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Chemistry

Chitosan आधारित इंजेक्शन Hydrogels और 3 डी सेल संस्कृति में अपने आवेदन की तैयारी

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56253
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1The Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Department of Chemistry, Tsinghua University, 2Institute of Chemical Materials, China Academy of Engineering Physics

Summary

यहाँ हम गतिशील िमीन रसायन का उपयोग कर chitosan आधारित इंजेक्शन hydrogels की एक सतही तैयारी का वर्णन. hydrogel के यांत्रिक शक्ति और 3 डी सेल संस्कृति में अपने आवेदन को समायोजित करने के तरीके प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Abstract

प्रोटोकॉल गतिशील िमीन रसायन का उपयोग कर chitosan-आधारित hydrogels तैयार करने के लिए एक सतही, कुशल, और बहुमुखी विधि प्रस्तुत करता है । hydrogel एक संश्लेषित benzaldehyde समाप्त बहुलक gelator के साथ ग्लाइकोल chitosan के समाधान के मिश्रण से तैयार है, और hydrogels कुशलतापूर्वक कमरे के तापमान पर कई मिनट में प्राप्त कर रहे हैं । ग्लाइकोल chitosan, बहुलक gelator, और जल सामग्री के बीच अनुपात अलग करके, विभिंन जमाना बार और कठोरता के साथ बहुमुखी hydrogels प्राप्त कर रहे हैं । क्षतिग्रस्त होने पर, hydrogel अपने दिखावे और मापांक को ठीक कर सकता है, crosslinkages के रूप में गतिशील िमीन बांड के reversibility के कारण । यह स्व-चंगा संपत्ति hydrogel इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद से यह स्व-निचोड़ा टुकड़े से एक अभिंन थोक hydrogel को चंगा किया जा सकता है के लिए सक्षम बनाता है । hydrogel भी कई जैव सक्रिय गतिशील िमीन बांड के विभिंन equilibration स्थितियों के कारण उत्तेजनाओं के लिए बहु उत्तरदाई है । इस hydrogel के रूप में पुष्टि की थी जैव संगत, और L929 माउस fibroblast कोशिकाओं मानक प्रक्रियाओं के बाद एंबेडेड थे और सेल प्रसार आसानी से एक 3d सेल खेती की प्रक्रिया द्वारा मूल्यांकन किया गया था । hydrogel अलग अनुसंधान के लिए एक समायोज्य मंच की पेशकश कर सकते हैं, जहां कोशिकाओं के लिए एक 3 डी वातावरण की एक शारीरिक नकल लाभ है । अपनी बहु के साथ उत्तरदायी, आत्म चंगा, और इंजेक्शन गुण, hydrogels संभावित भविष्य में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में दवाओं और कोशिकाओं के लिए कई वाहक के रूप में लागू किया जा सकता है.

Introduction

Hydrogels पानी और नरम यांत्रिक गुणों की बड़ी मात्रा के साथ crosslinked बहुलक सामग्री रहे हैं, और वे कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है1,2। Hydrogels एक नरम और गीला वातावरण की पेशकश कर सकते हैं, जो बहुत vivo मेंकोशिकाओं के लिए शारीरिक परिवेश के समान है । इसलिए, hydrogels 3 डी सेल संस्कृति3,4के लिए सबसे लोकप्रिय पाड़ों में से एक बन गए हैं । 2d पेट्री डिश सेल संस्कृति की तुलना में, 3 डी सेल संस्कृति जल्दी से उंनत किया है एक extracellular मैट्रिक्स (ECM) की पेशकश करने के लिए कोशिकाओं से संपर्क करें और प्रसार और भेदभाव प्रयोजनों के लिए इकट्ठा करने के लिए microenvironment नकल उतारा5। इसके अतिरिक्त, प्राकृतिक पॉलिमर युक्त hydrogels जैव संगत और कोशिकाओं के लिए पैदा और अंतर3के लिए वातावरण को बढ़ावा देने की पेशकश कर सकता है । Hydrogels सिंथेटिक पॉलिमर से व्युत्पंन उनके सरल और स्पष्ट घटकों, जो पशु मूल प्रोटीन या वायरस की तरह जटिल प्रभावों को बाहर करने के लिए पसंद कर रहे हैं । 3 डी सेल संस्कृति, hydrogels है कि आसानी से तैयार कर रहे है और एक सुसंगत संपत्ति है के लिए सभी hydrogel उंमीदवारों के बीच हमेशा पसंद कर रहे हैं । सुविधा के लिए hydrogel के गुणों को समायोजित करने के लिए विभिंन अनुसंधान आवश्यकताओं फिट के रूप में अच्छी तरह से6महत्वपूर्ण है ।

