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Neuroscience

दृश्य और Organotypic मस्तिष्क Adeno-जुड़े वायरस और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइस में Oligodendrocyte Organelles के लाइव इमेजिंग

Published: October 23, 2017 doi: 10.3791/56237
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

Summary

Myelinating oligodendrocytes तेजी से कार्रवाई संभावित प्रसार और ंयूरॉन अस्तित्व को बढ़ावा देने के । यहां वर्णित oligodendrocyte के लिए एक प्रोटोकॉल है organotypic मस्तिष्क स्लाइस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बाद के समय के साथ विशिष्ट अभिव्यक्ति इमेजिंग । इसके अलावा, दाग myelin visualizing के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रस्तुत की है ।

Abstract

न्यूरॉन्स बिजली के इंसुलेशन और myelinating oligodendrocytes के पौष्टिकता समर्थन पर भरोसा करते हैं । oligodendrocytes के महत्व के बावजूद, उंनत उपकरण वर्तमान में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया, केवल आंशिक रूप से oligodendrocyte शोधकर्ताओं द्वारा पर लिया गया है । सेल प्रकार-वायरल transduction द्वारा दाग विशिष्ट लाइव organelle गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । यह पत्र adeno के साथ transduction द्वारा organotypic मस्तिष्क स्लाइस में oligodendrocyte mitochondria visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-जुड़े वायरस (AAV) mitochondrial नियंत्रण के तहत transcriptional लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जीन ले myelin बुनियादी प्रोटीन प्रमोटर । यह organotypic कोरोनरी माउस मस्तिष्क स्लाइसें बनाने के लिए प्रोटोकॉल शामिल हैं । mitochondria की समय-चूक इमेजिंग के लिए एक प्रक्रिया तो इस प्रकार है । इन पद्धतियों को अन्य organelles को हस्तांतरित किया जा सकता है और myelin म्यान में अध्ययनरत organelles के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है. अंत में, हम फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी (कोर) द्वारा स्लाइसें में रहने वाले दाग myelin के दृश्य के लिए एक आसानी से उपलब्ध तकनीक का वर्णन । कोर कोई अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता है और लाइव इमेजिंग के दौरान myelin म्यान की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

मस्तिष्क की सफेद बात तंत्रिका कोशिका axons से बना है myelin, एक विशेष विस्तारित प्लाज्मा oligodendrocytes द्वारा गठित झिल्ली में लिपटे । Myelin तेज और विश्वसनीय कार्रवाई संभावित प्रसार और myelinated axons के दीर्घकालिक अस्तित्व के लिए आवश्यक है, और Myelin का नुकसान स्नायविक रोग पैदा कर सकता है । उनके महत्व के बावजूद, oligodendrocytes के गुणों न्यूरॉन्स और astrocytes के साथ तुलना में कम जाना जाता है. नतीजतन oligodendrocytes के अध्ययन के लिए कम औजार विकसित किए गए हैं ।

सेल organelles की लाइव इमेजिंग जैसे mitochondria, endoplasmatic जालिका (ER) या अलग vesicular संरचनाओं समय के साथ organelles में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है । परंपरागत रूप से, रहने वाले oligodendrocytes की इमेजिंग monocultures1,2में प्रदर्शन किया गया है । हालांकि, monoculture में oligodendrocytes कॉम्पैक्ट myelin प्रदर्शित नहीं करते हैं, और organotypic या तीव्र मस्तिष्क स्लाइस कर सकते हैं, इसलिए, एक बेहतर विकल्प हो सकता है जब स्थानीयकरण और organelles के आंदोलन का अध्ययन. myelin म्यान में छोटे organelles और प्रोटीन का स्थानीयकरण myelinated axon और आसपास के myelin म्यान के बीच कम दूरी के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस प्रकार, प्रकाश सूक्ष्म immunostaining प्रक्रियाओं अकेले myelin म्यान में organelles और myelinated axon में उन लोगों के बीच भेदभाव करने के लिए स्थानिक संकल्प नहीं है । यह organelle के लिए जीन के साथ वायरल transduction द्वारा हल किया जा सकता है लक्षित फ्लोरोसेंट सेल प्रकार विशेष प्रमोटरों द्वारा संचालित प्रोटीन । लाभ एक कोशिका-विशिष्ट और विरल अभिव्यक्ति है, जो organelle स्थानीयकरण और गतिशीलता का सटीक आकलन सक्षम करता है । ट्रांसजेनिक पशुओं को भी ऐसे organelle-लक्षित कक्ष-विशिष्ट व्यंजक3को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, ट्रांसजेनिक पशुओं के उत्पादन और रखरखाव महंगा है और आम तौर पर विरल अभिव्यक्ति है कि वायरल तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है प्रदान नहीं करता है ।

यहां वर्णित विधि mitochondrial-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (dsred या ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP) myelin बुनियादी प्रोटीन प्रमोटर (MBP-मिळो-dsred या MBP-मिळो-GFP) द्वारा संचालित के साथ oligodendrocytes के वायरल transduction का उपयोग करता है कल्पना organotypic ब्रेन स्लाइसेस में oligodendrocyte mitochondria । इसके अलावा, कोशिका में एक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति (या तो GFP के साथ एक साथ इस्तेमाल किया-dsred या tdtomato-GFP के साथ प्रयोग किया जाता है) कक्ष आकृति विज्ञान, cytoplasmic म्यान के myelin डिब्बों सहित दृश्य सक्षम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रोटोकॉल organotypic मस्तिष्क स्लाइसें (डी सिमौनी और यू, २००६4,5) द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण बनाने के लिए प्रक्रिया भी शामिल है । हम तो mitochondrial आंदोलन का अध्ययन करने के लिए समय चूक इमेजिंग प्रक्रिया का वर्णन । यह प्रक्रिया इमेजिंग के दौरान एक सतत विनिमय के साथ एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है, एक सेटअप है कि इमेजिंग के दौरान दवाओं या अंय मध्यम परिवर्तन के आसान आवेदन सक्षम बनाता है । समय चूक इमेजिंग प्रक्रिया किसी भी फोकल माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है, नीचे वर्णित के रूप में रहने वाले स्लाइस बनाए रखने के लिए कुछ अतिरिक्त उपकरणों के साथ । प्रोटोकॉल भी इमेजिंग का अनुकूलन और phototoxicity कम करने के लिए कई सुझाव शामिल हैं ।

अंत में, एक त्वरित और सरल करने के लिए फोकल रिफ्लेक्टर माइक्रोस्कोप (कोर) द्वारा दाग myelin कल्पना तरीका वर्णित है । यह लाइव इमेजिंग के दौरान myelin म्यान की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है । हाल के वर्षों में, कई तकनीकों किसी भी आवश्यक दाग के बिना छवि myelin को विकसित किया गया है, लेकिन इनमें से ज्यादातर विशिष्ट उपकरणों और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है6,7,8। प्रक्रिया यहां वर्णित myelin म्यान के चिंतनशील गुणों का उपयोग करता है और एक सरल एकल उत्तेजना वर्णक्रमीय फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी की तरंग दैर्ध्य संस्करण (स्कोर, जिसमें कई लेजर तरंग दैर्ध्य myelin कल्पना करने के लिए संयुक्त कर रहे हैं) 9. कोर किसी भी फोकल माइक्रोस्कोप है कि एक ४८८ एनएम लेजर और एक ४७०-५०० एनएम bandpass उत्सर्जन फ़िल्टर या एक स्वरित्र उत्सर्जन फिल्टर है पर किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यहां बताई गई प्रक्रियाओं को नार्वे के पशु अनुसंधान प्राधिकरण ने अनुमोदित कर दिया है । माल और अन्य आवश्यक उपकरणों के लिए आपूर्तिकर्ताओं और कैटलॉग संख्या दस्तावेज़ के अंत में सामग्री सूची में उपलब्ध हैं ।

