Summary
Здесь мы описываем снисходительный подготовка на основе хитозана инъекционные гидрогели, с использованием динамических Имин химии. Представлены методы для регулировки гидрогеля механическую прочность и его применение в 3D клеточной культуры.
Abstract
Протокол представляет легким, эффективным и универсальным методом подготовить на основе хитозана гидрогели, с использованием динамических Имин химии. Гидрогель готовят путем смешивания растворов гликоля хитозана с gelator полимер синтезированных бензальдегида прекращено, и гидрогели эффективно получены в течение нескольких минут при комнатной температуре. На различные соотношения между гликоль хитозана, полимерные gelator и содержание воды получаются универсальный гидрогели с различными гелеобразования времена и скованность. Когда они повреждены, гидрогеля можно восстановить свои выступления и модуль упругости, благодаря обратимости динамических Имин облигаций как crosslinkages. Это самостоятельно обратимо свойство позволяет гидрогеля быть инъекционные, так как это может быть самостоятельной исцелил от сжал частей к неотъемлемой массовых гидрогеля после процесса впрыска. Гидрогель также мульти реагировать многих био активные стимулы за счет сбалансированности различных статусов динамических Имин облигаций. Этот Гидрогель был подтвержден как био совместимого и L929 клетки фиброцита мыши были встроенные следующие стандартные процедуры и пролиферации клеток легко оценивалась путем процесса выращивания 3D ячейки. Гидрогель может предложить регулируемые платформы для различных исследований, где прибыль физиологических мнемосхемы 3D среды для клеток. Наряду с его свойства мульти реагировать, самостоятельно обратимо и инъекционные гидрогели потенциально может быть применен как несколько перевозчиков наркотиков и клетки в будущем био медицинских приложений.
Introduction
Гидрогели, сшитых полимерных материалов с большим количеством воды и мягких механических свойств, и они были использованы в многих био медицинских приложений1,2. Гидрогели может предложить мягкой и влажной среде, которая очень похожа на физиологические окружение для клеток в естественных условиях. Таким образом гидрогели стали одним из самых популярных подмости для 3D клетки культуры3,4. По сравнению с 2D Петри клеточной культуры, 3D клеточной культуры выдвинул быстро предложить что внеклеточного матрикса (ECM) передразнил микроокружения клеток связаться и собрать для пролиферации и дифференцировки цели5. Кроме того гидрогели, содержащие полимеры природные может предложить био совместимых и содействие сред для клетки размножаются и дифференцировать3. Гидрогели на основе синтетических полимеров являются предпочтительными для их простые и ясные компонентов, исключающих комплекса воздействий как белки животного происхождения или вирусов. Среди всех кандидатов Гидрогель для 3D клеточной культуры гидрогели, которые легко приготовить и имеют последовательную свойства всегда являются предпочтительными. Возможность настроить свойства гидрогеля с учетом требований различных исследований имеет важное значение как хорошо6.
Здесь мы представляем снисходительный подготовка гликоль основе хитозана гидрогеля с использованием динамических Имин химии, которая становится универсальным гидрогеля платформой для 3D клетки культуры7. В этом методе известные био совместимого гликоль хитозана, используются для установления кадры гидрогеля сетей. Амино группы являются прореагировало с полиэтиленгликоля бензальдегида прекращено как полимер gelator сформировать динамический Имин облигации как crosslinkages гидрогелей8. Динамических Имин облигации может сформировать и разложить обратимо и ответственно к окружению, наделяя гидрогели с механически регулируемая высокоструктурированные сетей9,10,11. Благодаря своей высокой воды содержание, био совместимых материалов и регулируемые механических сильные гидрогеля успешно применяется в качестве лески для L929 клеток в 3D клетки культуры12,13. Протокол здесь детали процедуры, включая синтеза полимеров gelator, гидрогеля подготовку, клеток внедрение и культивирование 3D клеток.