यहां हम एक ग्लाइकोल chitosan आधारित गतिशील िमीन रसायन विज्ञान, जो 3 डी सेल संस्कृति7के लिए एक बहुमुखी hydrogel मंच बन जाता है का उपयोग hydrogel के एक सतही तैयारी परिचय । इस विधि में, hydrogel के नेटवर्क के फ्रेम स्थापित करने के लिए प्रसिद्ध जैव-संगत ग्लाइकोल chitosan का उपयोग किया जाता है । इसके एमिनो समूहों बहुलक gelator के रूप में एक benzaldehyde समाप्त पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ प्रतिक्रिया कर रहे है crosslinkages के hydrogels के रूप में गतिशील िमीन बांड के रूप में8। गतिशील िमीन बांड फार्म और reversibly और उत्तरदायी परिवेश को विघटित कर सकते हैं, यांत्रिक समायोज्य crosslinked नेटवर्क के साथ hydrogels endowing9,10,11. अपने उच्च जल सामग्री, जैव संगत सामग्री, और समायोज्य यांत्रिक शक्तियों के कारण, hydrogel सफलतापूर्वक 3 डी सेल संस्कृति12,13में L929 कोशिकाओं के लिए एक पाड़ के रूप में लागू किया जाता है । यहां प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं का विवरण, बहुलक gelator संश्लेषण सहित, hydrogel तैयारी, सेल embedding, और 3 डी सेल संवर्धन ।

hydrogel भी अपनी बहु सहित अपने गतिशील िमीन crosslinkages के कारण कई अंय सुविधाओं से पता चलता है, विभिंन जैव उत्तेजनाओं (एसिड/पीएच, विटामिन बी-6 व्युत्पंन pyridoxal, प्रोटीन papain, आदि) के लिए उत्तरदाई है, यह दर्शाता है कि hydrogel हो सकता है शारीरिक परिस्थितियों के तहत विघटित करने के लिए प्रेरित8। hydrogel भी आत्म-चंगा और इंजेक्शन है, जिसका अर्थ है hydrogel एक न्यूनतम इनवेसिव इंजेक्शन विधि के माध्यम से administrated जा सकता है और दवा और सेल प्रसव में एक लाभ प्राप्त14,15. कार्यात्मक additives या विशिष्ट डिजाइन बहुलक gelators जोड़कर, hydrogel चुंबकीय, तापमान, पीएच उत्तरदायी, आदि16,17 है, जो पूरा कर सकता है जैसे विशिष्ट गुणों को पाने के लिए संगत है अनुसंधान आवश्यकताओं की व्यापक रेंज । उन गुणों hydrogel की क्षमता को उजागर करने के लिए दवाओं और दोनों विट्रो में और vivo में जैव चिकित्सा अनुसंधान और अनुप्रयोगों में कोशिकाओं के लिए एक इंजेक्शन एकाधिक वाहक हो ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सावधानी: कृपया उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) देखें । एक धुएं डाकू और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, सुरक्षात्मक दस्ताने, लैब कोट, आदि ) के उपयोग सहित रसायन विज्ञान प्रयोगों, जब प्रदर्शन उचित सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग करें । प्रोटोकॉल मानक सेल हैंडलिंग तकनीक (बंध्याकरण, सेल रिकवरी, सेल passaging, सेल ठंड, सेल धुंधला, आदि ) की आवश्यकता है ।