< p class = "jove_title" > 1. Organotypic स्लाइसर्स की तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: यह नुस्खा प्रसव दिन 7-9 (p7-9) में दो माउस पिल्ले का उपयोग करता है, जो 24 Organotypic स्लाइसें २ ६ पर विभाजित उपज-अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन । जब तक अंयथा कहा, सभी प्रक्रियाओं एक बाँझ डाकू और nitril या लेटेक्स दस्ताने में किया जाना चाहिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । केवल सेल कल्चर ग्रेड अवयवों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

  1. आटोक्लेव बोतलें, विच्छेदन उपकरण (1 बड़ी कैंची, 1 छोटी कैंची, 1 बड़े फ्लैट रंग, 1 छोटे गोल और तेज रंग और 1 संदंश, विवरण के लिए सामग्री की सूची देखें), ग्लास पिपेट, पिपेट टिप्स और टुकड़ा तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया ऊतक पोंछे.
  2. के रूप में गिलास पिपेट के आधे बड़े खोलने के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए, संकीर्ण अंत टूट ।
      एक हीरे scriber कलम के साथ
    1. स्कोर (यदि उपलब्ध है) बस बिंदु के नीचे पिपेट के आसपास जहां कांच संकीर्ण शुरू होता है । तो एक नाइट्राइल दस्ताने या इसी तरह में पिपेट के नुकीले छोर जगह है । ध्यान से पिपेट झुकने जबकि यह एक काम बेंच के खिलाफ धक्का से टिप तोड़ ।
    2. तो रेत कागज के एक टुकड़े पर रगड़ या एक Bunsen बर्नर पर थोड़ा पिघल द्वारा टूट अंत कुंद । टूटी हुई पिपेट टूट अंत रबर बल्ब में बदल गया और समाधान छू/
      के बड़े खुले अंत के साथ कट मस्तिष्क स्लाइस हस्तांतरण करने के लिए उपयोग किया जाता है नोट: यह एक बाँझ डाकू में नहीं किया है और अग्रिम में कई दिनों किया जा सकता है ।
  3. संस्कृति व्यंजन तैयार.
    नोट: यह टुकड़ा करने की क्रिया या टुकड़ा करने से पहले 2 घंटे से पहले दिन किया जा सकता है ।
    1. बाँझो Polytetrafluoroethylene (PTFE) झिल्ली (& #34; कंफ़ेद्दी & #34;). दो बाँझ संदंश का प्रयोग आसपास के नीले प्लास्टिक के टुकड़ों से एकल कंफ़ेद्दी को दूर करने और ९६% इथेनॉल (ेतोः) युक्त एक पेट्री डिश में दो बार सूई से निष्फल । फिर शुष्क करने के लिए एक बाँझ बड़े पेट्री पकवान में कंफ़ेद्दी फ्लैट रखना.
      नोट: कंफ़ेद्दी संस्कृति आवेषण में झिल्ली के समान हाइड्रोफिलिक PTFE झिल्ली हैं । कंफ़ेद्दी एड्स लाइव इमेजिंग का उपयोग करें, क्योंकि एक स्लाइस आसानी से डालने से माइक्रोस्कोप सेटअप करने के लिए संदंश के साथ कंफ़ेद्दी उठाने से स्थानांतरित कर सकते हैं (देखें ४.८. for विवरण). वैकल्पिक रूप से, मस्तिष्क स्लाइसें कंफ़ेद्दी (जिसमें स्लाइसें संस्कृति डालने की झिल्ली को सीधे संलग्न करेंगे) के बिना किया जा सकता है । इस मामले में, झिल्ली डालने के लिए एक स्केलपेल के साथ कट किया जाना चाहिए माइक्रोस्कोप स्नान करने के लिए टुकड़ा हस्तांतरण.
    2. एक अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन के प्रत्येक कुआं करने के लिए संस्कृति मध्यम (रिएजेंट में नुस्खा & #39; तालिका) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. जगह एक संस्कृति एक अच्छी तरह से बाँझ संदंश उपयोग में डालने । संमिलित करें और संस्कृति माध्यम के बीच हवा के बुलबुले से बचें ।
      नोट: धन और पर्यावरण को बचाने के लिए, यह संस्कृति आवेषण का पुनः प्रयोग संभव है । यह आसुत एच में पूरी तरह से धोने के द्वारा किया जा सकता है 2 हे (डीएच 2 o) ७०% ेतोः में मशीन द्वारा बाद में पुनः प्रयोग तक 24 घंटे की एक ंयूनतम के लिए । जब नई संस्कृति के लिए तैयारी, 15-30 min.
      4. के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत एक सेल संस्कृति प्लेट में आवेषण सूखी
    4. दो (निष्फल और शुष्क) कंफ़ेद्दी पर प्रत्येक संस्कृति आवेषण । न्यूनतम ओवरलैप प्राप्त करने के लिए आवेषण के किनारों की ओर कंफ़ेद्दी प्लेस.
    5. सेल कल्चरल मशीन में प्लेटें ३७ & #176; C के साथ 5% कं 2 .
  4. बबल कोल्ड विच्छेदन मध्यम (recipe in reagents & #39; सारणी) विथ bioxide गैस (९५% O 2 /5%CO 2 ). समाधान बाँझ रखने के लिए, एक बाँझ सिरिंज फिल्टर करने के लिए गैस सिलेंडर से ट्यूब कनेक्ट (०.२२ & #181; मी पोरे आकार).
    1. एक बाँझ एक बाँझ कांच पिपेट से जुड़े ट्यूब को सिरिंज फिल्टर के दूसरे छोर जोड़े. घोल में ग् पिपेट लगाएं, parafilm से ढक दें और गैस चालू करें । विच्छेदन मध्यम बर्फ पर रखें.
  5. विच्छेदन/टुकड़ा करने की क्रिया क्षेत्र तैयार करें ।
    नोट: आदर्श रूप में, इस प्रक्रिया को बाँझ डाकू में किया जाना चाहिए । यदि यह संभव न हो तो vibratome को किसी कार्य पीठ पर छोड़ा जा सकता है । इस मामले में, यह एक बाल शुद्ध और चेहरे मास्क का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।
    1. एक एकल धार रेजर ब्लेड का उपयोग कर, एक आयताकार टुकड़ा काट (लगभग 2 सेमी x ०.५ सेमी) agarose जेल (एजेंट में नुस्खा & #39; तालिका) और गोंद इस vibratome मंच पर इस तरह कि लंबे पक्ष vibratome ब्लेड चेहरे ।
    2. सभी सतहों और ७०% ेतोः के साथ vibratome भागों को साफ और autoclaved ऊतक पोंछे के साथ पोंछे ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सभी टुकड़ों है कि मस्तिष्क के ऊतकों के साथ संपर्क में हो जाएगा पूरी तरह से शुष्क के बाद से ेतोः कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है ।
    3. vibratome करने के लिए एक बाँझ उस्तरा ब्लेड देते हैं और vibratome इस समारोह है अगर कंपन की जाँच करें.
    4. प्लेस autoclaved डाकू में विच्छेदन उपकरण autoclaved ऊतक पोंछे के साथ एक साथ, चार छोटे पेट्री व्यंजन, एक गोल बढ़त स्केलपेल, रबर बल्ब के साथ 2 ग्लास पिपेट, दो खुले अंत ग्लास पिपेट (pt. १.१ देखें) और सुपर गोंद (ेतोः के साथ छिड़काव) ।
    5. vibratome नाव में और चार छोटे पेट्री व्यंजन में bubbled विच्छेदन मध्यम डालो ।
      नोट: यह कदम केवल इस बिंदु पर से माध्यम से विच्छेदन से पहले तुरंत किया जाना चाहिए पर bubbled या बर्फ पर रखा नहीं है ।
  6. टुकड़े और माउंट दिमाग.
    नोट: स्वस्थ स्लाइस प्राप्त करने के लिए, इस कदम को जल्दी और ठीक किया जाना चाहिए । कुछ अभ्यास की जरूरत है ।
    1. Euthanize पशु #1 स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुसार गर्दन के विस्थापन से और फिर बड़ी कैंची के साथ decapitate.
      2. छोटी, तीखी कैंची का प्रयोग
    2. , जल्दी से नाक को गर्दन से एक sagittal चीरा लगाकर त्वचा को हटा दें और खोपड़ी को प्रकट करने के लिए अलग से खींचो ।
      1. sagittal टांका के साथ कटौती, ललाट हड्डियों और lamboid टांका (मस्तिष्क और सेरिबैलम के बीच सीमा) के अंदरूनी भाग पर पार्श्व चीरा द्वारा पीछा किया ।
      2. का उपयोग संदंश को मोड़ने के लिए हर तरफ खोपड़ी खोलो. कपाल नसों मस्तिष्क के ventral पक्ष के तहत एक गोल, तेज रंग डालने से मस्तिष्क से काट रहे है और धीरे से रंग बाद में ले जा ।
    3. एक एकल किनारे उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए एक कोरोनरी कट rostral सेरिबैलम ।
      नोट: यह कटौती उस कोण को निर्धारित करेगी, जिस पर स्लाइसें काटी गई हैं. यह चाहिए, इसलिए, एक सीधे कोण पर बनाया जाना चाहिए ।
    4. मस्तिष्क को खोपड़ी से बाहर पलटें और विच्छेदन मध्यम से युक्त एक छोटी पेट्री डिश में ।
    5. दोहराएँ चरण 1.6.1.-1.6.4. for पशु #2 और एक दूसरे पेट्री पकवान में इस मस्तिष्क जगह है ।
      नोट: जानवरों बाँझ नहीं हैं । डाकू के एक तरफ विच्छेदन प्रदर्शन और फिर दूसरे के लिए कदम, साफ पक्ष एक बार दिमाग खोपड़ी से हटा दिया गया है ।
    6. बदल दस्ताने.
    7. vibratome स्टेज के लिए मस्तिष्क लगायेंगे: घुड़सवार agarose जेल के सामने सिर्फ मंच के लिए सुपर गोंद की एक पतली परत जोड़ें । मस्तिष्क #1 के साथ एक बड़े फ्लैट रंग के साथ पकड़ हौसले से कट (caudal) ओर रंग और ventral पक्ष का सामना करना पड़ (और के रूप में संभव के रूप में बंद के रूप में जा रहा है) agarose जेल ।
      1. फिर धीरे से गोंद पर यह धक्का से मस्तिष्क जगह संदंश का एक सेट के साथ रंग । मस्तिष्क #2 के लिए पर्याप्त जगह छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें.
        नोट: यह दिमाग अच्छी तरह से मंच से जुड़े हुए हैं कि महत्वपूर्ण है, लेकिन अत्यधिक गोंद के बिना, इस काटने बाधा कर सकते हैं.
    8. मस्तिष्क #1 के बढ़ते तुरंत बाद, मस्तिष्क के शीर्ष पर विच्छेदन मध्यम की कुछ बूँदें जोड़ने के लिए बड़े रंग का उपयोग करें । इससे दिमाग नम रहेगा, गोंद सख्त होगा और उसे दिमाग के किनारों से चिपकने से रोका जा सकेगा.
    9. दोहराएँ चरण 1.6.7 और 1.6.8. for मेंदू #2.
    10. vibratome नाव पर मंच लगायेंगे.
  7. कट २३० & #181; एम मोटी राज्याभिषेक स्लाइसें के एक आयाम के साथ 1-१.५ mm, ८५ हर्ट्ज की एक आवृत्ति और ०.२ mm के एक वेग/s. लगभग १.४ mm rostral और २.१ mm caudal के बीच स्लाइस लीजिए Bregma.
    1. प्रत्येक स्लाइस ओपन-एंड ग्लास पिपेट (pt. १.१) का उपयोग करके काट दिया गया है के बाद स्लाइसें इकट्ठा । विच्छेदन मध्यम से युक्त एक पेट्री डिश के लिए स्लाइस हस्तांतरण । स्लाइस को दो टुकड़ों में काटकर, दो गोलार्द्धों को विभाजित करने के लिए एक गोल स्केलपेल का प्रयोग करें ।
  8. जब सभी स्लाइस काट रहे हैं, जगह स्लाइस संस्कृति व्यंजन में ।
    1. संस्कृति पकवान ले (समय में एक) मशीन से बाहर ।
    2. खुले अंत गिलास पिपेट का उपयोग कर, ध्यान से कंफ़ेद्दी में से प्रत्येक के लिए एक टुकड़ा हस्तांतरण ।
      नोट: स्लाइस को कंफ़ेद्दी के बीच में सपाट रखना चाहिए । यह कुछ कौशल की आवश्यकता है । हालांकि, अगर कुछ स्लाइसें सही नहीं हैं, यह उंहें छोड़ने के लिए समय बिताने की तुलना में उंहें स्थानांतरित करने की कोशिश कर के रूप में यह महत्वपूर्ण है के रूप में तेजी से संभव के रूप में मशीन में सभी स्लाइसें प्राप्त करने के लिए बेहतर है ।
    3. एक गिलास पिपेट (नुकीले छोर) का उपयोग करने के लिए धीरे टुकड़ा छूने के बिना अधिक माध्यम से हटाने के लिए ।
      नोट: स्लाइस को मशीन के दौरान लिक्विड में नहीं डुबोया जाना चाहिए । इस प्रकार, अतिरिक्त माध्यम aspirated ऐसी है कि स्लाइस हवा को उजागर कर रहे है होना चाहिए (मध्यम की एक पतली फिल्म अभी भी स्लाइस को कवर किया जाएगा) । स्लाइस कि तरल में डूबे रहने आमतौर पर अस्वस्थ हो जाएगा या मरो (4 और हमारी टिप्पणियों).
    4. मशीन में वापस पकवान चाल एक बार सभी कंफ़ेद्दी एक टुकड़ा है ।
    5. दोहराएँ चरण 1.7.8.-1.8.4. for डिश #2.
  9. संस्कृति माध्यम बदल.
    नोट: यह टुकड़ा करने की क्रिया के बाद दिन किया जाना चाहिए (इन विट्रो, DIV1 में 1 दिन) और फिर हर 2-3 दिन ।
    1. एक पानी स्नान या मशीन में कचौरी संस्कृति माध्यम.
      2. एक बाँझ डाकू में
    2. , वैक्यूम चूषण का उपयोग करें या एक नियमित पिपेट एक बाँझ टिप के साथ महाप्राण संस्कृति माध्यम के लिए एक अच्छी तरह से. यह धीरे पकवान tipping द्वारा किया जाता है (के बारे में 30 डिग्री) और संस्कृति डालने के किनारे पर पिपेट टिप रखकर ।
    3. निकालें लगभग ८०० & #181; L को एक अच्छी तरह से (बस काफी माध्यम को सम्मिलित करने के लिए मध्यम में कवर के नीचे रखने के लिए छोड़). फिर, एक साफ पिपेट का उपयोग करते हुए, जोड़ें ८०० & #181; एल के पूर्व गरम मध्यम से प्रत्येक अच्छी तरह से । फिर बर्तन वापस सेल संस्कृति मशीन में जगह ।
< p class = "jove_title" > 2. Viral Transduction

