Summary
Her beskriver vi en lettvinte forberedelse av chitosan-baserte injiserbare hydrogels ved hjelp av dynamisk imine kjemi. Metoder for å justere den hydrogel mekanisk styrke og dens anvendelse i 3D cellekultur presenteres.
Abstract
Protokollen presenterer en lettvinte, effektiv og allsidig metode for å forberede chitosan-basert hydrogels med dynamisk imine kjemi. Hydrogel forberedt ved å blande glykol chitosan løsninger med en syntetisk benzaldehyde avsluttet polymer gelator, og hydrogels er effektivt oppnådd i flere minutter ved romtemperatur. Av varierende forhold mellom glykol chitosan, polymer gelator og vann innholdet hentes allsidig hydrogels med forskjellige gelation ganger og stivhet. Når skadet, kan hydrogel gjenopprette sine opptredener og modulus, på grunn av Reversibilitet av dynamisk imine obligasjoner som crosslinkages. Selv healable egenskapen kan hydrogel skal injiserbare siden det kan være selvstendig helbredet fra presset stykker til en integrert bulk hydrogel etter injeksjon prosessen. Hydrogel er også flere forståelsesfull å mange bio-aktive stimuli på grunn av ulike balanse statuser av dynamisk imine obligasjoner. Denne hydrogel bekreftet som bio-kompatibel, og L929 musen fibroblast celler var innebygd følgende standard prosedyrer og celle spredning ble lett vurdert av en 3D-cellen dyrking prosess. Hydrogel kan tilby en justerbar plattform for forskjellige forskning der en fysiologisk etterligne av et 3D-miljø for cellene er profittert. Sammen med flere forståelsesfull, selv healable og injiserbare egenskaper, kan hydrogels potensielt brukes som flere operatører for narkotika og celler i fremtidige bio-medisinske anvendelser.
Introduction
Hydrogels er krysskoblet polymer materiale med store mengder vann og myk mekaniske egenskaper, og de har vært brukt i mange bio-medisinske programmer1,2. Hydrogels kan tilby en myk og våt miljø, som er svært lik fysiologiske omgivelsene for celler i vivo. Derfor har hydrogels blitt en av de mest populære stillasene for 3D celle kultur3,4. Sammenlignet med 2D Petriskål cellekultur, har 3D cellekultur avansert raskt for å tilby en ekstracellulær matrix (EFM) etterlignet microenvironment for cellene å kontakte og montere spredning og differensiering formål5. I tillegg kunne hydrogels som inneholder naturlige polymerer tilby bio-kompatibel og fremme miljøer for cellene til spredning og differensiere3. Hydrogels avledet fra syntetiske polymerer foretrekkes for sin enkle og klare komponenter, noe som utelukker komplekse påvirkninger som dyr opprinnelse proteiner eller virus. Blant alle hydrogel kandidater for 3D cellekultur er hydrogels som er lett forberedt og har en konsekvent eiendom alltid foretrukket. Anlegget å justere den hydrogel egenskaper tilpasses ulike forskning kravene er viktig som godt6.
Her introduserer vi en lettvinte forberedelse av en glykol chitosan-baserte hydrogel bruker dynamiske imine kjemi, som blir en allsidig hydrogel plattform for 3D celle kultur7. I denne metoden brukes kjente bio-kompatible glykol chitosan å etablere rammene av hydrogel's nettverk. Dens amino grupper er reagerte med en benzaldehyde avsluttet polyetylenglykol som polymer gelator til dynamisk imine obligasjoner som crosslinkages av hydrogels8. Dynamisk imine obligasjoner kan danne og råtne reversibel og fleksibelt omgivelser, endowing hydrogels med mekanisk justerbar krysskoblet nettverk9,10,11. På grunn av sin høye vann innholdet, bio-kompatible materialer og justerbar mekaniske styrken, er hydrogel brukt som et stillas for L929 celler i 3D celle kultur12,13. Protokollen her detaljer prosedyrer, inkludert polymer gelator syntese, hydrogel forberedelse, celle innebygging og 3D celle dyrking.
