de bióxido (95% O 2 /5%CO 2). Para mantener la solución estéril, conecte el tubo de la bombona a un filtro de jeringa estéril (tamaño de poro de 0,22 μm).
Filtro
- par el otro extremo de la jeringa a un tubo estéril conectado a una pipeta de vidrio estéril. Colocar la pipeta de vidrio en la solución, cubra con parafilm y encienda el gas. Mantener el medio de la disección en hielo.
- Preparar la zona de disección/rebanar.
Nota: Idealmente, este procedimiento debe realizarse en una campana estéril. Si esto no fuera posible, el vibratome puede dejarse en un banco de trabajo. En este caso, se recomienda usar una máscara de red y la cara de pelo.- Usando una cuchilla de un solo borde, cortar una pieza rectangular (aproximadamente 2 cm x 0,5 cm) de gel de agarosa (receta en reactivos ' mesa) y pegar esto en el escenario de vibratome tales que el lado largo quede la hoja vibratome.
- Limpiar todas las superficies y las partes de vibratome con 70% EtOH y limpie con paños de tejido esterilizado.
Nota: Es importante que todas las piezas que estarán en contacto con el tejido cerebral son completamente secas ya que EtOH puede dañar las células. - Adjuntar una hoja de afeitar estéril para el vibratome y realizar comprobación de vibración si la vibratome tiene esta función.
- Toallitas de herramientas disección esterilizado en la capilla junto con tejido esterilizado, cuatro placas de Petri pequeñas, un bisturí de borde redondo, pipetas de vidrio 2 con bulbos de goma, dos pipetas de cristal ampliable (ver PT. 1.1) y súper pegamento (rociado con EtOH).
- Verter medio de disección burbujeado en el barco de vibratome y en las cuatro placas de Petri pequeñas.
Nota: Este paso sólo debe realizarse inmediatamente antes de la disección ya que medio partir de este punto no es burbujas o mantenido en hielo.
- Cerebros diseque y Monte.
Nota: Para obtener rodajas saludables, este paso debe hacerse rápidamente y con precisión. Se necesita algo de práctica.- Eutanasia animal #1 por luxación de la neckor según las pautas locales y luego decapitar con las tijeras grandes.
- Usando pequeñas, afiladas tijeras, rápidamente Retire la piel haciendo una incisión sagital del cuello a la nariz y tirar a un lado para revelar el cráneo.
- Corte a lo largo de la sutura sagital, seguida por incisiones laterales en la parte interior de los huesos frontal y la sutura de lamboid (la frontera entre el cerebro y el cerebelo).
- Utilice pinzas para doblar abierto el cráneo a cada lado. Se cortan los nervios craneales del cerebro insertando una espátula redondeada, aguda en el lado ventral del cerebro y mover suavemente la espátula lateralmente.
- Utilizar una cuchilla de filo solo para hacer una guirnalda corte rostral al cerebelo.
Nota: Este corte determinará el ángulo en que se cortan las rebanadas. Por lo tanto, debe hacerse en un ángulo recto. - Tapa el cerebro fuera del cráneo y en una pequeña placa Petri que contenga medio de disección.
- Repetir pasos 1.6.1.-1.6.4. lugar y animales #2 este cerebro en un segundo Petri dish.
Nota: Los animales no son estériles. Realizar la disección en un lado de la campana y luego hacia el otro, lado limpio una vez que se hayan quitado el cerebro del cráneo. - Cambiar guantes.
- Acople cerebro vibratome etapa: Añadir una fina capa de pegamento a la etapa justo en frente del gel de agarosa montado. Mantener parte del cerebro #1 con una gran espátula plana con la recién cortada (caudal) tocando la espátula y el revestimiento del lado ventral (y está tan cerca como sea posible) el gel de agarosa.
- Luego Coloque suavemente el cerebro sobre el pegamento por empujar la espátula con un conjunto de pinzas. Asegúrese de dejar suficiente espacio para cerebro #2.
Nota: Es importante que el cerebro se une bien a la etapa, pero sin pegamento excesivo, esto puede obstruir el corte.
- Luego Coloque suavemente el cerebro sobre el pegamento por empujar la espátula con un conjunto de pinzas. Asegúrese de dejar suficiente espacio para cerebro #2.
- Inmediatamente después del montaje del cerebro #1, utilice la espátula grande para agregar unas gotas de medio de disección en la parte superior del cerebro. Esto mantendrá el cerebro húmedo, endurecer la cola y evitar que se peguen a los lados de los cerebros.