  1. खरीद या मेक AAVs प् याज का प्लाज्मिड, जैसा कि पहले बताया गया है < सुप class = "xref" > 10 , < सुप class = "xref" > 11 .
    नोट: यह प्रोटोकॉल dsred बुनियादी प्रोटीन प्रमोटर के GFP नियंत्रण के तहत एक रिपोर्टर जीन के रूप में mitochondrial लक्षित transcriptional या myelin ले जाने AAV सीरोटाइप 2/8 (AAV 2/8) के उपयोग का वर्णन करता है < सुप वर्ग = "xref" > १२ (AAV2/८ MBP_mito_dsred या AAV2/ ८ MBP_mito_GFP) ते कल्पना oligodendrocyte mitochondria. जनरल सीएजी प्रवर्तक (AAV 2/8 CAG_GFP या AAV 2/8 CAG_tdtomato) द्वारा संचालित रिपोर्टर जीन के रूप में GFP या tdtomato को ले AAV 2/8 को oligodendrocyte कोशिका की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रकार, AAV 2/8 CAG_GFP के साथ AAV2/8 MBP_mito_dsred का संयोजन mitochondria में लाल कोशिका और हरी oligodendrocytes देता है, जबकि AAV2 के संयोजन/8 MBP_mito_GFP और AAV 2/8 CAG_tdtomato हरे mitochondria और लाल कोशिका देता है । कहीं और अधिक विस्तार से वर्णन किया जाता है < सुप वर्ग = "xref" > १३ .
  2. पर दिन 7 इन विट्रो (DIV7), transduce oligodendrocytes with AAVs.
    चेतावनी: AAVs के साथ काम करने के लिए सुरक्षा नियमों का पालन करें । सुनिश्चित करें कि उचित प्रशिक्षण और सुरक्षा स्तर की स्वीकृति आवश्यक है । सभी निंनलिखित बिंदुओं को एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा दस्ताने और लैब कोट का उपयोग कर कैबिनेट में किया जाना चाहिए । यहां, AAV के प्रांतस्था क्षेत्र के लिए आवेदन के स्लाइस का वर्णन किया गया है, के रूप में यह क्षेत्र है कि सबसे अच्छा वसूली से पता चलता है ।
    1. पूर्व में AAV को पतला करना (३७ & #176; ग) कल्चरल मीडियम. चारों ओर कमजोरियां 2 & #215; 10 9 जीनोम प्रतियां/एमएल (GC/एमएल) oligodendrocytes के एक विरल transduction जो स्लाइस के भीतर एकल कोशिकाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है पाने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । हालांकि, एक पायलट अलग titers का उपयोग करने transduced oligodendrocytes कि विशिष्ट प्रयोगों के लिए उपयुक्त है की एक घनत्व सुनिश्चित किया जाना चाहिए । यदि दो अलग AAVs का उपयोग किया जाता है, वे एक ही समाधान में मिलाया जाना चाहिए और एक साथ टुकड़ा करने के लिए जोड़ा ।
    2. के आसपास जोड़ें १.३ & #181; L पतला प्रत्येक स्लाइस करने के लिए AAV: सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप के बाहर सूखी है । पिपेट १.३ & #181; L पतला AAV और प्रांतस्था के ऊपर पिपेट पकड़, पिपेट टिप (लगभग 1 मिमी दूर) के साथ स्लाइस को छूने के बिना संभव के रूप में बंद.
    3. फिर धीरे पिपेट से बाहर समाधान धक्का । जब समाधान स्लाइस को छूता है, तो पूरे प्रांतस्था क्षेत्र पर समाधान फैलाने के लिए पिपेट टिप को प्रांतस्था पर ले जाएं ।
      नोट: इस प्रक्रिया के रूप में उपवास के रूप में संभव के रूप में आवश्यक से अधिक समय के लिए हुड से बाहर स्लाइस रखने से बचने के लिए किया जाना चाहिए । समय पर एक डिश पर यह मत करो और पहली डिश #2 डिश पर शुरू करने से पहले वापस मशीन में डाल दिया । ऊतक को नुकसान पहुँचाए बिना AAV का एक संतोषजनक वितरण पाने के लिए कुछ अभ्यास और एक स्थिर हाथ की आवश्यकता है ।
  3. यदि एक ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप सेल लैब में उपलब्ध है, तो प्रोटीन एक्सप्रेशन को माइक्रोस्कोप के तहत डिश में रखकर कल्चर में समय के दौरान चेक किया जा सकता है ।
    नोट: पकवान से अधिक 2-5 मिनट के लिए मशीन के बाहर नहीं रखा जाना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 3. समय-चूक इमेजिंग

< p class = "jove_content" > नोट: इमेजिंग किया जा सकता है जब भी फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति का स्तर पर्याप्त है और स्लाइसें स्वस्थ देखो (आमतौर पर DIV11-14) ।