Hydrogel viser også flere andre funksjoner på grunn av sin dynamiske imine crosslinkages, inkludert dens flere mottagelig for ulike bio-stimuli (syre/pH, vitamin B6 avledede pyridoxal, protein papain, etc.), som indikerer at hydrogel kunne indusert oppløse under fysiologiske forhold8. Hydrogel er også selv healable og injiserbare, som betyr hydrogel kunne administreres via en minimal invasiv injeksjon metode og få en fordel i narkotika og celle leveranser14,15. Legge til funksjonelle tilsetningsstoffer eller bestemte forhåndsutformede polymer gelators, hydrogel er forenlig å få bestemte egenskaper som magnetiske, temperatur, pH forståelsesfull, etc.16,17, som kan oppfylle en stort utvalg av forskning krav. Disse egenskapene avsløre den hydrogel potensiell kapasitet til å være en injectable flere operatører for narkotika og celler i både i vitro og i vivo bio-medisinsk forskning og programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
forsiktig: ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablader (MSDS) før bruk. Bruk riktige sikkerhets praksis når kjemi eksperimenter, inkludert bruk av en avtrekksvifte og personlig verneutstyr (vernebriller, vernehansker, laboratoriefrakk, etc.). Protokollen krever standard celle håndtering teknikker (sterilisering celle utvinning celle passaging, celle frysing, celle flekker, etc.).
1. forberedelse av Hydrogels
- syntese av benzaldehyde avsluttet di-functionalized polyetylenglykol (DF PEG)
- før uttørking av PEG polymer
- veie 4.00 g pinne (MW 4000, 1.00 mmol) overføre den til en rund bunn kolbe (250 mL), og legge toluen (100 mL).
Merk: Andre plugger med ulike molekylvekt kan arbeide for hydrogel dannelsen men vil føre til ulike stivhet. - Varme løsningen av en varmepistol (eller en varm plate rundt 40 ° C) mildt å hjelpe oppløse alle polymerer. Når alle polymerer oppløsning, kan du bruke en fordamperen fjerne alle løsemidler. Gjenta dette oppløses og tørr prosessen to ganger å tørket PINNEN polymerer.
Advarsel: Dette bør utføres i avtrekksvifte med ekstrem forsiktighet. Toluen er brannfarlig.
- veie 4.00 g pinne (MW 4000, 1.00 mmol) overføre den til en rund bunn kolbe (250 mL), og legge toluen (100 mL).
- Benzaldehyde oppsigelse reaksjon av PINNEN
- legge til en magnetisk rørestang og tetrahydrofuran (THF, 100 mL) kolbe og oppløse PEG bruker en rørestang. Legge til 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) og 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0,6 mmol) sekvensielt i løsninger å oppløse alle faste stoffer helt.
- Legg til N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) løsningen, og legge et tørking rør som er fylt med vannfri CaCl 2 til kolbe. Holde reaksjonen under omrøring ved romtemperatur (~ 20 ° C) for rundt 12 h.
- Etter reaksjon prosess
- filtrerer de hvite genereres faste stoffer i løsningen av vakuum etter reaksjonen er fullført. Hell løsningen i kalde diethyl Eter (500 mL) under stirring å utløse hvit faste stoffer. Samle alle hvite faste stoffer av filteret og tørr faste stoffer i avtrekksvifte.
- Oppløses hvit faste stoffer i THF igjen, filtrere ut noen uløselig hvit faste stoffer, hell løsningen i frisk kaldt diethyl Eter å utløse hvit faste stoffer og tørk den. Gjenta denne prosessen to til tre ganger, og Plasser de hvite tørrstoff i en vakuumtørking ovn (20 ° C, 0,1 mbar) tørke dem helt. Samle hvitt pulver som det endelige produktet: benzaldehyde avsluttet DF PEG.