< p class = "jove_title" > 1. Hydrogels

  1. के संश्लेषण की तैयारी benzaldehyde समाप्त di-कार्यात्मक पॉलीथीन ग्लाइकोल (DF खूंटी)
    1. खूंटी बहुलक सुखाना
        के पूर्व
      1. वजन ४.०० ग्राम खूंटी (मेगावाट ४,०००, १.०० mmol), यह एक गोल नीचे कुप्पी (२५० मिलीलीटर) में स्थानांतरण, और टोल्यूनि (१०० मिलीलीटर) जोड़ें ।
        नोट: विभिन्न आणविक भार के साथ अन्य खूंटे hydrogel गठन के लिए काम कर सकते हैं, लेकिन अलग कठोरता के लिए नेतृत्व करेंगे.
      2. हीट गन (या एक गर्म प्लेट के आसपास ४० & #176; ग) हल्के से सभी पॉलिमर को भंग करने में मदद करने के लिए समाधान गर्मी । सभी पॉलिमर भंग करने के बाद, सभी सॉल्वैंट्स को दूर करने के लिए एक वाष्पक का उपयोग करें । सूखे खूंटी पॉलिमर बनाने के लिए इस भंग और सूखी प्रक्रिया को दो बार दोहराएँ.
        चेतावनी: यह चरम देखभाल के साथ एक धुएं डाकू में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । टोल्यूनि ज्वलनशील है ।
    2. Benzaldehyde की समाप्ति प्रतिक्रिया खूंटी
      1. एक चुंबकीय सरगर्मी और tetrahydrofuran (THF, १०० एमएल) कुप्पी और एक सरगर्मी का उपयोग खूंटी भंग करने के लिए जोड़ें । 4-carboxybenzaldehyde (०.९० g, ६.० mmol) और 4-dimethylaminopyridine (०.०७ g, ०.६ mmol) को क्रमिक रूप से समाधान के लिए सभी ठोस पूरी तरह से भंग करने के लिए जोड़ें ।
      2. add n, n & #39;-dicyclohexylcarbodiimide (डीसीसी, १.२५ g, ६.० mmol) समाधान के लिए, और एक सुखाने ट्यूब कि निर्जल CaCl 2 से कुप्पी तक भर जाता है जोड़ें । कमरे के तापमान पर सरगर्मी के तहत प्रतिक्रिया रखें (~ 20 & #176; C) लगभग 12 ज.
        3. के लिए
    3. पश्चात प्रतिक्रिया प्रक्रिया
      1. प्रतिक्रिया समाप्त होने के बाद निर्वात द्वारा समाधान में उत्पन्न सफेद ठोस बाहर फ़िल्टर. सफेद ठोस वेग को तेज करने के लिए ठंड diethyl ईथर (५०० एमएल) में समाधान डालो । फ़िल्टर द्वारा सभी सफेद ठोस इकट्ठा और एक धुएं हुड में ठोस सूखी ।
      2. THF में सफेद ठोस फिर से भंग, किसी भी अघुलनशील सफेद ठोस बाहर फिल्टर, ताजा ठंड diethyl आकाश में समाधान डालने के लिए सफेद ठोस वेग, और यह शुष्क । इस प्रक्रिया को दो से तीन बार दोहराएँ, और फिर सफेद ठोस एक वैक्यूम सुखाने ओवन में जगह (20 & #176; C, ०.१ mbar) उन्हें पूरी तरह से सूखने के लिए. अंतिम उत्पाद के रूप में सफेद पाउडर इकट्ठा: benzaldehyde समाप्त DF खूंटी.
  2. की तैयारी hydrogels
    1. के विभिन्न मात्रा में वजन DF खूंटी (०.११ g, ०.०२८ mmol; ०.२२ g, ०.०५५ mmol; ०.४४ g, ०.११० mmol) एक ट्यूब (10 मिलीलीटर) में, पानी (५.० मिलीलीटर), और एक भंवर या चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग करने में मदद जोड़ें बहुलक.
      2. भंग
    2. भंग ग्लाइकोल chitosan (०.४९५ जी, ६.१८ x 10 -3 mmol) में एक ट्यूब (५० मिलीलीटर) में जल (१५.० मिलीलीटर), और कुछ मिनट के लिए एक भंवर का उपयोग करने के लिए homogenize chitosan समाधान (3 wt%).
    3. जोड़ें ग्लाइकोल chitosan समाधान (०.२ मिलीलीटर, 3 wt%) और DF खूंटी समाधान (०.२ मिलीलीटर) क्रमिक रूप से एक ट्यूब (२.० एमएल) में । समाधान homogeneously मिश्रण करने के लिए एक भंवर का उपयोग करने के लिए कई मिनट में hydrogels फार्म । अलग यांत्रिक शक्तियों के hydrogels बनाने के लिए तालिका 1 में अनुपात का पालन करें ।
      नोट: hydrogel पहले से ही बनाई गई है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए ट्यूब-पलटना विधि का उपयोग करें ।
  3. Rheology िरा
    1. एक समानांतर स्टील प्लेट (व्यास: 20 मिमी) के साथ एक घूर्णन Rheology पर rheometer िरा बाहर ले । जमाना परीक्षण के लिए, प्रसार ग्लाइकोल chitosan समाधान (०.२ मिलीलीटर, 3 wt%) एक कम प्लेट पर । फिर, DF खूंटी जलीय समाधान जोड़ें (०.२ मिलीलीटर, 2 wt%) समान रूप से chitosan समाधान सतह पर dropwise और जल्दी से एक पिपेट के साथ मिश्रण । ऊपरी प्लेट नीचे कम और परीक्षण शुरू करते हैं ।
    2. For hydrogel & #39; s कठोरता परीक्षण, एक सर्कल में एक hydrogel कट (व्यास: 20 मिमी) और भंडारण मापांक (G & #39;) मूल्यों बनाम आवृत्ति विश्लेषण पर 1% तनाव । ठेठ G & #39; मान पर ६.३ रड s & #8722; 1 तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं ।
      नोट: hydrogel.
      3. के गतिशील बांड स्थिरीकरण सुनिश्चित करने के लिए hydrogel गठन के बाद hydrogel ०.५ एच के rheology विश्लेषण बाहर ले
    3. के लिए hydrogel & #39; एस स्व-चंगा संपत्ति परीक्षण, टुकड़ों को एक hydrogel में कटौती और टुकड़ों को एक साथ इकट्ठा करने के लिए स्वयं एक अभिंन टुकड़ा चंगा । फिर एक चक्र बनाने के लिए hydrogel टुकड़ा काट (व्यास: 20 मिमी) और rheology विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए rheometer पर डाल दिया.
< p class = "jove_title" > 2. Hydrogels में 3डी सेल की खेती