  1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप, छिड़काव और हीटिंग को सही ढंग से सेट किया गया है ताकि बुलबुला इमेजिंग समाधान गर्म हो और प्रवेश कर सके और नहाने से बाहर निकल सके ।
    नोट: विभिन्न समाधान स्नान कक्षों के लिए मौजूद हैं । एक सरल संस्करण यहां प्रस्तुत किया है ।
    1. में और कुंद सिरिंज सुइयों द्वारा स्नान के आउटलेट बनाने के लिए (तुला पर ~ ४५ & #176;) कि blu द्वारा स्नान के पक्षों से जुड़े रहे है-कील/
    2. यह सुनिश्चित करना है कि टयूबिंग लगातार bubbled इमेजिंग समाधान की एक बोतल से चला जाता है, सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से, हीटर इकाई के हीटिंग ट्यूब के माध्यम से, और फिर स्नान में प्रवेश सिरिंज सुई के लिए ।
    3. सिरिंज सुई आउटलेट के लिए एक और ट्यूब कनेक्ट । यह ट्यूब तो सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से चला जाता है और इमेजिंग समाधान की बोतल को वापस (या एक बेकार बोतल के लिए) ।
  2. बबल इमेजिंग सॉल्यूशन (recipe in reagents & #39; टेबल) विथ bioxide गैस.
    नोट: यह मी होना चाहिएइमेजिंग से पहले कम से rted 15 मिनट और प्रयोग के दौरान जारी रखें ।
  3. सिकुड़नेवाला पंप और हीटर पर बारी और स्नान के माध्यम से समाधान चलाने के लिए इष्टतम स्नान तापमान प्राप्त करने के लिए (३७ & #177; ०.५ & #176; ग). सुनिश्चित करें कि तापमान इकाई से जुड़ा थर्मामीटर संवेदक स्नान समाधान में जलमग्न हो गया है ।
  4. माइक्रोस्कोप, प्रतिदीप्ति लैंप और उपयुक्त पराबैंगनीकिरण पर बारी ।
  5. नमूना के लिए एक उपयुक्त प्रकाश पथ की स्थापना की ।
    नोट: यह माइक्रोस्कोप सेटअप और जांच के आधार पर भिंन होगा । कैसे फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए की सामान्य ज्ञान की आवश्यकता है और यहाँ से निपटा नहीं किया जाएगा ।
  6. उचित आवर्धन और संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ एक जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें । हम एक 40x जल विसर्जन योजना-apochromat उद्देश्य (एनए १.०) का उपयोग करें ।
  7. ओपन pinhole लगभग 2-२.५ के ऑप्टिकल सेक्शन हासिल करने के लिए & #181; मी समय चूक वीडियो के लिए । यह समय चूक के दौरान ध्यान से बाहर जा mitochondria की घटना कम कर देता है ।
  8. ट्रान्सफर organotypic स्लाईस टू बाथ:
    1. एक छोटे प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए इमेजिंग समाधान या संस्कृति माध्यम की एक बूंद जोड़ें ।
      2. एक बाँझ डाकू में
    2. , बाँझ संदंश का उपयोग करने के लिए ड्रॉप करने के लिए झिल्ली डालने से एक organotypic टुकड़ा हस्तांतरण. संदंश को केवल कंफ़ेद्दी को छूना चाहिए और न कि स्लाइस.
    3. को पेट्री डिश पर ढक्कन लगा दें.
    4. तुरंत संस्कृति मशीन में वापस स्लाइस के बाकी युक्त पकवान डाल दिया ।
    5. माइक्रोस्कोप के लिए स्लाइस युक्त पेट्री डिश लाने के लिए.
    6. सिकुड़नेवाला पंप बंद है, जबकि माइक्रोस्कोप स्नान के लिए टुकड़ा स्थानांतरित । सबसे पहले, स्नान के शीर्ष करने के लिए पेट्री डिश से स्लाइस के साथ कंफ़ेद्दी लिफ्ट करने के लिए संदंश का उपयोग करें (कंफ़ेद्दी नाव होगा) । इसके बाद कंफ़ेद्दी के हर तरफ संदंश के दो नुस्खे रखें ताकि वे स्लाइस को छूने के बिना कंफ़ेद्दी को स्पर्श करें, और नहाने के नीचे के हल के माध्यम से कंफ़ेद्दी को धकेलें । मध्य में कंफ़ेद्दी को स्नान कराएं ।
    7. का उपयोग संदंश को कंफ़ेद्दी के शीर्ष पर रखने के लिए, स्लाइस को छुए बिना, होल्ड-डाउन एंकर (वीणा) पर लगाएं ।
      नोट: एक वीणा एक घोड़े की नाल के आकार का प्लैटिनम लंगर कि तैर या स्नान में बहती से टुकड़ा को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है । तीव्र स्लाइस के लिए, पतली तार वीणा के एक तरफ से दूसरे के लिए चला (एक संगीत वीणा जैसी) । organotypic स्लाइस के लिए, वीणा और इस तरह से कंफ़ेद्दी के आकार फिट है कि यह टुकड़ा छूने के बिना कंफ़ेद्दी के शीर्ष पर रखना कर सकते हैं ।
    8. टर्न सिकुड़नेवाला पंप बॅक ऑन.
  9. नमूना नीचे उद्देश्य कम ।
  10. छवि के लिए कक्ष और क्षेत्र का चयन करें ।
    नोट: लेजर प्रकाश को कोशिकाओं के अत्यधिक जोखिम से बचने के रूप में यह सेल विषाक्तता का कारण बन सकता है (नीचे अंक में सुझाव देखें) ।
    1. सही अभिव्यक्ति के साथ एक स्वस्थ दिखने oligodendrocyte खोजने के लिए eyepieces और फ्लोरोसेंट लैंप का उपयोग करें । आमतौर पर, oligodendrocytes कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक मजबूत एक्सप्रेस अस्वस्थ दिखाई देते हैं । अस्वस्थ oligodendrocytes एक blobby उपस्थिति के साथ प्रक्रियाओं होगा, और mitochondria खंडित दिखाई देगा । स्वस्थ oligodendrocytes में, सोमा और प्रक्रियाओं चिकनी दिखाई देते हैं और mitochondria विभिन्न लंबाई है (हालांकि आम तौर पर बहुत कम न्यूरॉन्स और astrocytes < सुप वर्ग = "xref" > १३ , < सुप वर्ग = "xref" > १४ , < सुप वर्ग = "xref" > १५ ).
    2. को देखने के क्षेत्र के बीच में ब्याज की कोशिका पर रखें.
    3. उपयोग & #34; live & #34; सॉफ़्टवेयर में फ़ंक्शन (Leica और जीस माइक्रोस्कोप्स के लिए) स्क्रीन पर कक्ष की पहचान करना और रुचि का क्षेत्र चुनना, उदा., कक्ष का एक भाग जिसमें कई प्राथमिक प्रक्रियाएँ या myelin आवरण शामिल हों, या एक एकल प्रक्रिया या myelin म्यान 
      नोट: संभव के रूप में प्रक्रियाओं/आवरण के रूप में ज्यादा के रूप में छवि में सक्षम हो, प्रक्रियाओं है कि एक्स-y दिशा में अपेक्षाकृत फ्लैट रखना युक्त क्षेत्रों का चयन करें ।
    4. ब्याज के क्षेत्र में ज़ूम (आमतौर पर ०.१४ के पिक्सेल आकार के साथ एक छवि का निर्माण-०.३० & #181; m).