- Repetir los pasos 1.6.7 y 1.6.8. cerebro #2.
- Fijar la etapa al barco de vibratome.
- Corte 230 μm coronal rodajas gruesas con una amplitud de 1-1.5 mm, una frecuencia de 85 Hz y una velocidad de 0.2 mm/s. rebanadas recogemos aproximadamente entre 1,4 mm rostral y caudal a Bregma 2,1 mm.
- Recoger rebanadas después de cada rebanada se ha reducido mediante el uso de pipetas de cristal ampliable (PT. 1.1). Transferencia de rodajas a un plato de Petri que contenga medio de disección. Usar un bisturí redondo para cortar las rebanadas en dos pedazos, dividiendo los dos hemisferios.
- Cuando se cortan las rodajas, coloque rebanadas en los platos de cultura.
- Sacar la placa de cultivo (uno a la vez) de la incubadora.
- Cuidadosamente utilizando las pipetas de cristal ampliable, transferir una rebanada a cada uno de lo confeti.
Nota: Las rodajas deben colocar plano en medio el confeti. Esto requiere cierta habilidad. Sin embargo, si algunos sectores no son perfectas, es mejor dejar que to pasar tiempo tratando de moverlas ya que es importante que todas las rodajas en la incubadora tan rápido como sea posible. - Utilice una pipeta de vidrio (extremo puntiagudo) para eliminar suavemente el exceso medio sin tocar la rebanada de.
Nota: Rodajas no deben ser sumergidas en el líquido durante la incubación. Así, medio exceso debe aspirarse que las rebanadas están expuestas al aire (una fina película de medio todavía cubre las rodajas). Sectores que queden inmersos en el líquido serán generalmente insalubres o morir (4 y nuestras observaciones). - Mover el plato en la incubadora una vez que el confeti tiene una rodaja.
- Repita puntos 1.7.8.-1.8.4. plato #2.
- Cambiar el medio de cultivo.
Nota: Esto se debe hacer al día siguiente (día 1 in vitro, DIV1) de corte y después cada 2-3 días.- Precalentar el medio de cultivo en la incubadora o en un baño de agua.
- En una campana de estéril, usar la succión del vacío o una pipeta regular con una punta estéril para aspirar el medio de cultivo de cada pozo. Esto se hace con cuidado inclinar el plato (de unos 30 grados) y colocando la punta de la pipeta en el borde de la inserción de la cultura.
- Retire aproximadamente 800 μl de cada pocillo (dejando apenas suficiente medio para mantener la parte inferior del relleno en medio). Luego, con una pipeta limpia, añadir 800 μl de medio precalentado a cada pocillo. Luego coloque las placas en la incubadora de la célula cultura.
2. Transducción viral
- compra o hacer aireación con un plásmido de interés, como se describió anteriormente 10 , 11.
Nota: Este protocolo describe el uso del serotipo AAV (AAV 2/8) 2/8 transporte mitocondrial dirigido como un gen reportero bajo el control transcripcional de la proteína básica de mielina promotor 12 dsred o GFP (AAV2/8 MBP_mito_dsred o AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) para visualizar las mitocondrias oligodendrocyte. AAV 2/8 con GFP o tdtomato como gen reportero impulsado por el promotor general de CAG (AAV 2/8 CAG_GFP o AAV 2/8 CAG_tdtomato) se utiliza para visualizar el citoplasma oligodendrocyte. Así, la combinación de AAV2/8 MBP_mito_dsred con CAG_GFP de AAV 2/8 da rojo mitocondrias y citoplasma verde en oligodendrocitos, mientras que la combinación de AAV2/8 MBP_mito_GFP y AAV 2/8 CAG_tdtomato da verdes mitocondrias y citoplasma rojo. Las construcciones se describen en más detalle en otra parte 13. - En el día 7 en vitro (DIV7), transducir oligodendrocitos con la aireación.