- før uttørking av PEG polymer
- Utarbeidelse av hydrogels
- veie forskjellige mengder DF pinne (0,11 g, 0.028 mmol, 0.22 g, 0.055 mmol, 0.44 g, 0.110 mmol) i et rør (10 mL), legge deionisert vann (5.0 mL) og bruke en vortex eller magnetisk rørestang for å hjelpe oppløse polymer.
- Oppløse glykol chitosan (0.495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) i deionisert vann (15,0 mL) i et rør (50 mL), og bruk en vortex i noen minutter til homogenize kitosan løsning (3 wt %).
- Legge glycol kitosan løsning (0,2 mL, 3 wt %) og DF PEG løsninger (0,2 mL) sekvensielt i et rør (2.0 mL). Bruk en vortex for å blande løsningene homogent på skjemaet hydrogels i flere minutter. Følg prosenter i tabell 1 for å få hydrogels av ulike mekaniske styrken.
Merk: Bruk metoden tube-snu for å avgjøre om hydrogel har allerede dannet.
- Reologi analyser
- utføre Reologi analyser på en roterende rheometer med en parallell stålplater (diameter: 20 mm). For gelation testen, spredt glykol kitosan løsning (0,2 mL, 3 wt %) på en lavere plate. Deretter legge DF PEG vandige løsninger (0,2 mL, 2 wt %) jevnt dropwise på kitosan løsning overflaten og bland med en pipette raskt. Lavere ned øvre plate og begynne å teste
- For hydrogel ' s stivhet test, kuttet en hydrogel i en sirkel (diameter: 20 mm) og måle lagring modulus (G ') verdier versus frekvens analyser på 1% belastning. Typisk G ' verdier på 6,3 rad s − 1 er oppført i tabell 1.
Merk: Utføre Reologi analyser av hydrogel 0,5 h etter hydrogel dannelsen å sikre dynamiske bond stabilisering av hydrogel. - For hydrogel ' s selv healable eiendom teste, skåret en hydrogel i stykker og samle bitene sammen til self-heal til en integrert brikke. Deretter klipp hydrogel for å gjøre en sirkel (diameter: 20 mm) og sette den på rheometer å foreta forholdsmessighetsvurderingen Reologi.
2. 3D celle dyrking i Hydrogels
- utarbeidelse av hydrogel gelation løsninger
- veie DF pinne (0.44 g, 0,11 mmol) i et sterilt rør (4.0 mL), legge til i celle kultur medier (RPMI-1640, 2.0 mL), og bruke en vortex eller rørestang til å oppløse polymer for å få polymer løsning (20 wt %). Laste løsningen i en sprøyte (10,0 mL) og deretter steriliseres ved å passere det gjennom et mikron bakterier-retentive filter (0.22 µm).
- Veier glykol chitosan (0.165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) i et sterilt rør (15,0 mL), legge til i celle kultur medier (RPMI-1640, 4.0 mL) og vortex å oppløse polymer for å få glykol kitosan løsning (4.0 wt %). Laste løsningen i en sprøyte (10,0 mL) og filter med filtere 0.22 µm bakterier-retentive.
- Celle dyrking i hydrogels
Advarsel: utføre alle celle prosedyrene i vev kultur hette. Grunnleggende kunnskap om steril teknikk er forventet.- Utarbeidelse av cellen suspensjon
- kultur L929 celler i RPMI-1640 medium med 10% FBS, 5% penicillin (10 mL) i en Petri rett (diameter 10 cm), og Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2. Endre mediet hver dag før bruk.
- Høste L929 cellene med PBS inneholder trypsin (0.025 w/v %) og EDTA (0,01% w/v), deretter sentrifuge (70 x g, 5 min) og å suspendere cellene i RPMI-1640 mediet (1,0 mL). Utføre celle tellingen bruker standard operasjonen av blod-telling. Nytt suspendere cellene justeres til celle konsentrasjonen til ~ 3.75 × 10 6 celler/mL.