  1. तयारी करण्याचा hydrogel जमाना समाधान
    1. वजन DF (०.४४ g, ०.११ mmol) बाँझ ट्यूब (४.० मिलीलीटर) में, सेल संस्कृति मीडिया में जोड़ें (RPMI-१६४०, २.० एमएल), और एक भंवर या सरगर्मी का उपयोग करने के लिए बहुलक को भंग करने में मदद बहुलक समाधान प्राप्त करने के लिए (20 wt%) । एक सिरिंज (१०.० मिलीलीटर) में समाधान लोड और फिर इसे एक माइक्रोन बैक्टीरिया के माध्यम से गुजर द्वारा निष्फल-निरोधक फ़िल्टर (०.२२ & #181; m).
    2. वजन ग्लाइकोल chitosan (०.१६५ g, २.०६ x 10 -3 mmol) एक बाँझ ट्यूब (१५.० एमएल) में, सेल संस्कृति मीडिया में जोड़ें (RPMI-१६४०, ४.० मिलीलीटर), और ग्लाइकोल chitosan समाधान प्राप्त करने के लिए बहुलक भंग करने में मदद करने के लिए भंवर (४.० wt%). एक सिरिंज (१०.० मिलीलीटर) में समाधान लोड और एक ०.२२ & #181 के साथ फिल्टर; एम बैक्टीरिया-निरोधी फिल्टर.
  2. कोशिका खेती मे hydrogels
    सावधानी: एक ऊतक संस्कृति हूड में सभी सेल संबंधित प्रक्रियाओं प्रदर्शन । बाँझ तकनीक की बुनियादी ज्ञान की उंमीद है । सेल सस्पेंशन की तैयारी
      1. संस्कृति L929 कोशिकाओं में RPMI-१६४० मध्यम 10% FBS के साथ पूरक, एक पेट्री डिश में 5% पेनिसिलिन (10 मिलीलीटर) (व्यास 10 सेमी), और ३७ पर मशीन & #176; C, 5% सह 2 . उपयोग करने से पहले मध्यम हर दिन बदलें ।
      2. फसल के साथ L929 कोशिकाओं trypsin (०.०२५ w/v%) और EDTA (०.०१% डब्ल्यू/वी), तो केंद्रापसारक (७० x जी, 5 मिनट) और RPMI-१६४० मध्यम (१.० एमएल) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । रक्त गिनती बोर्ड के मानक संचालन का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन । कोशिकाओं को पुन: निलंबित कक्ष एकाग्रता को समायोजित करने के लिए ~ ३.७५ & #215; 10 6 कक्ष/एमएल.
    2. सेल encapsulation in hydrogels
      1. मिक्स L929 सेल सस्पेंशन (०.४ एमएल, ३.७५ x 10 6 सेल एमएल -1 ) के साथ एक ट्यूब (४.० एमएल) में ग्लाइकोल chitosan सॉल्यूशन (०.४ एमएल) के साथ भंवर द्वारा । पिपेट L929/ग्लाइकोल chitosan समाधान (०.८ एमएल) एक फोकल पेट्री डिश के केंद्र में (व्यास २.० सेमी) । पिपेट एक ही डिश में DF खूंटी समाधान (०.२ मिलीलीटर), और धीरे समाधान मिश्रण करने के लिए पिपेट और hydrogel गठन प्रेरित ।
        नोट: पेट्री डिश को झुकाकर hydrogel गठन का आकलन करें.
        2. सीधे सेल संस्कृति के लिए
      2. , hydrogel के शीर्ष पर RPMI-१६४० संस्कृति मीडिया (१.० एमएल) की अतिरिक्त मात्रा जोड़ें । कक्ष एंबेडेड hydrogels (१.० मिलीलीटर रखो, १.५ wt% ग्लाइकोल chitosan, ४.० wt% DF खूंटी, १.५ & #215; 10 6 कोशिकाओं एमएल -1 ) एक मशीनी में (३७ & #176; सी, 5% कं 2 ) और मीडियम को हर दिन चेंज कर दीजिये । सेल encapsulation के बाद 1, 3, 5, और 7 दिन पर सेल इमेजिंग के लिए तैयार करें ।
    3. के लिए 3 डी सेल पोस्ट संस्कृति hydrogels में इंजेक्शन के बाद, एक सिरिंज (१०.० मिलीलीटर, ४८ जी सुई) में सेल भरी हुई hydrogel (१.० एमएल, देखो कदम -8) तैयार. hydrogel रूपों के बाद, hydrogel धीरे एक पेट्री डिश में फोकल इमेजिंग के लिए सुई । hydrogel के शीर्ष पर संस्कृति मीडिया (१.० एमएल) की एक अतिरिक्त राशि जोड़ें और हर दिन इसे बदल जाते हैं । एक मशीन में पेट्री पकवान रखो (३७ & #176; सी, 5% कं 2 ) और बाद में इमेजिंग के लिए तैयार करते हैं ।
      चेतावनी: कृपया जांच करें और एक सिरिंज के सुरक्षा ऑपरेशन प्रोटोकॉल का पालन करें ।
  3. कोशिका व्यवहार्यता विश्लेषण
    1. फोकल अवलोकन
      1. दो बार के लिए (१.० एमएल) पंजाबियों के साथ hydrogels कुल्ला । Fluorescein diacetate के साथ hydrogels दाग (एफडीए, ०.५ एमएल, ०.०५ मिलीग्राम/एमएल) और propidium आयोडाइड (PI, ०.५ एमएल, ०.०८ मिलीग्राम/ दाग के बाद, सभी सॉल्वैंट्स निकालें ।
      2. ४८८ एनएम और ५४३ एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के तहत एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग hydrogels रहते है और मृत कोशिकाओं, क्रमशः कल्पना का पालन करें । हर 2 & #181 के माध्यम से z टैक् स ले; hydrogels की m गहराई भर कोशिकाओं के एक भी वितरण को मांय करने के लिए ।
        नोट: एफडीए दाग जीवित कोशिकाओं जबकि पीआई दाग मृत कोशिकाओं.
    2. hydrogel (१.० एमएल) के साथ एसिटिक एसिड (HAc, 3 वी%, १.० मिलीलीटर) के लिए 5 मिनट और एक ट्यूब (४.० मिलीलीटर) में पिपेट । (७० एक्स जी, 5 मिनट) और RPMI-१६४० सेल संस्कृति माध्यम (१.० एमएल) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित द्वारा प्रकोष्ठों लीजिए । एक रक्त गिनती बोर्ड का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन.