PRECAUCIÓN: Siga los reglamentos de seguridad para trabajar con aireación. Asegúrese de tener la formación adecuada y la aprobación del nivel de bioseguridad requerido. Todos los puntos siguientes deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad clase II uso de guantes y bata de laboratorio. Aquí, aplicación de AAV en el área de la corteza de las rebanadas se describe, ya que es el área que muestra la mejor recuperación.- Diluir la AAV en precalentado (37 ° C) medio de cultivo. Diluciones alrededor 2 × 10 9 genoma copias/mL (GC/mL) se recomiendan obtener un escaso transducción de los oligodendrocitos que permite la proyección de imagen de células individuales dentro de la rebanada. Sin embargo, un piloto con diferentes títulos debe hacerse para asegurar una densidad de oligodendrocitos transduced que es conveniente para los experimentos específicos. Si se utilizan dos diferentes AAVs, deben ser mezclados en la misma solución y añadidos a la rebanada al mismo tiempo.
- Añadir alrededor de 1,3 μl diluir AAV a cada rebanada: Asegúrese de que la parte exterior de la pipeta está secado. Pipeta de 1,3 μl diluir AAV y sostenga la pipeta encima de la corteza, tan cerca como sea posible sin tocar la rebanada con la punta de la pipeta (cerca de 1 mm de distancia).
- Luego empuje lentamente solución fuera de la pipeta. Cuando la solución toca la rebanada, mueva la punta de la pipeta sobre la corteza para distribuir la solución sobre el área de la corteza todo.
Nota: Este procedimiento debe hacerse lo más rápido posible para evitar mantener las rebanadas de la campana más tiempo del necesario. Hacer esto en un plato en el momento y volver a poner el primer plato en la incubadora antes de iniciar en el plato #2. Para obtener una distribución satisfactoria de AAV sin dañar el tejido requiere algo de práctica y una mano constante.
- Si un microscopio de fluorescencia vertical está disponible en el laboratorio celular, expresión de la proteína puede comprobarse durante el tiempo en la cultura, colocando el plato bajo el microscopio.
Nota: El plato no se debe mantener fuera la incubadora durante más de 2-5 minutos.
3. Proyección de imagen de Time-lapse
Nota: la proyección de imagen puede realizarse cuando los niveles de expresión de los marcadores fluorescentes son suficientes y las rebanadas de aspecto sanas (generalmente DIV11-14).
- Asegúrese de que el microscopio, la perfusión y la calefacción se configuran correctamente para que solución de burbujas se calienta y puede entrar y salir de la bañera.
Nota: Varias soluciones existen para salas de baño. Una versión simple se presenta aquí.- Hacer en - y salidas de baño por las agujas de jeringa romas (inclinada a ~ 45°) que están sujetas a los lados de la bañera con blu-tack/divertida tack.
- Asegurar que la tubería va desde una botella de solución imágenes burbujeado continuamente, a través de la bomba peristáltica, a través del tubo de la calefacción de la unidad del calentador y luego a la aguja de la jeringa de entrada en el baño.
- Conectar otro tubo a la salida de aguja de la jeringa. Este tubo va entonces a través de la bomba peristáltica y de vuelta a la botella de solución de imagen (o una botella de residuos).
- Solución de imagen de la burbuja (receta en reactivos ' mesa) con gas de bióxido.
Nota: Esto debe ser stareportado al menos 15 minutos antes de la proyección de imagen y continuar durante todo el experimento. - Vuelta en ejecución solución a través de la bañera para obtener la temperatura óptima del baño (37 ± 0,5 ° C) y calentador y bomba peristáltica. Asegúrese de que el sensor del termómetro conectado a la unidad de temperatura es sumergido en la solución del baño.
- Encender el microscopio, lámpara de fluorescencia y láser adecuada. Camino de
- sistema para arriba una luz adecuada para la muestra.
Nota: Este variará dependiendo de la sonda y configuración del microscopio. Conocimiento general de cómo utilizar el microscopio confocal es necesaria y no se tratarán aquí. - Utilizar un objetivo de inmersión de agua con el aumento adecuado y apertura numérica (n.a.). Usamos un objetivo plan-apochromat de la inmersión del agua de 40 x (n.a. 1.0). Alfiler de
- abierto para lograr un corte óptico de aproximadamente 2-2.5 μm para el vídeo Time-lapse. Esto reduce la ocurrencia de mitocondrias fuera de foco en movimiento durante el lapso de tiempo.
- Transferencia organotypic rebanada para el baño:
- añadir una gota de solución o medio de cultivo a un plato de Petri de plástico pequeño.
- En una campana de estéril, usar pinzas estériles para transferir una rebanada organotypic de la membrana Inserte a la caída. El fórceps sólo debe tocar el confeti y la rebanada de no.
- Ponga la tapa en la caja Petri.