- Celle-innkapsling i hydrogels
- omgås glykol kitosan løsning (0,4 mL) i et rør (4.0 mL) av vortex L929 celle suspensjoner (0,4 mL, 3,75 x 10 6 celler mL -1). Pipetter L929/glykol kitosan løsning (0,8 mL) i midten av en AC confocal Petriskål (diameter 2.0 cm). Pipetter DF PEG løsninger (0,2 mL) i samme retten og Pipetter forsiktig å blande løsningen og skape hydrogel.
Merk: Vurdere hydrogel dannelsen ved å vippe Petriskål. - For direkte cellekultur, legge ekstra mengder RPMI-1640 kultur medier (1,0 mL) på hydrogel. Sett celle innebygd hydrogels (1,0 mL, 1,5 wt % glykol chitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 celler mL -1) i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) og endre mediet hver dag. Forberede celle bildebehandling på dag 1, 3, 5 og 7 etter celle innkapsling.
- omgås glykol kitosan løsning (0,4 mL) i et rør (4.0 mL) av vortex L929 celle suspensjoner (0,4 mL, 3,75 x 10 6 celler mL -1). Pipetter L929/glykol kitosan løsning (0,8 mL) i midten av en AC confocal Petriskål (diameter 2.0 cm). Pipetter DF PEG løsninger (0,2 mL) i samme retten og Pipetter forsiktig å blande løsningen og skape hydrogel.
- For 3D-cellen etter kulturen i hydrogels etter injeksjon, forberede celle lastet hydrogel (1,0 mL, se trinn 2.2.2) i en sprøyte (10,0 mL, 48 G p). Etter hydrogel former, injisere hydrogel sakte i en Petriskål for AC confocal bildebehandling. Legge til et ekstra beløp på kultur medier (1,0 mL) på hydrogel og endre den hver dag. Petriskål innlegge en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) og forberede seg for tenkelig etterpå.
FORSIKTIG: Kontroller og følger sikkerhet drift protokollen av sprøyte.
- Utarbeidelse av cellen suspensjon
- Celle levedyktighet analyse
- AC Confocal observasjon
- Skyll hydrogels med PBS (1,0 mL) for to ganger. Flekk hydrogels med Fluorescein diacetate (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) og propidium iodide (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) løsninger i 15 min. Etter fjerne alle løsemidlene.
- Observere hydrogels ved hjelp av en AC confocal mikroskop under eksitasjon bølgelengder av 488 nm og 543 nm å visualisere live og døde celler, henholdsvis. Ta z-stabler gjennom hver 2 µm dybdeskarphet hydrogels å validere en jevn distribusjon av celler i hele.
Merk: FDA flekker lever celler mens PI flekker døde celler.
- Forringes hydrogel (1,0 mL) med eddiksyre (HAc, 3 v %, 1,0 mL) for 5 min og Pipetter til en tube (4.0 mL). Samle celler av sentrifuger (70 x g, 5 min) og å suspendere cellene i RPMI-1640 celle kultur medium (1,0 mL). Utføre celle teller med blod teller styret.
- AC Confocal observasjon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk fremstilling av denne protokollen på hydrogel forberedelse og dens bruk som 3D cellekultur tilbys i figur 1. Informasjon i hydrogel innholdet og forhold med ulike mekaniske styrken summeres i tabell 1. Hydrogel er selv healable og Reologi egenskapen presenterer den hydrogel stivhet lagring modulus versus frekvensen test i figur 2. Cellen AC confocal bilder og celle tall med dager av kulturen i hydrogels presenteres i Figur 3bekrefter celle levedyktighet og celle spredning via 3D cellekultur. Figur 4 presenterer mikroskopi, AC confocal bilder og analyse av celle spredning priser for cellene i hydrogels som LED injeksjon og etter kultur. Høyt levedyktighet og celle spredning viser at cellene i hydrogel LED ingen ødeleggende skade og kan gjenopprette ved etter kultur, indikerer hydrogel's injectability.