    5. का उपयोग कर & #34; क्षेत्रको & #34; उपकरण, क्षेत्र के चारों ओर एक आयत आरेखित करें और केवल चयनित क्षेत्र को स्कैन करने का विकल्प चुनें । स्कैनिंग समय, और इस प्रकार लेजर जोखिम, केवल चयनित क्षेत्र स्कैनिंग से कम है.
      नोट: क्षैतिज आयताकार क्षेत्रों की जरूरत है स्कैन लाइनों की कम संख्या के कारण ऊर्ध्वाधर क्षेत्रों की तुलना में तेजी से स्कैन किया जाएगा । यदि किसी अनुलंब आयत क्षेत्र को स्कैन किया जाता है, तो स्कैन समय को ९० अंश (घुमाव उपकरण का उपयोग करके) को रोटेट करके घटाया जा सकता है ।
  11. लेजर शक्ति को समायोजित करने और लाभ mitochondria पर एक अच्छा दृश्य प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: न्यूनतम लेजर शक्ति की जरूरत का उपयोग करें । यदि संभव हो, लेजर शक्ति बढ़ाने के बजाय लाभ की बारी है । कोशिका विषाक्तता के कारण के अलावा, बहुत उच्च लेजर पावर ब्लीच समय के साथ imaged वस्तुओं होगा, इस प्रकार स्कैनिंग के दौरान लेजर शक्ति या लाभ की एक और वृद्धि की आवश्यकता होती है । आवश्यक लेजर शक्ति और लाभ अभिव्यक्ति के स्तर और माइक्रोस्कोप पर निर्भर करेगा । एक LSM700 फोकल माइक्रोस्कोप के साथ, हम 20-40 & #181 की शक्ति पर एक ५५५ एनएम लेजर का उपयोग करें, छवि dsred या tdtomato के लिए डब्ल्यू और एक ४८८ एनएम लेजर 20-30 & #181 पर प्रयोग किया जाता है; w to छवि GFP (लेजर शक्ति उद्देश्य के पीछे एपर्चर पर मापा) । लाभ लाइव इमेजिंग के लिए उच्च सेट है, आमतौर पर ७००-८०० के लिए GFP और 850-980 dsred और tdtomato के लिए की सीमा में । उच्च लाभ कुछ अधिक पृष्ठभूमि शोर, डिजिटल ऑफ़सेट (ऑफ़सेट मान सामांयतया 0 और 15 के बीच रखना) को बढ़ाने से निकाल दिया गया है कारण हो सकता है । हमारे अनुभव में, MBP_mito_GFP का उपयोग कर एक बेहतर संकेत MBP_mito_dsred से शोर देता है ।
  12. स्कैन गति का चयन करें.
    नोट: एक तेजी से स्कैनिंग की गति का उपयोग करके और एक छोटे से स्कैनिंग क्षेत्र ड्राइंग द्वारा स्कैनिंग समय को कम (नीचे बिंदु 4.10.5 देखें). यह भी एक द्वि-दिशा स्कैन करने से स्कैनिंग समय को बचाने के लिए संभव है । हालांकि, यह गरीब छवि गुणवत्ता के कारण अनुशंसित नहीं है ।
  13. सेट आवृत्ति और समय चूक रिकॉर्डिंग की अवधि, उदाहरण पर कब्जा छवियों oligodendrocytes में mitochondrial इमेजिंग के लिए 20 मिनट की कुल के लिए हर 2 सेकंड.
    नोट: आवृत्ति और अवधि ब्याज की वस्तुओं की गतिशीलता के अनुसार सेट किया जाना चाहिए । एक उच्च आवृत्ति अधिक लेजर प्रकाश करने के लिए नमूना बेनकाब होगा, लेकिन तेजी से चलती वस्तुओं भी समय की एक छोटी कुल अवधि की आवश्यकता-चूक वीडियो ( उदाहरण के लिए न्यूरॉन्स में mitochondria, जो अधिक बार कदम और mitochondria से एक बहुत उच्च गति में oligodendrocytes, आम तौर पर 2 मिनट की कुल के लिए हर सेकंड छवि है < सुप क्लास = "xref" > 16 ).
  14. समय-चूक रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें ।
    नोट: mitochondria से बाहर ले जा सकते है फ़ोकस और/या छवि क्षेत्र से बाहर रिकॉर्डिंग के दौरान बहाव । कंपन और आंदोलन को कम करने के लिए, में और स्नान के आउटलेट को समायोजित करने और अगर जरूरत पंप गति को कम । फोकस में छोटे परिवर्तन आमतौर पर अभी भी हो । इस प्रकार, इमेजिंग के दौरान स्क्रीन की सतत निगरानी की आवश्यकता है, रिकॉर्डिंग के दौरान ध्यान के छोटे समायोजन के साथ.
  15. सेल और छवि की प्रक्रिया की भविष्य की पहचान के लिए पूरे सेल के एक z-पोट पर कब्जा ।
    नोट: बेहतर रिज़ॉल्यूशन के लिए, pinhole को z-स्टैक के लिए 1 हवादार इकाई पर रीसेट किया जाना चाहिए.
  16. वै: टयूब दाग myelin.
    नोट: oligodendrocytes transduced के साथ (cytoplasmic) GFP में, myelin म्यानों को आमतौर पर कोशिका (cytoplasmic लकीरें) एक प्राथमिक प्रक्रिया से जुड़ा (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ए और बी) की सीधी रेखाओं के रूप में पहचाना जा सकता है । हालांकि, अगर GFP अभिव्यक्ति बहुत कमज़ोर है या एक cytoplasmic मार्कर का उपयोग नहीं किया जाता है, तो यहां समझाए गए अनुसार फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी (कोर) द्वारा myelin म्यान की कल्पना करना संभव है ।
    1. ४८८ एनएम पर लेजर उत्तेजना के साथ सॉफ्टवेयर में एक नया प्रकाश पथ सेट और एक ही तरंग दैर्ध्य, जैसे 470-500 एनएम के आसपास उत्सर्जित प्रकाश पर कब्जा ।
    2. लेजर शक्ति और लाभ समायोजित जब तक myelin दिखाई है (< मजबूत वर्ग में उदाहरण देखें = "xfig "> चित्रा 3 ). एक LSM ५१० मेटा माइक्रोस्कोप का प्रयोग, हम आम तौर पर 7 की एक लेजर शक्ति का उपयोग करें-& #160; 12 & #181; W (उद्देश्य के पीछे एपर्चर पर मापा) ।
  17. वै: immunostaining. के लिए स्लाइस की तैयारी
    1. यदि imaged कक्ष immunostaining के बाद पहचाना जाना चाहिए, तो कक्ष की एक कम आवर्धन छवि (10x) कैप्चर करें और छवि में एक तीर या समान आरेखित करके उसके स्थान को इंगित करें । सेल का पता लगाने के लिए, यह भी पूरे टुकड़ा का एक मैनुअल नक्शा आकर्षित करने के लिए सिफारिश की है, सेल के स्थान का संकेत है ।
    2. कमरे के तापमान में 1 घंटे के लिए शेखर पर 4% paraformaldehyde (पीएफए) में स्लाइस फिक्स ।
      सावधानी: पीएफए हानिकारक है । सुरक्षात्मक पहनते है और केवल एक हवादार डाकू में उपयोग का उपयोग करें ।
      3. पंजाब में
    3. पतला निर्धारण 1:10 और 4 & #176 पर छोड़ दें; ग जब तक शुरू immunohistochemistry के रूप में कहीं और वर्णित < सुप class = "xref" > 17 .
      नोट: हालांकि स्लाइस कई हफ्तों के लिए पतला निर्धारण में छोड़ा जा सकता है, प्रतिदीप्ति फीका हो सकता है । निर्धारण के 10 दिनों के भीतर immunohistochemistry प्रदर्शन की सिफारिश की है.