- Colocar inmediatamente la placa de cultivo que contiene el resto de las rebanadas de nuevo en la incubadora.
- Traer placa de Petri que contiene rebanada al microscopio.
- Desactivar bomba peristáltica durante la transferencia de corte baño de microscopio. En primer lugar, utilizar fórceps para levantar confeti con fragmento de plato de Petri en la parte superior de la bañera (el confeti flotará). Luego coloque las dos puntas de las pinzas a cada lado de lo confeti para que toquen el confeti sin tocar la rebanada y empuje el confeti a través de la solución a la parte inferior de la bañera. Centro de confeti en medio del baño.
- Pinzas de uso para colocar el anclaje de sujeción (arpa) en la parte superior el confeti sin tocar la rebanada de.
Nota: Un arpa es un ancla de platino en forma de herradura que se utiliza para evitar el slice de flotación o a la deriva en el baño. Para rebanadas agudos, cuerdas finas corren de un lado del arpa al otro (que se asemeja a un arpa de la música). Para organotypic rebanadas, el arpa debe sin hilachas y ajustarla al tamaño de lo confeti de tal manera que puede poner en la parte superior el confeti sin tocar la rebanada de. - Girar a la bomba peristáltica en.
- Bajar el objetivo hasta la muestra de.
- Seleccione la celda y región a la imagen.
Nota: Evite la exposición excesiva de las células de luz de laser ya que esto puede causar toxicidad celular (ver consejos en los puntos más abajo).- Usar los oculares y la lámpara fluorescente para encontrar un oligodendrocyte sano-mirando con la expresión correcta. Por lo general, oligodendrocitos que tienen una fuerte sobreexpresión de la proteína fluorescente aparecen malsanas. Oligodendrocitos insalubres tendrá procesos con apariencia de blobby y las mitocondrias aparecen fragmentadas. En oligodendrocitos saludables, el soma y los procesos aparecen lisos y las mitocondrias tienen longitudes diferentes (aunque por lo general mucho más corto que en neuronas y astrocitos 13 , 14 , 15).
- lugar de la célula de interés en el medio del campo de visión.
- Uso el " vivir " de la función en el software (para microscopios Leica y Zeiss) para identificar la celda en la pantalla y seleccione un área de interés, por ejemplo, una parte de la célula que contiene varios procesos primarios o vainas de mielina o un solo proceso o vaina de mielina.
Nota: Para la imagen tanto de las vainas de procesos como sea posible, seleccionar áreas que contienen procesos que relativamente plana en la dirección x-y. - Ampliar el campo de interés (normalmente producen una imagen con tamaño de píxel de 0,14 - 0,30 μm).
- Con las " regiones " herramientas, dibuje un rectángulo alrededor del área y elija la opción para escanear sólo la región seleccionada. Análisis de tiempo y, por tanto, la exposición de láser, se reducción sólo explorando la región seleccionada.
Nota: Regiones rectangulares horizontales se explorará más rápidamente que las regiones verticales debido al menor número de líneas escaneadas necesarias. Si se analiza una región de rectángulo vertical, el tiempo de análisis puede reducirse girando 90 grados (utilizando la herramienta de rotación) el campo de exploración.
- Ajuste láser potencia y ganancia para obtener una buena vista en la mitocondria.
Nota: Utilice la potencia del láser mínimo necesitada. Si es posible, suba ganancia en lugar de aumentar energía del laser. Además de causar toxicidad celular, láser de muy alta energía bleach los objetos de imagen con el tiempo, por lo que requiere un aumento de la potencia del láser o durante la exploración. La energía requerida y la ganancia dependerá del nivel de expresión y el microscopio. Con un microscopio confocal LSM700, utilizamos un 555 nm láser a una potencia de 20-40 MW a imagen dsred o tdtomato y a 488 nm láser se utiliza en 20-30 MW a GFP (energía del laser en la abertura posterior del objetivo) de la imagen. Ganancia se encuentra alta imagen vivo, generalmente en la gama de 700-800 para GFP y 850-980 dsred y tdtomato. La ganancia alta puede causar algunos más ruido de fondo, que se elimina aumentando el offset digital (offset valores ponen normalmente entre 0 y 15). En nuestra experiencia, usando MBP_mito_GFP le da un mejor señal-ruido que MBP_mito_dsred. - Seleccione scan velocidad.