Figur 1 : Utarbeidelse av hydrogel og dens bruk som 3D cellekultur. (A) Hydrogel forberedelse; (B) celle suspensjon forberedelse; (C) 3D cellekultur i hydrogels med eller uten injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Hydrogel stivhet. Lagring modulus G' versus frekvensen av (A) original og (B) selv helbredet hydrogels. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : 3D cellekultur i hydrogel. (A) 3D AC confocal bilder av L929 celler innebygd i stiv styrke hydrogel (grønn: live celler. Rød: død celler); (B) cellen teller resultatene av L929 celler innebygd i hydrogel etter celle innkapsling betegnet samtidig. Skala bar = 300 µm. Data som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : 3D celle etter kultur i hydrogel etter injeksjon. (A) A skjematisk bilde av injeksjon og etter kultur i en celle-lastet hydrogel. Sett inn: Mikroskopi bilder av celler innebygd i hydrogels før injeksjon (venstre) og etter celle etter kultur i 7 dager (midten og høyre). Skala bar = 100 µm; (B) AC Confocal bilder av L929 celler innebygd i en stiv styrke hydrogel og post kultivert etter injeksjon (grønn: live celler. Rød: død celler), Scale bar = 300 µm; (C) en sammenligning av spredning antall celler kultivert i hydrogels med eller uten injeksjon etter innkapsling. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SD. (tilpasset fra referanse12; Copyright © 2017 Elsevier). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Hydrogel stivhet | Myk | Middels | Stiv |
| Glykol chitosan (mg) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF pinne (mg) | 4.4 | 8.8 | 17,6 |
| Polymer gelator innhold (wt %) | 1 | 2 | 4 |
| Deionisert vann (mL) | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Gelaion tid (min) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * testet under frekvens 6,3 rad s-1, press på 1% med en parallell plate (diameter 20 mm) på en roterende rheometer. |
Tabell 1: Informasjon av hydrogels med ulike mekaniske styrken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydrogel presentert i denne protokollen (figur 1) har to hovedkomponenter: naturlige polymer glykol chitosan og en syntetisk benzaldehyde avsluttet polymer gelator DF pinne, som er både biokompatible materialer. Syntese av DF PEG er presentert ved hjelp av en ettrinns endring reaksjon. PEG av molekylvekt 4000 ble valgt i denne protokollen i bekymringene til løselighet, modifikasjon effektivitet, samt hydrogel stivhet. En rekke hydrogels med forskjellige mekanisk styrke var forberedt med forskjellige solide innholdet og prosenter av glykol chitosan og DF pinne. Homogen hydrogels ble raskt dannet i minutter ved å blande gelation løsninger under romtemperatur, men gelation hastigheten kan også avta ved å fortynne løsninger. Reologi testen var ansatt å evaluere mekaniske styrken av ulike hydrogels. Lagring moduli (G') av disse hydrogels ble funnet ca forskjellig fra 900 Pa (myk), 2.100 Pa (middels) til 4700 Pa (stiv) (tabell 1 og figur 2A). Dette bidro til høyere crosslinking tettheten ved å legge mer polymer gelators i hydrogel nettverket, noe som resulterer i høyere lagring modulus (større stivhet). Selv healable eiendommen er også bekreftet av utvinning av den hydrogel modulus (figur 2B). Det er kjent at ECM stivhet er forskjellig for ulike vev, dermed hydrogel kunne tilby justerbar mekanisk signaler og annen forskning kravene av ulike prosenter mellom glykol chitosan og DF PEG polymer gelators18.