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Representative Results

Organotypic मस्तिष्क स्लाइसें कि संस्कृति और transduced थे ऊपर वर्णित के रूप में cortical oligodendrocytes व्यक्त mito_dsred और GFP के एक विरल वितरण दिखाया । Olig2 और MBP के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ Immunostaining की पुष्टि की है कि अभिव्यक्ति oligodendrocytes के लिए विशिष्ट था (चित्रा 1).

लाइव इमेजिंग के लिए, transduced oligodendrocytes समानांतर में चल रहे कई myelin आवरण की उनकी विशेषता आकृति विज्ञान द्वारा पहचाना गया (चित्र 1 और चित्र 2a) । transduced oligodendrocytes पर समय-चूक इमेजिंग प्रदर्शन करके, यह प्राथमिक प्रक्रियाओं और myelin म्यानों में mitochondria के आंदोलन की निगरानी करने के लिए संभव है (चित्र बी-डी).

कम GFP अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं में, myelin म्यान लाइव इमेजिंग के दौरान ४८८ एनएम पर नमूना रोशन और उत्सर्जित प्रकाश ४७०-५०० एनएम (चित्रा 3) द्वारा पहचाना जा सकता है । इस फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी (कोर) तकनीक भी पीएफए निश्चित और immunostained ऊतक पर काम किया, हालांकि myelin आवरण dimmer (चित्र बी-सी) दिखाई दिया । myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostaining करके, हमने पाया है कि इमेजिंग विमान के लिए क्षैतिज बिछाने myelin म्यानों के १००% के करीब (ऐरोहेड द्वारा संकेत दिया, चित्र बी-सी) कोर के साथ दिखाई दे रहे हैं, जबकि myelin म्यान यह देखने के क्षेत्र के लिए सीधा करना (तारों से संकेत मिलता है, चित्र बी-सी) कम या बिल्कुल नहीं दिखाई दे रहे हैं । हालांकि लगभग सभी नोड visualized हैं, कई नोड है प्रकट नहीं किया जा रहा म्यान के छोटे भागों के साथ, सतत, दिखाई (चित्र 3 / myelin में इन छोटे "अंतराल" तीन पूरक तरंग दैर्ध्य, तथाकथित स्कोर9के साथ इमेजिंग द्वारा में भरा जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 : Immunohistochemistry पुष्टि करता है कि MBP-मिळो-dsred चुनिंदा oligodendrocytes कि Olig2 और MBP के लिए प्रतिरक्षा सकारात्मक है में व्यक्त की है ।  छवियां (AAV2/8) MBP-मिळो-dsred (लाल, mitochondrial मार्कर) और सीएजी-GFP (ग्रीन, cytosol) के साथ transduceded माउस मस्तिष्क स्लाइस के neocortex से कर रहे हैं । स्लाइस myelin मार्कर myelin बुनियादी प्रोटीन के लिए immunolabeled थे (MBP, नीला) और Olig2 (oligodendrocyte वंश कोशिका परमाणु मार्कर, रानी). (संख्या संदर्भ से संशोधित आंकड़ा13) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : oligodendrocytes में mitochondrial आंदोलन को ट्रैक करने के लिए समय-चूक इमेजिंग । (क) oligodendrocyte transduced के MBP_mito_dsred (red mitochondria) और CAG_GFP (green प्रतिदीप्ति) के साथ जेड-टैक (ऑप्टिकल सेक्शन १०.३५ µm) का प्रोजेक्शन. (B) एक ही कक्ष की एकल फोकल छवि (ऑप्टिकल अनुभाग १.०४ µm) । वर्ग समय-चूक इमेजिंग (C) के लिए चयनित किया गया था जो क्षेत्र इंगित करता है और (D) में kymographs (वतनी) बनाने के लिए आरेखित रेखाएँ इंगित किए गए हैं । (ग) एक और बी में सेल की समय चूक रिकॉर्डिंग से छवियां अलग समय अंक पर लिया । मूविंग mitochondria (लाल तीर) दर्शाया गया है । (D) (B) में इंगित की गई पथ से Kymographs । स्टेशनरी mitochondria को सीधी अनुलंब रेखाओं के रूप में देखा जाता है और चलती mitochondria तिरछी रेखाओं के रूप में देखी जाती हैं. के रूप में kymographs में देखा जा सकता है, और समय में पाठ्यक्रम छवियों में (ग), केवल प्राथमिक Kymograph 1 (वतनी 1) के रूप में चिह्नित प्रक्रिया में mitochondria जा रहे हैं । अंय तीन kymographs में mitochondria समय चूक रिकॉर्डिंग के दौरान स्थिर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : myelin से सना हुआ के दृश्य को फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी (कोर) । (क) z-पोट (ऑप्टिकल सेक्शन १०.३५ µm) का प्रोजेक्शन एक जीवित organotypic मस्तिष्क स्लाइस के neocortex से. यहां दर्शाए गए oligodendrocyte में GFP व्यंजक (ग्रीन सेल बॉडी) प्राथमिक प्रक्रियाओं और myelin म्यानों की पहचान के लिए बहुत मंद है । इसके बजाय, myelin म्यान ४८८ एनएम पर उत्तेजना द्वारा visualized और ४७०-५०० एनएम पर उत्सर्जित प्रकाश कैप्चरिंग थे (रानी में दिखाया गया है) । GFP + oligodendrocyte के कुछ कोशिका-रिच paranodes को myelin नोड (तीरों) के सुझावों पर देखा जा सकता है । संमिलित करें: myelin म्यान के बढ़ाया भाग से पता चलता है कि myelin कोर के साथ visualized प्रकट होता है "patched" या सतत (विवरण के लिए मुख्य पाठ देखें) । (B-C) striatum (ख) और हिप्पोकैंपस CA1 की परत radiatum (सी) के एक तीव्र माउस मस्तिष्क टुकड़ा है कि 4% पीएफए में तय किया गया है और immunostained बुनियादी प्रोटीन (myelin) के लिए MBP से फोकल छवियां । Horisontal myelin म्यान (ऐरोहेड) कोर के साथ दिखाई दे रहे हैं, जबकि आवरण है कि देखने के क्षेत्र के लिए सीधा कर रहे है (तारक) सबसे अक्सर दिखाई नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