Nota: Minimizar el tiempo de exploración mediante una rápida velocidad de exploración y dibujando una pequeña región de exploración (ver punto 4.10.5 abajo). También es posible guardar la exploración tiempo realizando un escaneo bidireccional. Sin embargo, no es recomendable debido a la pobre calidad de la imagen. - Conjunto de frecuencia y duración de grabación Time-lapse, por ejemplo, captura de imágenes cada 2 segundos durante un total de 20 minutos para la proyección de imagen mitocondrial en oligodendrocitos.
Nota: La duración y frecuencia deben establecerse según la movilidad de los objetos de interés. Mayor frecuencia expondrá la muestra para más luz laser, pero los objetos de más rápido movimiento también requieren una menor duración total de vídeos Time-lapse (por ejemplo las mitocondrias en las neuronas, que se mueven con mayor frecuencia y a una velocidad mucho mayor que las mitocondrias en oligodendrocitos, por lo general son imágenes cada segundo para un total de 2 minutos 16). - Iniciar grabación Time-lapse.
Nota: La mitocondria puede mover fuera de foco o a la deriva fuera de la región de imagen durante la grabación. Para minimizar las vibraciones y el movimiento, ajustar en - y salidas de baño y reducir la velocidad de la bomba si es necesario. Pequeños cambios en el foco generalmente todavía ocurren. Por lo tanto, se requiere, con pequeños ajustes del enfoque durante la grabación monitoreo continuo de la pantalla durante la proyección de imagen de. - Capturar una z-pila de la célula entera para la futura identificación de la célula y proceso de imagen.
Nota: Para mejor resolución, el alfiler debe restablecer a 1 unidad aireada para la pila de z. - Opcional: visualizar sin manchas mielina.
Nota: En oligodendrocitos transduced con GFP (citoplásmico), las vainas de mielina puede generalmente identificarse como líneas rectas de citoplasma (los bordes citoplasmáticos) conectadas a un proceso primario (ver figura 2 A y B). Sin embargo, si la expresión de GFP es demasiado débil o no se utiliza un marcador citoplásmico, es posible visualizar la vaina de mielina por microscopia confocal de la reflexión (CoRe) como se explica aquí.- Creó un nuevo camino de luz en el software con la excitación láser a 488 nm y captura emitida la luz alrededor de la misma longitud de onda, por ejemplo, 470-500 nm.
- Ajuste potencia del láser y ganar hasta mielina (ver ejemplo en < fuerte clase = "XFig "> Figura 3). Usando un microscopio de LSM 510 Meta, utilizamos normalmente una potencia láser de 7 a 12 MW (medido en la abertura posterior del objetivo).
- Opcional: preparación de rodajas de immunostaining.
- Si la celda de imagen debe ser identificada después de inmunotinción, capturar una imagen de bajo aumento (10 x) de la célula e indicar su ubicación en la imagen dibujando una flecha o similar. Para facilitar la detección de la célula, es aconsejable también dibujar un mapa manual de la rodaja entera, indicando la ubicación de la celda.
- Fix rebanada en 4% paraformaldehido (PFA) en coctelera durante 1 hora a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: El PFA es perjudicial. Utilice ropa protectora y solamente en una campana ventilada. - Diluir fijador 1:10 en PBS y dejar a 4 ° C hasta a partir de inmunohistoquímica como se describe en otra parte 17.
Nota: Aunque pueden dejar rodajas en fijador diluido durante varias semanas, la fluorescencia se puede desvanecer. Se recomienda la realización de inmunohistoquímica dentro de 10 días de la fijación de.
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Representative Results
Rebanadas de cerebro Organotypic que fueron cultivadas y transduced como se describe anteriormente demostraron una escasa distribución de corticales oligodendrocitos expresan mito_dsred y GFP. Immunostaining con los anticuerpos contra Olig2 y MBP confirmaron que la expresión era específica de oligodendrocitos (figura 1).
Para la proyección de imagen vivo, oligodendrocitos transduced fueron reconocidos por su morfología característica de varias envolturas de myelin en paralelo ( figura 2Ayfigura 1 ). Al realizar la proyección de imagen de Time-lapse de los oligodendrocitos transduced, es posible vigilar el movimiento de mitocondrias en los procesos primarios y vainas de mielina (figura 2B-D).