Гидрогель также показывает ряд других особенностей, из-за его динамичный Имин crosslinkages, включая его мульти реагировать на различные био стимулы (кислоты/рН, витамин B6 производные пиридоксаль, папаин белков и т.д.), указав, что гидрогелевые может быть Индуцированная разложить в физиологических условиях8. Гидрогель также самостоятельно обратимо и инъекционные, что означает гидрогеля может быть управляются через минимально инвазивные инъекционный метод и получить преимущество в14,поставки наркотиков и ячейки15. Путем добавления функциональных добавок или конкретных предустановленных полимера gelators, гидрогеля совместим для получения определенных свойств как магнитные, температуры, рН реагировать, и т.д.16,17, который может выполнить широкий спектр исследовательских потребностей. Эти свойства показывают гидрогеля потенциал быть инъекционные несколько перевозчиков наркотиков и клетки как био медицинские исследования в пробирке и в естественных условиях , так и приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
внимание: пожалуйста, проконсультируйтесь с все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Пожалуйста, используйте соответствующие безопасности практики при выполнении химии экспериментов, в том числе использование вытяжного шкафа и средства индивидуальной защиты (защитные очки, защитные перчатки, лабораторный халат и т.д.). Протокол требует от стандартной ячейки обработки методов (стерилизации, восстановление клеток, клеток пассированый, замораживание клеток, окрашивание клеток, и т.д.).
1. Подготовка гидрогели
полимер- , синтез бензальдегида прекращено ди функционализированных полиэтиленгликоля (DF PEG)
- , Предварительная сушка PEG весят 4,00 g ПЭГ (4000 МВт, 1.00 ммоль), перевести его в колбу круглым дном (250 мл) и добавить толуола (100 мл).
Примечание: Другие колышки с различных молекулярных масс может работать для формирования гидрогеля, но приведет к различным жесткость. - Тепло решение тепловой пушки (или плита около 40 ° C) мягко помочь распустить все полимеры. После того, как распустить все полимеры, используйте испарителя для удаления всех растворителей. Повторите этот растворить и сухой процесс два раза чтобы сделать сушеные PEG полимеров.
Предупреждение: Это должно выполняться в Зонта с крайней осторожностью. Толуол легковоспламеняющиеся.
- , Предварительная сушка PEG весят 4,00 g ПЭГ (4000 МВт, 1.00 ммоль), перевести его в колбу круглым дном (250 мл) и добавить толуола (100 мл).
- Бензальдегида прекращение реакции PEG
- Добавить магнитную мешалку и тетрагидрофуран (THF, 100 мл) в колбу и распустить КОЛЫШЕК с помощью мешалкой. Добавить 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6,0 ммоль) и 4-dimethylaminopyridine (0,07 г, 0,6 ммоль) последовательно решения для полного растворения всех тел.
- Добавить N, N '-методы (DCC, 1,25 г, 6,0 ммоль) в решение и добавить сушки трубка, которая заполняется с безводный CaCl 2 в колбу. Держите реакции при помешивании при комнатной температуре (~ 20 ° C) для примерно в 12 ч.
- После реакции процесс
- Фильтр Белый тел, созданных в решении вакуум после завершения реакции. Залейте раствор в холодной диэтиловым эфиром (500 мл) при помешивании осадок белого вещества. Соберите все белые твердые фильтром и сухого вещества в вытяжной шкаф.
- Снова наплыв ТГФ белые твердые, отфильтровать любые нерастворимый белый тел, Залейте раствор в свежей холодной диэтиловом эфире ускорять белые твердые и высушите его. Повторите эту процедуру два или три раза и затем поместите белый тел в вакуумный сушильный шкаф (20 ° С, 0,1 мбар) полностью высохнуть. Собирать белый порошок как конечный продукт: бензальдегида прекращено DF PEG.
- , синтез бензальдегида прекращено ди функционализированных полиэтиленгликоля (DF PEG)
- Подготовка гидрогели
- весят различное количество DF ПЭГ (0,11 g, 0,028 ммоль 0,22 g, 0,055 ммоль; 0,44 g, 0,110 ммоль) в трубку (10 мл), Добавьте деионизированной воды (5,0 мл) и использовать вихревой или магнитной мешалкой, чтобы помочь распустить полимера.
- Распустить хитозана (0.495 g, 6.18 x 10 -3 ммоль) гликоля в деионизированной воде (15,0 мл) в трубку (50 мл) и использовать вихрь на несколько минут для однородный раствор хитозана (3 wt %).