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Representative Results

hydrogel तैयारी पर इस प्रोटोकॉल और 3d सेल संस्कृति के रूप में इसके उपयोग के एक योजनाबद्ध प्रस्तुति चित्रा 1में की पेशकश की है । hydrogel की सामग्री और विभिंन यांत्रिक शक्तियों के साथ तैयार अनुपात की जानकारी तालिका 1में संक्षेप में है । hydrogel के स्व-चंगा और rheology संपत्ति में चित्रा 2में भंडारण मापांक बनाम आवृत्ति परीक्षण के द्वारा hydrogel की कठोरता प्रस्तुत करता है । सेल फोकल छवियों और hydrogels में संस्कृति के दिनों के साथ सेल संख्या चित्रा 3में प्रस्तुत कर रहे हैं, सेल व्यवहार्यता और 3 डी सेल संस्कृति के माध्यम से सेल प्रसार की पुष्टि. चित्रा 4 माइक्रोस्कोपी, फोकल छवियों, और hydrogels में एम्बेडेड कोशिकाओं के लिए सेल प्रसार दर का विश्लेषण प्रस्तुत करता है कि इंजेक्शन और बाद संस्कृति का सामना करना पड़ा । उच्च कोशिका व्यवहार्यता और सेल प्रसार से संकेत मिलता है कि hydrogel में एम्बेडेड कोशिकाओं कोई विनाशकारी नुकसान का सामना करना पड़ा और hydrogel के इंजेक्शन का संकेत है, संस्कृति के बाद से ठीक हो सकता है.