En células con baja expresión de GFP, la vaina de mielina se podría identificar durante proyección de imagen de vivo mediante la iluminación de la muestra a 488 nm y captura emitida luz 470-500 nm (Figura 3A). Esta técnica de (CoRe) de la microscopia Confocal de la reflexión también trabajó en PFA fijadas y immunostained del tejido, aunque myelin envolturas apareció atenuador (figura 3B-C). Immunostaining con los anticuerpos contra la proteína básica de mielina (MBP), encontramos que cerca del 100% de las envolturas de myelin colocación horizontal al plano de proyección de imagen (indicado por las puntas de flecha, figura 3B-C) son visibles con la base, mientras que myelin envolturas esa endecha perpendicular al campo de visión (indicado por los asteriscos, figura 3B-C) son menos o no visibles. Aunque se visualizan los entrenudos casi todos, muchos entrenudos aparecen discontinuos, con pequeñas partes de la vaina no son visibles (insertarFigura 3A ). Estas pequeñas "lagunas" en la mielina pueden ser rellenadas por proyección de imagen con tres longitudes de onda complementarias, denominada puntuación9.
Figura 1 : Inmunohistoquímica confirma que MBP-mito-dsred se expresa selectivamente en oligodendrocitos que son inmunes positivos para Olig2 y MBP. Imágenes son de la neocorteza de rebanadas de cerebro de ratón cultivadas transduced (AAV2/8) MBP-mito-dsred (marcador rojo, mitocondrial) y CAG-GFP (verde, citosol). Las rebanadas immunolabeled su marcador de mielina proteína básica de mielina (MBP, azul) y Olig2 (oligodendrocyte linaje celular nuclear marcador, magenta). (Figura modificada de la referencia13) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Time-lapse de imágenes para rastrear el movimiento mitocondrial en oligodendrocitos. (A) proyección de z-stack (sección óptica 10.35 μm) de oligodendrocyte transduced con MBP_mito_dsred (mitocondrias rojo) y CAG_GFP (fluorescencia verde). (B) confocal imagen (óptica sección 1.04 μm) de la misma célula. Cuadrado indica la región que seleccionó para Time-lapse de imágenes (C) y se indican las líneas para hacer kymographs (kym) en (D). (C) las imágenes de grabación Time-lapse de la célula en el A y B tomadas en diferentes puntos temporales. Movimiento las mitocondrias son indicadas (flechas rojas). (D) Kymographs de las trayectorias indican en (B). Las mitocondrias inmóviles se ven como líneas rectas verticales y mitocondrias móviles se ven como líneas diagonales. Como puede verse en las kymographs y en el curso del tiempo imágenes en (C), sólo las mitocondrias en el proceso primario marcado Kymograph Kym 1 1 son móviles. Las mitocondrias en los otros tres kymographs son fijas durante la grabación de lapso de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Visualización de la mielina sin manchas por Microscopía Confocal de la reflexión (CoRe). (A) proyección de z-stack (sección óptica 10.35 μm) de la neocorteza de un trozo de cerebro organotypic vivo. La expresión de GFP en el oligodendrocyte que se muestra a continuación (cuerpo verde de la célula) es demasiado débil para la identificación de los procesos primarios y vainas de mielina. En cambio, las envolturas de myelin fueron visualizadas por excitación de 488 nm y captura luz emitida a 470-500 nm (mostrado en magenta). Algunos de los paranodes rico en citoplasma de la GFP + oligodendrocyte pueden verse en las puntas de los entrenudos de la mielina (flechas). Inserción: Parte ampliada de la vaina de mielina muestra que la mielina visualizada con base aparece "parches" o discontinuo (véase el texto principal para los detalles). (B-C) Imágenes confocales del estriado (B) y estrato radiatum del hipocampo CA1 (C) de una rebanada del cerebro de ratón agudo que se ha fijado en 4% PFA y immunostained para la proteína básica de mielina (MBP). Envolturas de myelin horisontal (flecha) son accesibles con la base, mientras que las vainas que son perpendiculares al campo de vista (asteriscos) a menudo no son visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla de reactivos: Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo para hacer las culturas organotypic descritas aquí es una versión modificada18 del protocolo descrito por De Simoni y Yu (2006)5. Los cambios más importantes han sido subrayados a continuación. Tampón Tris se añade al medio de cultivo, que mejora la supervivencia de las láminas cuando están fuera de la incubadora durante la transducción viral y cambio del medio celular. También se modifica el procedimiento de esterilización de confeti. Mientras que otros protocolos esterilización en autoclave los confeti, no recomendamos esto porque le causa varios de lo confeti de rizar. Evitar el uso de confeti rizado como cultivadas en estos sectores tienden a ser menos saludable. Nuestro protocolo utiliza ratones, no ratas y se modifica para la corteza en el hipocampo, lugar de la cultura que encontramos funciona bien con cortes más delgados (230 μm vs 300 μm). Myelination picos alrededor día postnatal 10-20 en ratones y ratas19, culturas de ratones en p7-9 (y entonces cultivados por 11-14 días) son óptimas para el estudio de oligodendrocytes myelinating. A los 11-14 días in vitro, las culturas contienen varios oligodendrocitos maduros con envolturas de myelin compacto13. Culturas de ratones más jóvenes contienen menos oligodendrocitos maduros al final del período de la cultura, considerando que las culturas de los ratones más viejos han mostrado más difíciles de mantener saludable20.