organotypic संस्कृतियों बनाने के लिए प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक संशोधित संस्करण डी सिमौनी और यू द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के18 है (२००६)5। सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन नीचे उल्लिखित किया गया है । Tris बफर संस्कृति माध्यम है, जो जब वायरल transduction और सेल माध्यम के बदलने के दौरान मशीन के बाहर स्लाइस के अस्तित्व में सुधार करने के लिए जोड़ा गया है । कंफ़ेद्दी के लिए नसबंदी प्रक्रिया भी बदली है । जबकि अंय प्रोटोकॉल autoclaving द्वारा कंफ़ेद्दी निष्फल, हम यह सिफारिश नहीं है क्योंकि यह कंफ़ेद्दी के कई कारण को कर्ल होगा । इन पर हो स्लाइस के रूप में कर्ल्ड कंफ़ेद्दी का उपयोग करने से बचें कम स्वस्थ हो जाते हैं । हमारे प्रोटोकॉल चूहों का उपयोग करता है, नहीं चूहों, और संस्कृति प्रांतस्था के बजाय हिप्पोकैंपस, जो हम पतले स्लाइस (२३० µm बनाम ३०० µm) के साथ अच्छी तरह से काम करता है खोजने के लिए संशोधित किया गया है । चूहों और चूहों में प्रसव दिवस 10-20 के आसपास myelination चोटियों के रूपमें19, p7 पर चूहों से बनी संस्कृतियों-9 (और फिर 11-14 दिनों के लिए प्रसंस्कृत) myelinating oligodendrocytes का अध्ययन करने के लिए इष्टतम हैं. इन विट्रो में 11-14 दिनों में, संस्कृतियों कॉंपैक्ट myelin आवरण के साथ कई परिपक्वoligodendrocytes13 होते हैं । युवा चूहों से बनी संस्कृतियों संस्कृति अवधि के अंत में कम परिपक्व oligodendrocytes होते हैं, जबकि बड़े चूहों से बनी संस्कृतियों को और अधिक चुनौतीपूर्ण स्वस्थ20रखने के लिए दिखाया गया है.

organotypic स्लाइस बनाने की प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं । विच्छेदन और दिमाग के बढ़ते, साथ ही कंफ़ेद्दी पर स्लाइस रखने, तेजी से किया जाना चाहिए और कुछ कौशल की आवश्यकता है । आमतौर पर, organotypic स्लाइस संस्कृतियों बनाने में पहला प्रयास कम सफल रहे हैं, लेकिन अभ्यास के 2-3 दौर स्वस्थ संस्कृतियों बनाने के लिए आवश्यक कौशल प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । यह प्रक्रिया में एक बाँझ वातावरण रखने के लिए संस्कृतियों के संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, जब जीवित कोशिकाओं के साथ काम कर रहे, यह हमेशा के लिए सही पीएच और समाधान के परासरणीयता सुनिश्चित करने के लिए सेल स्वास्थ्य बनाए रखने के लिए अनिवार्य है । यह है, इसलिए, परासरणीयता जांच करने के लिए एक अच्छी सलाह है (270-310 mOsm/किग्रा) और सभी समाधानों का pH जो स्लाइस पर उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से पहली बार प्रयोग करने पर । संस्कृति और organotypic संस्कृतियों के लिए विच्छेदन समाधान एक पीएच संकेतक (phenol लाल) होते हैं, लेकिन संस्कृति माध्यम में पीले सीरम वास्तविक पीएच से कम की एक छाप दे सकते हैं । संस्कृति माध्यम में संक्रमण की संभावना को कम करने के लिए पेनिसिलिन, Streptomycin, और Nystatin शामिल हैं । इसलिए यह इन एंटीबायोटिक दवाओं और antimycotics जब लैब में organotypic टुकड़ा संस्कृति तकनीक की स्थापना का उपयोग करने की सिफारिश की है, लेकिन वे बाद में जब विशेषज्ञ रोकनेवाला तकनीक लागू किया जाता है बचा जा सकता है । वर्तमान प्रोटोकॉल कक्ष की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए कक्ष आकृति विज्ञान का उपयोग करता है । एक और अधिक मात्रात्मक परीक्षा के लिए, स्लाइसें propidium आयोडाइड या समान रंगों के साथ लोड किया जा सकता है जैसा कि21कहीं वर्णित है । हालांकि, यह पता होना जरूरी है कि propidium आयोडाइड के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम dsred, tdtomato और अंय लाल संकेतकों के साथ ओवरलैप । propidium आयोडाइड और इसी तरह के रिएजेंट की एक और सीमा है कि वे आसानी से टुकड़ा की गहरी परतों में प्रवेश नहीं करते हैं, इस प्रकार कोशिकाओं की शीर्ष परत के लिए सेल व्यवहार्यता के आकलन को सीमित5।