- Добавить гликоль раствор хитозана (0,2 мл, 3 wt %) и DF PEG решения (0,2 мл) последовательно в трубку (2,0 мл). Используйте вихревой смешать решения однородно формы гидрогели в течение нескольких минут. Следовать за показатели в таблице 1 сделать гидрогели различных механических сильные.
Примечание: Используйте метод инвертирование трубки для определения ли уже сформировал гидрогеля.
- Анализ реология
- проводить анализы реология на вращения Реометр с параллельной стальной пластине (диаметр: 20 мм). Для испытания гелеобразования распространение гликоль раствор хитозана (0,2 мл, 3 wt %) на нижней пластине. Затем добавьте DF PEG водные растворы (0,2 мл, 2 wt %) равномерно каплям на поверхность раствор хитозана и смешать с пипеткой быстро. Ниже вниз верхнюю тарелку и начинают test.
- Для гидрогелевых ' s жесткости теста, вырезать Гидрогель в круг (диаметр: 20 мм) и измерить модуль хранения (G ') значения по сравнению с частоты анализов на 1% деформации. Типичный G ' значения в 6.3 rad s − 1, перечислены в таблице 1.
Примечание: Проведение реология анализа гидрогеля 0,5 ч после Гидрогель образования для обеспечения стабилизации динамических Бонд гидрогеля. - Для гидрогелевых ' s самостоятельно обратимо свойства теста, вырезать гидрогеля на куски и собрать куски self-heal неотъемлемой части. Затем вырежьте кусок гидрогеля, чтобы сделать круг (диаметр: 20 мм) и положил его на Реометр осуществлять анализ реологии.
2. 3D культивирования клеток в гидрогели
- приготовления растворов гелеобразования Гидрогель
- весят DF ПЭГ (0,44 g, 0,11 ммоль) в стерильную пробирку (4,0 мл), добавить в ячейку культуры СМИ (RPMI 1640, 2.0 Мл) и использовать вихревой или мешалкой помочь распустить полимеров для получения раствора полимера (20 wt %). Загрузите решение в шприц (10,0 мл) и затем стерилизовать его, передав его через фильтр бактерий цепкой микрон (0.22 мкм).
- Весят гликоль хитозана (0,165 g, 2.06 x 10 -3 ммоль) в стерильную пробирку (15,0 мл), добавить в ячейку культуры средств массовой информации (RPMI 1640, 4,0 мл) и вихрь помочь распустить полимеров для получения хитозана раствор гликоля (4,0 wt %). Загрузите решение в шприц (10,0 мл) и фильтр с помощью фильтра бактерии цепкой 0,22 мкм.
- Культивирования клеток в гидрогели
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: выполнить все ячейки, соответствующие процедуры в культуре ткани капюшоном. Ожидается, что базовые знания о стерилизации. Средний- приготовления суспензии клеток
- L929 культуры клеток в RPMI 1640 с 10% FBS, 5% пенициллин (10 мл) в Петри блюдо (диаметр 10 см) и инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2. Изменить каждый день перед использованием носителя.
- Урожая L929 клеток с PBS, содержащих трипсина (0,025% w/v) и ЭДТА (0.01% w/v), затем центрифуги (70 x g, 5 мин) и вновь приостановить клеток в среде RPMI 1640 (1.0 мл). Выполните подсчет клеток, с использованием стандартной операции крови Счетной комиссии. Вновь приостановить клетки для регулировки концентрации клеток до ~ 3,75 × 10 6 клеток/мл.
- Клеток инкапсуляции в гидрогели
- Mix L929 клеточных суспензий (0,4 мл, 3,75 х 10 6 клеток мл -1) раствором хитозана гликоль (0,4 мл) в трубку (4,0 мл), вихревой. Пипетка L929/гликоль раствор хитозана (0,8 мл) в центр конфокальный Петри (диаметр 2,0 см). Пипетка DF PEG решения (0,2 мл) в том же блюдо и осторожно Пипетка mix решение и заставить Гидрогель образования.