Figure 1
चित्र 1 : hydrogel और 3 डी सेल संस्कृति के रूप में इसके उपयोग की तैयारी । (क) Hydrogel तयारी; (B) कक्ष निलंबन की तैयारी; (ग) hydrogels में 3डी सेल कल्चर के साथ या बिना इंजेक्शन के । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Hydrogel कठोरता । हण मापांक G ' बनाम आवृत्ति (क) मूल और (ख) स्व-चंगा hydrogels । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : 3 डी hydrogel में सेल संस्कृति । (A) L929 कोशिकाओं की 3 डी फोकल छवियां कड़ी ताकत hydrogel में एंबेडेड (ग्रीन: लाइव सेल; लाल: मृत कोशिकाओं); (B) सेल encapsulation के बाद चिह्नित समय में hydrogel में एंबेडेड L929 कक्षों के कक्ष गणना परिणाम । स्केल बार = ३०० µm । डाटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : इंजेक्शन के बाद hydrogel में 3d सेल पोस्ट संस्कृति । (क) इंजेक्शन की एक योजनाबद्ध छवि और एक कोशिका के बाद की संस्कृति भरी हुई hydrogel. डालें: इंजेक्शन से पहले hydrogels में एंबेडेड कोशिकाओं की सूक्ष्म छवियां (बाएं) और बाद सेल के बाद संस्कृति 7 दिनों के लिए (मध्य और सही) । स्केल बार = १०० µm; (ख) एक कड़ी ताकत में एंबेडेड L929 कोशिकाओं के फोकल छवियों hydrogel और बाद इंजेक्शन के बाद संस्कृति (हरा: लाइव कोशिकाओं; लाल: मृत कोशिकाओं), स्केल बार = ३०० µm; (ग) encapsulation के बाद इंजेक्शन के साथ या बिना hydrogels में प्रसंस्कृत कोशिकाओं की प्रसार दर की तुलना । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत (संदर्भ से अनुकूलित12; कॉपीराइट © २०१७ Elsevier) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Hydrogel कठोरता नरम मध्यम कड़ा
ग्लाइकोल chitosan (mg) ६.६ ६.६ ६.६
DF खूंटी (mg) ४.४ ८.८ १७.६
बहुलक gelator सामग्री (wt%) 1 2 4
जल (एमएल) ०.४ ०.४ ०.४
Gelaion समय (min) ७.५ 5 ३.५
छ ' (पा)* ९०० २१०० ४७००
* एक घूर्णन rheometer पर एक समानांतर प्लेट (व्यास 20 मिमी) का उपयोग कर आवृत्ति ६.३ रेड एस-1, तनाव 1% के तहत परीक्षण किया ।

तालिका 1: विभिंन यांत्रिक शक्तियों के साथ तैयार hydrogels की जानकारी ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत hydrogel (चित्रा 1) दो मुख्य घटक है: प्राकृतिक बहुलक ग्लाइकोल chitosan और एक सिंथेटिक benzaldehyde समाप्त बहुलक gelator DF खूंटी, जो दोनों ही संगत सामग्री हैं । संश्लेषण की DF खूंटी एक एक कदम संशोधन प्रतिक्रिया का उपयोग कर प्रस्तुत किया है. आणविक वजन ४,००० के खूंटी घुलनशीलता, संशोधन दक्षता, साथ ही hydrogel कठोरता की चिंताओं में इस प्रोटोकॉल में चुना गया था । विभिंन यांत्रिक शक्तियों के साथ hydrogels की एक श्रृंखला के विभिंन ठोस सामग्री और ग्लाइकोल chitosan और DF खूंटी के अनुपात का उपयोग कर तैयार किया गया । सजातीय hydrogels जल्दी से कमरे के तापमान के तहत जमाना समाधान मिश्रण द्वारा मिनट में गठन किया गया है, हालांकि जमाना गति भी समाधान पतला द्वारा धीमा सकता है । Rheology परीक्षण के लिए विभिंन hydrogels की यांत्रिक शक्तियों का मूल्यांकन कार्यरत था । उन hydrogels का भण्डारण moduli (G ') लगभग ९०० पा (सॉफ्ट), २,१०० pa (मीडियम) से ४,७०० pa (कड़ा) (तालिका 1 और चित्रा 2a) से अलग पाया गया । इस hydrogel नेटवर्क में अधिक बहुलक gelators जोड़कर उच्च crosslinking घनत्व के लिए योगदान दिया है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च भंडारण मापांक (अधिक कठोरता) । स्व-चंगा संपत्ति भी hydrogel के मापांक (चित्रा बी) की वसूली की पुष्टि की है. यह ज्ञात है कि ECM कठोरता विभिंन ऊतकों के लिए अलग है, इस प्रकार hydrogel समायोज्य यांत्रिक cues प्रदान कर सकता है और ग्लाइकोल chitosan और DF खूंटी बहुलक gelators18के बीच विभिंन अनुपात द्वारा विभिंन अनुसंधान आवश्यकताओं को पूरा ।