El procedimiento para hacer rodajas organotypic implica varios pasos críticos. La disección y montaje de cerebros, así como colocar rebanadas en confeti, debe hacerse rápido y requiere cierta habilidad. Por lo general, las primeras tentativas en la fabricación de organotypic rebanada culturas tienen menos éxito, pero 2-3 rondas de práctica deberían ser suficiente para adquirir las habilidades necesarias para la fabricación de las culturas sanas. Es importante mantener un ambiente estéril durante el procedimiento para evitar la contaminación de las culturas. Por otra parte, cuando se trabaja con células vivas, siempre es imprescindible para asegurar el correcto pH y la osmolalidad de las soluciones para mantener la salud celular. Por lo tanto, es un buen consejo para determinar osmolalidad (debe ser de 270-310 mOsm/kg) y el pH de las soluciones que se utilizan en los sectores, especialmente al hacer el experimento por primera vez. Las soluciones de cultura y disección de las culturas organotypic contienen un indicador de pH (rojo fenol), pero el suero amarillo en el medio de cultivo puede dar una impresión de un más bajo que el pH real. El medio de cultivo contiene penicilina, estreptomicina y nistatina para minimizar las posibilidades de infección. Por lo tanto se recomienda usar estos antibióticos y antimicóticos al configurar la técnica de cultura organotypic rebanada en el laboratorio, pero más tarde puede evitar cuando se aplica una técnica aséptica experto. El protocolo actual utiliza la morfología de la célula para evaluar viabilidad celular. Para un análisis más cuantitativo, rebanadas se pueden cargar con yoduro de propidio o tintes similares tal como se describe en otra parte21. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el espectro de emisión de yoduro de propidio se superpone con dsred, tdtomato y otros indicadores de rojo. Otra limitación de yoduro de propidio y reactivos similares es que no fácilmente entran en las capas más profundas de la rebanada, limitando así la evaluación de la viabilidad de las células a la capa superior de células5.
Existe una variedad de métodos para la entrega del gene. Las principales ventajas del uso de transduction AAV de organotypic rebanada culturas para visualizar los organelos son como sigue: transduction AAV tiene una mejor tasa de éxito de oligodendrocitos postmitotic en comparación con los métodos de transfección no viral22. Además, en las culturas organotypic todos tipos de células del cerebro están presentes y oligodendrocitos tienen una morfología similar a ése visto en vivo, incluyendo mielina compacta13. Esto es diferente de oligodendrocitos en monocultivo, que carecen de la comunicación con los axones y así no mielina compacta. Proyección de imagen en vitro es más fácil en comparación con en vivo y ofrece una mejor resolución espacial, que es de particular interés cuando proyección de imagen pequeños organelos como las mitocondrias. La investigación futura tendrá como objetivo imagen en vivo, pero enfrenta un gran reto con las aberraciones ópticas causadas por la vaina de mielina de ricos en lípidos. Además, AAV serotipo tropismo y promotor de especificidad puede diferir entre en vivo y en vitro condiciones13,23. En el protocolo presentado aquí, AAV2/8 MBP_mito_dsred y MBP_mito_GFP de AAV2/8 se utiliza para visualizar las mitocondrias oligodendrocyte. Serotipo AAV 1/2 también fue probado con MBP_mito_dsred pero infectado a un menor número de oligodendrocitos en las rebanadas organotypic (no mostradas). AAV2/8 CAG_GFP y CAG_tdtomato de AAV2/8 fue utilizado para visualizar citoplasma oligodendrocyte. A pesar de utilizar el promotor general de CAG para esto, AAV 2/8 CAG_GFP CAG_tdtomato selectivamente infectadas y oligodendrocitos, con sólo un pequeño número de astrocitos y neuronas infectadas (estos pueden ser fácilmente identificados por su morfología característica). Esta selectividad de oligodendrocitos es presumiblemente por el tropismo de la AAV serotipo 2/824. Sin embargo, para la expresión orientada a organelas, la mayor especificidad de célula alcanzada con la MBP - u otros promotores específicos de oligodendrocyte se recomienda. Otros serotipos probados con CAG_GFP por nosotros fueron AAV 1/2, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, más que infectan principalmente neuronas y astrocitos (no mostrados).