Примечание: Оценки формирования гидрогеля, наклоняя Петри. - Для прямой клеточной культуры, добавьте дополнительное количество RPMI 1640 культуры средств массовой информации (1.0 мл) на вершине гидрогеля. Поместить ячейки встроенных гидрогели (1,0 мл, 1.5 wt % гликоля хитозана, 4.0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 клеток мл -1) в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2) и измените средство каждый день. Подготовиться к визуализации ячейки на день 1, 3, 5 и 7, после инкапсуляции ячейки.
- Mix L929 клеточных суспензий (0,4 мл, 3,75 х 10 6 клеток мл -1) раствором хитозана гликоль (0,4 мл) в трубку (4,0 мл), вихревой. Пипетка L929/гликоль раствор хитозана (0,8 мл) в центр конфокальный Петри (диаметр 2,0 см). Пипетка DF PEG решения (0,2 мл) в том же блюдо и осторожно Пипетка mix решение и заставить Гидрогель образования.
- Для 3D клеток после культуры в гидрогели после инъекции, подготовить клеток загруженных гидрогеля (1,0 мл, шаг 2.2.2) в шприцах (10,0 мл, 48 G иглы). После форм гидрогеля медленно вдохнуть Гидрогель в чашке Петри для конфокальная томография. Добавьте дополнительное количество культуры средств массовой информации (1.0 мл) на вершине гидрогеля и менять его каждый день. Поставьте чашку Петри в инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2) и подготовить для визуализации потом.
Предупреждение: Пожалуйста, проверьте и следовать за безопасность операции протокола шприца.
- приготовления суспензии клеток
- Анализ жизнеспособности клеток
- конфокальная наблюдение
- Промыть гидрогели с PBS (1.0 мл) два раза. Пятно гидрогели флуоресцеин диацетат (FDA, 0,5 мл 0,05 мг/мл) и пропидий йодидом (PI, 0.5, 0,08 мг/мл) решения 15 мин. После окрашивания, удалите все растворители.
- Наблюдать гидрогели, используя конфокального микроскопа под возбуждения волны 488 нм и 543 Нм для визуализации жить и мертвые клетки, соответственно. Возьмите z стеки через каждые 2 мкм глубина гидрогелей для проверки равномерное распределение клеток на протяжении.
Примечание: FDA пятна живых клеток, в то время как Пи пятна отмершие клетки.
- Ухудшить гидрогеля (1.0 мл) с уксусной кислотой (HAc, 3 v %, 1.0 мл) на 5 мин и пипетки в трубку (4,0 мл). Собирать клетки, центрифуги (70 x g, 5 минут) и заново приостановить клеток в среде культуры клеток RPMI 1640 (1.0 мл). Выполняют клеток подсчета с помощью крови, считая Совет.
- конфокальная наблюдение
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематическое представление настоящего Протокола по подготовке гидрогеля и его использования в качестве 3D клеточной культуры предлагается на рисунке 1. В таблице 1приводится информация содержание и коэффициенты, приготовленные из различных механических сильные гидрогеля. Гидрогель самостоятельно обратимо и реологические свойства представляет гидрогеля жесткость модуль хранения против тест частоты на рисунке 2. Конфокальный изображения клетки и числа клеток с дней культуры в гидрогели представлены в рисунке 3, подтверждает жизнеспособность клеток и клеточной пролиферации через 3D клеточной культуры. Рисунок 4 представляет микроскопии, конфокальная изображений и анализ ставок распространения клеток клетки, встроенных в гидрогели, который страдал инъекций и после культуры. Жизнеспособность высокий клеток и клеточной пролиферации показывают, что клетки, встроенные в гидрогеля не разрушительный ущерб и может восстановить после культуры, указывающее injectability гидрогеля.