L929 कोशिकाओं, एक ठेठ माउस fibroblast सेल लाइन के साथ vivo पर्यावरण ऊतक कठोरता में ~ ५,६०० pa19, hydrogel में एंबेड किया जा करने के लिए एक सेल मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था । hydrogels में सेल encapsulation के बाद, यह आसानी से देखा जा सकता है कि hydrogels में कोशिकाओं अत्यंत उच्च व्यवहार्यता दिखाया (& #62; ९९%) संस्कृति प्रक्रिया में, chitosan आधारित hydrogel के उत्कृष्ट असंगति की पुष्टि । hydrogel में कोशिका घनत्व की एक उल्लेखनीय वृद्धि निहित है कि इस hydrogel L929 कोशिकाओं के प्रसार का समर्थन भी अतिरिक्त बिना वृद्धि कारकों (आंकड़ा 3ए) सकता है । hydrogel में संस्कृति में 7 दिनों के बाद, सेल संख्या ३००% बढ़ (चित्र 3 बी). यह सूचना दी है कि मचान में प्रसंस्कृत कोशिकाओं यांत्रिक cues20,21है, जो आगे इस 3 डी hydrogel संस्कृति विधि का उपयोग कर अनुसंधान संकेत हो सकता है अंतर सकता है ।

इंजेक्शन hydrogels के साथ कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने के लिए बहुत ही वितरण दक्षता और प्रत्यारोपित कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए अतुलनीय लाभ प्राप्त किया है14. एक गतिशील िमीन crosslinked नेटवर्क के भीतर, hydrogel इंजेक्शन के बाद स्वयं चंगा सकता है । स्व-चंगा संपत्ति hydrogel इंजेक्शन के लिए सक्षम बनाता है, जो इंजेक्शन एकाधिक वाहक के रूप में hydrogels के लिए संभावित अनुप्रयोगों का तात्पर्य । आगे इस hydrogel एक इंजेक्शन सेल वाहक के रूप में मूल्यांकन करने के लिए, एक इंजेक्शन नकल उतार और पोस्ट-संवर्धन प्रयोग किया गया था । सेल एंबेडेड hydrogel एक सिरिंज में भरी हुई थी और एक पेट्री डिश में एक ४८ जी सुई के माध्यम से बाहर निचोड़ा, एक 7 दिन के बाद सेल व्यवहार्यता और प्रसार दर के साथ संवर्धन प्रक्रिया का अध्ययन किया ।

के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया है, squished hydrogel टुकड़े आत्म चंगा करने के लिए 1 इंजेक्शन के बाद एच के बारे में एक एकीकृत hydrogel सुधार सकता है, जो सेल डिलीवरी में सहायक है । hydrogel में कोशिकाओं के लिए, जब छवि के साथ तुलना में बस encapsulation के बाद लिया (चित्रा 4a, छोड़ दिया), सेल घनत्व 7 दिनों के बाद नाटकीय रूप से वृद्धि हुई (चित्रा 4a, मध्य डालने) । बढ़े हुए दृष्टि में, एक और अधिक विस्तृत सेल-विखंडन प्रक्रिया जिसमें कुछ कोशिकाओं को दो में विभाजित किया जा करने के लिए पाया जाता है (चित्रा 4a, सही डालने), सीधे hydrogel में 3 डी सेल प्रसार द्वारा पुष्टि की । चित्रा 4B इंजेक्शन और बाद संस्कृति प्रयोग के बाद जीवित मृत सेल परख के फोकल छवियों से पता चलता है । इंजेक्शन कोशिकाओं का घनत्व एक उच्च कोशिका व्यवहार्यता के साथ स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई (& #62; ९९%), इंजेक्ट करने के बाद 3d hydrogel में सफल सेल प्रसार का प्रदर्शन । इंजेक्शन के साथ या इंजेक्शन के बिना hydrogels में सेल प्रसार दरों के लिए मात्रात्मक आँकड़े विश्लेषण की तुलना, सेल प्रसार दर प्रभावित किया है कि क्या जानने के लिए (चित्र 4c) प्रदर्शन किया गया था. इंजेक्शन के बाद सेल प्रसार दर, हालांकि थोड़ा कमी आई, एक उच्च स्तर (~ ७५%), और सेल संख्या में बने रहे १४५% hydrogel में संस्कृति में 7 दिनों के बाद अपेक्षाकृत वृद्धि हुई है, यह दर्शाता है कि इंजेक्शन के दौरान बाल काटना बल एक चौकस है सेल प्रसार पर सीमित नकारात्मक प्रभाव ।