Dependiendo de la construcción y las condiciones experimentales, se necesitará la modificación de la transducción de la célula. Si las células transduced aparecen demasiado tenues, probar un largo tiempo en vitro después de transducción de señales para aumentar la expresión. Si las células aparecen brillantes pero poco saludables, reducir el tiempo después de la transducción de señales. Si son transduced muy pocas células, se puede aumentar la concentración de AAV. Sin embargo, también es posible que el tiempo in vitro después de transducción es demasiado largo y que han muerto las células transduced. Para las construcciones aquí, niveles de expresión eran óptimo 4-6 días después de la transducción de señales. A los 7-8 días después de transducción de señales, células aparecieron menos saludables, con procesos de blobby y 10 días después de la transducción de señales, sólo unas pocas células transduced eran visibles (no mostrado).
Este protocolo utiliza un microscopio vertical para la proyección de imagen viva de organotypic rebanadas. Esto es diferente de más mono- y co-cultivos que normalmente se utilizan un microscopio invertido. Es subóptima para utilizar un microscopio invertido aquí porque las rebanadas deben montarse luego con el confeti hacia arriba y que probablemente causa los cortes menos saludables. Una de las ventajas del microscopio vertical es la posibilidad de añadir electrofisiología a la configuración. Por otra parte, el uso de una bomba para cambiar el medio significa que soluciones de drogas pueden fácilmente añadidas y quitadas durante la proyección de imagen de Time-lapse. Una desventaja con la bomba es problemas mantener foco causado por las vibraciones y las corrientes en el baño. Bajo el microscopio, las células a ser gradualmente menossaludable. Por lo tanto mantenemos láminas al microscopio por un máximo de 1 hora. Rebanadas de la imagen se desechan (residuos especiales). Para garantizar las condiciones de proyección de imagen óptima, proyección de imagen de células de control, en el que movimiento mitocondrial se caracteriza ya bien, se debe ejecutar en paralelo. Por ejemplo, el movimiento mitocondrial en axones o dendritas puede ser reflejada por transducing rebanadas con AAV 1/2 Syn_mito_dsred (en que dsred expresión es conducida por el promotor sinapsina enolase) o AAV 1/2 CAG_mito_dsred (seguido de inmunotinción para confirman identidad de la célula). Análisis del movimiento mitocondrial se pueden hacer usando la herramienta de kymograph múltiples en ImageJ como se describe en otra parte25.
Aquí describimos el núcleo para la visualización de la mielina sin manchas durante proyección de imagen vivo. En comparación con puntuación9, que utiliza tres longitudes de onda de excitación, núcleo sólo utiliza uno (488 nm) y por lo tanto es más sencillo de implementar. En la puntuación, las tres longitudes de onda cada revelan diferentes "piezas" de la vaina de mielina y juntos dan una imagen completa de la vaina. Además, puntuación puede utilizarse para detectar estructuras de la vaina de mielina como bolsillos citoplásmicos. Con la sola longitud de onda utilizado en la base, se da una visión menos detallada y vainas pueden aparecer granuladas o discontinua (Fig. 3). Sin embargo, núcleo visualiza cerca del 100% de las vainas de mielina que son horizontales en el campo de visión. Así, la base es útil para detección de vainas de mielina, pero no para el análisis de las estructuras de la mielina o la integridad.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen y Magnar Bjørås para el acceso a laboratorio y equipos, personal de Janelia Biología Molecular compartido recursos para la producción de virus y plásmidos y Koen Vervaeke ayuda con medidas de potencia láser de la célula. Este trabajo fue financiado por la Asociación Noruega de salud, el Consejo Noruego de la investigación y el equipo de microscopía fue financiado por Norbrain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller - thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller - heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
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