Рисунок 1 : Подготовка гидрогеля и его использования в качестве 3D клеточной культуры. (A) подготовка гидрогеля; (B) клетки подвеска подготовки; (C) 3D клеточной культуры в гидрогели, с или без инъекций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Жесткость гидрогеля. Хранения модуль G' по сравнению с частотой (A) оригинальный и самостоятельного исцеления гидрогели (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : 3D клеточной культуры в гидрогеля. (A) 3D конфокальных изображения L929 клеток, встроенные в жесткой силы гидрогеля (зеленый: живой клетки; Красный: мертвые клетки); (B) клеток подсчета результатов L929 клеток, встроенных в гидрогеля после инкапсуляции клеток обозначается время. Шкалы бар = 300 µm. данные, представленные как среднее ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : После 3D клеточной культуры в гидрогеля после инъекций. (A) A схематическое изображение после культуры клеток загруженных гидрогеля и инъекции. Вставка: Микроскопии изображений ячеек встроены в гидрогели до инъекции (слева) и после после культуры клеток для 7 дней (средний и правый). Шкалы бар = 100 мкм; (B) конфокальный изображения L929 клеток встроенных в жесткой силы гидрогеля и после искусственного после инъекции (зеленый: живой клетки; Красный: мертвые клетки), шкалы бар = 300 мкм; (C) A Сравнение темпов распространения клетки культивировали в гидрогели, с или без инъекций, после инкапсуляции. Данные, представленные как среднее ± SD. (адаптировано из ссылка12; Авторское право © 2017 Elsevier). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Гидрогель жесткость | Мягкий | Средний | Жесткая |
| Гликоль хитозана (мг) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF ПЭГ (мг) | 4.4 | 8.8 | 17,6 |
| Полимерные gelator содержание (wt %) | 1 | 2 | 4 |
| Деионизированная вода (мл) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| Gelaion время (мин) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * протестирована под частоты 6.3 rad s-1, штамм 1%, с использованием параллельной пластине (диаметр 20 мм) на вращения Реометр. |
Таблица 1: Информация гидрогели, приготовленные из различных механических сильные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гидрогель, представленные в настоящем Протоколе (рис. 1) имеет два основных компонента: Хитозан гликоль природный полимер и синтетических бензальдегида прекращено полимера gelator DF PEG, которые оба биосовместимых материалов. Синтез DF PEG представлены с использованием реакции модификации одношаговый. PEG молекулярной массой 4000 был выбран в этом протоколе проблемы растворимость, эффективность модификации, а также жесткость гидрогеля. Серия гидрогели с различных механических сильные были подготовлены с использованием различных твердых содержание и соотношения гликоль хитозана и DF КОЛЫШЕК. Однородной гидрогели быстро были сформированы в минутах, смешивая гелеобразования решения при комнатной температуре, хотя гелеобразования скорость может также замедлить, растворы. Реологические свойства теста использовалась для оценки механических сильные стороны различных гидрогели. Хранения модулей (G') этих гидрогелей были обнаружены приблизительно отличаются от 900 ПА (мягкие), 2100 ПА (средний) 4700 ПА (жесткая) (Таблица 1 и рис. 2A). Это привело к более высокой плотности сшивки, добавив больше полимера gelators в сети гидрогеля, что приводит к более высоких хранения модуля (большей жесткости). Свойство самостоятельно обратимо подтверждается также восстановления гидрогеля модуль (рис. 2B). Известно, что жесткость ECM, отличается для различных тканей, таким образом гидрогеля может предложить регулируемый механический подсказки и требованиям различных исследовательских разнообразный соотношения между гликоль хитозана и DF PEG полимера gelators18.
L929 клетки, линии клеток фибробластов обычно мышь с в естественных условиях окружающей среды ткани жесткость ~ 5600 ПА19, была использована в качестве модели клетки должен быть внедрен в гидрогеля. После инкапсуляции клеток в гидрогели, его можно легко заметить что клетки в гидрогели показали чрезвычайно высокой жизнеспособности (> 99%) на протяжении всего процесса культуры, подтверждающий отличная биосовместимость гидрогеля на основе хитозана. Значительное увеличение плотности клеток в гидрогеля подразумевает, что этот Гидрогель может поддержать пролиферации L929 клеток, даже без загородный Добавлено факторы роста (Рисунок 3А). После 7 дней в культуре в гидрогеля 300% (рис. 3B) увеличение числа клеток. Сообщается, что клетки культивировали в леса можно различать следующие механические сигналы20,21, который может подразумевать дальнейшие исследования, с помощью этого метода культуры 3D гидрогеля.