हम इस hydrogel आवेदन की एक विशिष्ट प्रक्रिया का वर्णन किया, लेकिन शोधकर्ताओं ने विशिष्ट अनुसंधान आवश्यकताओं फिट करने के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित कर सकते हैं । बहुलक gelators hydrogel पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है और आसानी से परिवर्तनीय हैं । उदाहरण के लिए, इस hydrogel की कठोरता आसानी से ग्लाइकोल chitosan और DF खूंटी gelator के विभिंन अनुपात से हेरफेर किया जा सकता है । इस बीच अन्य आणविक भार का प्रयोग DF खूंटी भी इस लक्ष्य को पूरा कर सके । हम इस प्रोटोकॉल में खूंटी 4k इस्तेमाल किया, लेकिन 10k के लिए 2k खूंटी भी काम कर सकते हैं । अन्य खूंटे का उपयोग करते समय, यह जमाना बार और कठोरता विशेष रूप से निगरानी करने के लिए महत्वपूर्ण है. अंय कार्यात्मक बहुलक gelators भी काम कर सकते है अगर शोधकर्ताओं संश्लेषण कौशल विशिष्ट कार्यात्मक benzaldehyde-समाप्त पॉलिमर17तैयार करने के लिए है ।

इस प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, गतिशील संरचना के कारण, इस hydrogel की कठोरता एक आबंध बांड crosslinked hydrogel के साथ तुलना में सीमित है । एक मापांक डिजाइन के बहुत अधिक के साथ hydrogels तैयार करने के लिए विफलताओं का सामना कर सकते हैं । दूसरे, इस hydrogel जैव क्षरण, इस प्रकार hydrogel के भीतर दीर्घकालिक कोशिका संस्कृति सीमित है । तीसरे, hydrogel एक 3d crosslinked खेती पर्यावरण कि प्रसार चिंताओं है प्रदान करता है । तारीख करने के लिए, जैव विश्लेषण के अधिकांश 2d संस्कृति पर आधारित हैं । 3 डी संरचना आगे vivo अध्ययन में संबंधित सेल बाधा हो सकती है ।

जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, वहां कई महत्वपूर्ण चरणों का पालन कर रहे हैं । सबसे पहले, बहुलक gelator DF खूंटी के संश्लेषण के दौरान, निर्जलीकरण बहुत महत्वपूर्ण है । दूसरे, जब सेल से संबंधित प्रक्रियाओं, बाँझ आपरेशन प्रदर्शन महत्वपूर्ण है । तीसरे, धुंधला समय अच्छी तरह से hydrogels में नियंत्रित किया जाना चाहिए अच्छा फोकल छवियों को मिलता है ।

सारांश में, प्रोटोकॉल chitosan आधारित इंजेक्शन hydrogels, जो 3 डी सेल संस्कृति के लिए एक मंच के रूप में लागू कर रहे है और विभिंन शोध के लिए समायोज्य यांत्रिक cues पेशकश कर सकते है की एक सतही तैयारी शुरू की । यह पहले से ही दवा वितरण, सेल थेरेपी, और ट्यूमर कीमोथेरेपी, जो न केवल अपने प्रदर्शन के लिए एक वसीयतनामा है के बारे में क्षेत्रों में लागू किया गया है, लेकिन यह भी बायोमेडिकल एपी के लिए अपनी क्षमता बढ़ जाती हैplications ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (२१४७४०५७ और २१६०४०७६) ने समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycol chitosan Wako Pure Chemical Industries 39280-86-9 90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 619-66-9 99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 538-75-0 99%
Calcium chloride anhydrous Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 10043-52-4 96%
4-dimethylamiopryidine Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 1122-58 99%
Polyethyleneglycol Sino-pharm Chemical Reagent 5254-43-7 99%
Tetrahydrofuran Sino-pharm Chemical Reagent 109-99-9 99%
Toluene Sino-pharm Chemical Reagent 108-88-3 99%
Ethyl ether Sino-pharm Chemical Reagent 60-29-7 99%
Acetic acid Sino-pharm Chemical Reagent 64-19-7 99%
Anhydrous CaCl2 Sino-pharm Chemical Reagent 10043-52-4 99%
Fluorescein diacetate Sigma 596-09-8 99%
Propidium iodide  Sigma 25535-16-4 94%
RPMI-1640 culture media Gibco
Fetal bovine serum Gibco
Trypsin-EDTA Gibco 0.25%
PBS Solarbio 0.01 M
Penicillin streptomycin solution Hyclone 10,000 U/mL
Rheometer TA Instrument AR-G2
Confocal microscope Zeiss 710-3channel
L929 Cells ATCC NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator EYELA N-1100
48 guage needle ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD 48-guage
Microscope Leica DM3000 B
Microscope software Imaris
Heat gun Confu KF-5843 
Petri dish NEST

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References

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Chitosan आधारित इंजेक्शन Hydrogels और 3 डी सेल संस्कृति में अपने आवेदन की तैयारी
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Li, Y., Zhang, Y., Wei, Y., Tao, L.… More

Li, Y., Zhang, Y., Wei, Y., Tao, L. Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (127), e56253, doi:10.3791/56253 (2017).

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