जीन डिलिवरी के लिए कई तरह के तरीके मौजूद हैं । organelles कल्पना करने के लिए organotypic स्लाइस संस्कृतियों के AAV transduction का उपयोग करने का मुख्य लाभ इस प्रकार हैं: AAV transduction गैर के साथ तुलना में postmitotic oligodendrocytes के लिए एक बेहतर सफलता दर-वायरल अभिकर्मक तरीकों22है । इसके अलावा, organotypic संस्कृतियों में सभी मस्तिष्क कोशिका प्रकार मौजूद हैं, और oligodendrocytes एक के समान आकृति विज्ञान है कि vivo मेंदेखा, कॉम्पैक्ट myelin13सहित. यह monoculture में oligodendrocytes से अलग है, जो axons के साथ संचार की कमी है, और इस तरह कॉंपैक्ट myelin नहीं बनाते हैं । विट्रो में इमेजिंग आसान है vivo में के साथ तुलना में और एक बेहतर स्थानिक संकल्प है, जो विशेष रुचि का है प्रदान करता है जब इमेजिंग छोटे organelles जैसे mitochondria. फ्यूचर रिसर्च वीवो मेंइमेज का लक्ष्य होगा, लेकिन लिपिड से भरपूर myelin म्यान के कारण होने वाले ऑप्टिकल वाकया से एक बड़ी चुनौती का सामना करना पड़ेगा । इसके अलावा, AAV सीरोटाइप tropism और प्रमोटर विशिष्टता vivo में और इन विट्रो शर्तों13,23के बीच अलग हो सकता है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में AAV2/8 MBP_mito_dsred और AAV2/8 MBP_mito_GFP को oligodendrocyte mitochondria की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । AAV सीरोटाइप 2/1 भी MBP_mito_dsred के साथ परीक्षण किया गया था लेकिन organotypic स्लाइस में oligodendrocytes की एक कम संख्या संक्रमित (नहीं दिखाया गया है) । AAV2/8 CAG_GFP और AAV2/8 CAG_tdtomato को oligodendrocyte कोशिका की कल्पना करते थे । इस के लिए जनरल सीएजी प्रमोटर का उपयोग करने के बावजूद, AAV 2/8 CAG_GFP और CAG_tdtomato चुनिंदा संक्रमित oligodendrocytes, केवल astrocytes और न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या के साथ संक्रमित किया जा रहा (इन आसानी से उनकी विशेषता आकृति विज्ञान द्वारा पहचाना जा सकता है). oligodendrocytes के लिए यह selectivity संभवतः AAV 2/8 सीरोटाइप24के tropism के कारण हुआ है । हालांकि, organelle-लक्षित अभिव्यक्ति के लिए, उच्च कोशिका-MBP-या अन्य oligodendrocyte-विशिष्ट प्रवर्तकों के साथ प्राप्त विशिष्टता की सिफारिश की है । अंय serotypes हमारे द्वारा CAG_GFP के साथ परीक्षण किया गया AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, जिनमें से ज्यादातर संक्रमित मुख्य रूप से ंयूरॉंस और astrocytes (नहीं दिखाया गया है) ।

निर्माण और प्रायोगिक शर्तों के आधार पर सेल transduction के संशोधन की जरूरत होगी । transduced कक्ष बहुत मंद दिखाई देते हैं, तो अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए transduction के बाद इन विट्रो में एक लंबा समय का प्रयास करें । यदि कोशिकाएं चमकदार लेकिन अस्वस्थ दिखाई देती हैं तो transduction के बाद समय को कम करें । यदि बहुत कम कोशिकाएं transduced हैं तो AAV की एकाग्रता बढ़ाई जा सकती है । हालांकि, यह भी संभव है कि transduction के बाद इन विट्रो में समय बहुत लंबा है और transduced कोशिकाओं की मृत्यु हो गई है । यहां इस्तेमाल किया निर्माण के लिए, अभिव्यक्ति का स्तर इष्टतम 4-6 दिनों के बाद transduction थे । transduction के बाद 7-8 दिनों में, कोशिकाओं blobby प्रक्रियाओं के साथ कम स्वस्थ दिखाई दिया, और transduction के बाद 10 दिनों, केवल कुछ transduced कोशिकाओं दिखाई (नहीं दिखाया गया) थे.

इस प्रोटोकॉल organotypic स्लाइस की लाइव इमेजिंग के लिए एक ईमानदार खुर्दबीन का उपयोग करता है । यह सबसे मोनो से अलग है और सह संस्कृतियों है कि आम तौर पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें । यह यहां एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए इष्टतम है, क्योंकि स्लाइस तो ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कंफ़ेद्दी के साथ दिया जाना चाहिए, जो संभवतः स्लाइसें कम स्वस्थ होने का कारण बनता है. ईमानदार खुर्दबीन का एक लाभ के लिए सेटअप करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जोड़ने की संभावना है । इसके अलावा, एक पंप के उपयोग के लिए माध्यम बदलने का मतलब है कि दवा समाधान आसानी से जोड़ा जा सकता है और समय चूक इमेजिंग के दौरान हटा दिया । पंप के साथ एक नुकसान की समस्याओं के स्नान में कंपन और धाराओं के कारण ध्यान बनाए रखने है । माइक्रोस्कोप के तहत, धीरे-धीरे कम हो जाएगा कोशिकाओंस्वस्थ. इसलिए हम 1 घंटे की एक अधिकतम के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइस रखने के लिए । imaged स्लाइसें दूर फेंक रहे है (विशेष अपशिष्ट) । सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग की स्थिति इष्टतम हैं, नियंत्रण कोशिकाओं की इमेजिंग, जिसमें mitochondrial आंदोलन पहले से ही अच्छी तरह से विशेषता है, समानांतर में चलाया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, axons या dendrites में mitochondrial आंदोलन AAV 2/1 Syn_mito_dsred के साथ transducing स्लाइस द्वारा imaged किया जा सकता है (जिसमें dsred अभिव्यक्ति ंयूरॉन द्वारा संचालित है विशिष्ट synapsin प्रमोटर) या AAV 2/1 CAG_mito_dsred (के बाद immunostaining सेल पहचान की पुष्टि) । mitochondrial आंदोलन का विश्लेषण ImageJ में एकाधिक kymograph उपकरण का उपयोग किया जा सकता है के रूप में25कहीं और वर्णित है ।

यहाँ हम लाइव इमेजिंग के दौरान दाग myelin के दृश्य के लिए कोर का वर्णन. स्कोर9, जो तीन उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करता है के साथ तुलना में, कोर केवल एक (४८८ एनएम) का उपयोग करता है और इस तरह लागू करने के लिए सरल है । स्कोर में, तीन तरंग दैर्ध्य प्रत्येक myelin म्यान के अलग "टुकड़े" प्रकट और एक साथ म्यान की एक पूरी छवि दे । इसके अलावा, स्कोर cytoplasmic जेब जैसे myelin म्यान संरचनाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कोर में इस्तेमाल एक तरंग दैर्ध्य के साथ, एक कम विस्तृत दृश्य दिया जाता है और खोल दानेदार या लगातार प्रकट हो सकता है (छवि 3). फिर भी, कोर myelin आवरण के १००% है कि देखने के क्षेत्र में क्षैतिज है के पास visualizes । इस प्रकार, कोर myelin आवरण का पता लगाने के लिए उपयोगी है, लेकिन myelin संरचनाओं या अखंडता के विश्लेषण के लिए नहीं है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

हम लिंडा Hildegard Bergersen और सेल लैब और उपकरण, Janelia आणविक जीवविज्ञान प्लाज्मिड और वायरस के उत्पादन और कोएन वर्वेके लेजर शक्ति माप के साथ सहायता के लिए के लिए संसाधन कर्मचारी साझा करने के लिए उपयोग के लिए Bjørås मागणार धंयवाद । यह काम नार्वे स्वास्थ्य संघ, नार्वे अनुसंधान परिषद और सूक्ष्म उपकरण द्वारा वित्त पोषित किया गया Norbrain द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२८ समय चूक oligodendrocytes organotypic लाइव इमेजिंग mitochondria transduction adeno-जुड़े वायरस myelin फोकल चिंतनशील माइक्रोस्कोपी
दृश्य और Organotypic मस्तिष्क Adeno-जुड़े वायरस और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइस में Oligodendrocyte Organelles के लाइव इमेजिंग
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Kennedy, L. H., Rinholm, J. E.… More

Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

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