Имплантация клеток с инъекционными гидрогели приобрела несравненный преимущества значительно повысить эффективность поставок и жизнеспособности имплантированные клетки14. В рамках сети высокоструктурированные динамической иминного гидрогеля может self-heal после инъекции. Самостоятельно обратимо свойство позволяет Гидрогель для инъекций, который подразумевает потенциальных приложений для гидрогели как инъекционные несколько перевозчиков. Для дальнейшей оценки этот Гидрогель как носитель инъекционные ячейки, подражая инъекции и после культивирования эксперимент была выполнена. Гидрогель клетки встроенных была загружена в шприц и выдавливается через 48 G иглу в чашку Петри, после 7 день после культивирования процесса с ячейки жизнеспособность и распространения ставкой учился.
Как показано на рисунке 4A, сплющенные гидрогеля штук может self-heal реформы комплексной гидрогеля около 1 ч после инъекции, которая полезна в ячейке доставки. Для ячеек в гидрогеля когда по сравнению с изображения взял сразу после инкапсуляции (Рисунок 4A, левый Вставка), плотность ячеек, резко после 7 дней (Рисунок 4A, средняя Вставка). В расширенном видения, более подробный клеток fissional процесс, в котором находятся некоторые клетки должен быть разделен на два (рис. 4A, правый Вставка), непосредственно подтверждается 3D пролиферации в гидрогеля. Рисунок 4B показывает конфокальный изображения жить мертвых клеток анализов после инъекции и культуры после эксперимента. Плотность клеток вводили увеличилась очевидно с жизнеспособность высокой клеток (> 99%), демонстрируя успешное пролиферации в 3D гидрогеля после инъекции. Чтобы узнать, был ли инъекции влияют темпы распространения клеток, сравнение количественного статистического анализа для ставок распространения клеток в гидрогели, с или без инъекций выполнена (рис. 4 c). Уровень распространения клеток после инъекции, хотя несколько снизилось, остались в высокий уровень (~ 75%) и номер ячейки увеличились на 145% относительно после 7 дней в культуре в гидрогеля, указав, что усилие сдвига во время инъекции имеет наблюдаемый ограниченное негативное влияние на пролиферацию клеток.
Мы описали Типичная процедура применения гидрогеля, но исследователи могут изменить протокол в соответствии с требованиями конкретных исследований. Полимерные gelators имеют значительное влияние на гидрогеля и легко изменяемые. Например жесткость этот Гидрогель могут быть легко манипулировать различных соотношениях гликоль хитозана и DF PEG gelator. Между тем использование ПЭГ DF других молекулярных масс также может выполнить эту цель. Мы использовали PEG 4K в настоящем Протоколе, но может также работать PEG 2K до 10K. При использовании других колышки, важно контролировать время гелеобразования и жесткость специально. Другие функциональные полимерные gelators также могут работать, если исследователи имеют навыки синтеза для подготовки конкретных функциональных полимеров Бензойный альдегид прекращено17.
Этот протокол имеет ряд ограничений. Во-первых из-за динамической структуры, жесткость этот Гидрогель ограничен по сравнению с ковалентной связи высокоструктурированные гидрогеля. Один могут возникать сбои подготовить гидрогели с слишком высокий модуль упругости конструкции. Во-вторых этот Гидрогель био разложению, ограничивая таким образом долгосрочные клеточной культуры в рамках гидрогеля. В-третьих гидрогеля предлагает 3D высокоструктурированные культивирования среды, которая имеет проблемы распространения. На сегодняшний день, большинство из био анализы основаны на 2D культуры. 3D структура может помешать дальнейшему клеток, связанных в vivo исследований.
При использовании данного протокола, существует несколько важных шагов, чтобы следовать. Во-первых во время синтеза полимеров gelator DF PEG, обезвоживание очень важно. Во-вторых при выполнении процедуры, связанные с клеток, стерильные операция имеет решающее значение. В-третьих окрашивание время следует хорошо контролируется в гидрогели получить хороший конфокальный изображения.
Таким образом протокол представил снисходительный подготовка инъекционные гидрогели на основе хитозана, которые применяются в качестве платформы для 3D клеточной культуры и могли бы предложить регулируемый механический подсказки для различных исследований. Она уже применялась в областях, касающихся доставки лекарств, клеточной терапии и химиотерапии опухоль, которая не только является свидетельством ее производительность, но также увеличивает свой потенциал для биомедицинских apзаявки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано национальной науки фонд Китая (21474057 и 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