L929 celler, en typisk musen fibroblast celle linje med i vivo miljø vev stivhet av ~ 5600 pa19, ble brukt som en celle modell å være innebygd i hydrogel. Etter celle innkapsling i hydrogels, det kan lett observeres at cellene i hydrogels viste ekstremt høy levedyktighet (> 99%) gjennom kultur prosessen, bekrefter utmerket biokompatibilitet av chitosan-baserte hydrogel. En bemerkelsesverdig økning av cellen i hydrogel underforstått at denne hydrogel kunne støtte spredning av L929 cellene selv uten ekstra-lagt vekst faktorer (figur 3A). Etter 7 dager i kulturen i hydrogel økt celle 300% (figur 3B). Det er rapportert at celler dyrket i stillaser kunne skille etter mekanisk signaler20,21, som kan innebære videre forskning denne 3D hydrogel kultur metoden.
Implanting celler med injiserbare hydrogels har fått enestående fordeler for å øke levering effektivitet og levedyktigheten til de implanterte celler14. Innenfor et dynamisk imine krysskoblet nettverk kan hydrogel self-heal etter injeksjon. Egenskapen selv healable kan hydrogel skal injiserbare, som innebærer mulige programmer for hydrogels som injiserbare flere operatører. For å ytterligere evaluere dette hydrogel som en injeksjon celle carrier, ble en injeksjon-mimicking og post dyrking eksperiment utført. Cellen innebygd hydrogel var lastet i en sprøyte og presset ut gjennom en 48 G nål i en Petriskål, etterfulgt av en 7 dagers post dyrking prosessen med levedyktighet og spredning cellehastighet studerte.
Som vist i figur 4A, kunne squished hydrogel stykker self-heal å reformere en integrert hydrogel ca 1 time etter injeksjon, noe som er nyttig i cellen levering. Sammenlignet med for cellene i hydrogel tok det bildet bare etter innkapsling (figur 4A, venstre sett inn), cellen tetthet økt dramatisk etter 7 dager (figur 4A, midterste sett inn). I utvidet visjon, en mer detaljert celle-fissional prosess der noen celler er funnet å bli delt i to (figur 4A, høyre sett inn), direkte bekreftet av 3D celle spredning i hydrogel. Figur 4B viser AC confocal bilder av live-død celle analyser etter injeksjon og etter kultur eksperiment. Tettheten av injisert cellene økt åpenbart med en høyt levedyktighet (> 99%), demonstrere vellykket celle spredning i 3D hydrogel etter injeksjon. Lære om injeksjon berørt celle spredning hastigheten, en sammenligning av kvantitative statistikk analyse for celle spredning priser i hydrogels med eller uten injeksjon ble utført (figur 4C). Spredning cellehastighet etter injeksjon, forble men litt redusert, i høy (~ 75%), og cellen antall økte 145% relativt etter 7 dager kultur i hydrogel, indikerer at klipping under injeksjon har en observerbare begrenset negativ innvirkning på celle spredning.
Vi beskrev en vanlig prosedyre av hydrogel programmet men forskere kan endre protokollen for å passe bestemte forskning krav. Polymer gelators har betydelig innflytelse på hydrogel og kan enkelt endres. For eksempel kan stivhet av denne hydrogel lett manipuleres av ulike forhold av glykol chitosan og DF pinne gelator. I mellomtiden kan bruk DF pinne av andre molekylvekt også oppfylle dette målet. Vi brukte pinne 4K i denne protokollen, men pinne 2K til 10K fungerer også. Når du bruker andre plugger, er det viktig å overvåke gelation tid og stivhet spesielt. Andre funksjonelle polymer gelators kan også fungere hvis forskerne har syntese ferdigheter å forberede bestemt funksjonelle benzaldehyde slutter polymerer17.
Denne protokollen har flere begrensninger. For det første fordi dynamiske strukturen er stivhet av denne hydrogel begrenset sammenlignet med en kovalent binding krysskoblet hydrogel. Man kan støte på feil å forberede hydrogels med for høy modulus design. Dernest er denne hydrogel bio-nedbrytbar, dermed begrense den langsiktige celle kulturen innen hydrogel. For det tredje, hydrogel tilbyr et 3D krysskoblet dyrking miljø som har diffusjon bekymringer. Hittil basert mest bio-analyser på 2D kultur. 3D strukturen kan hindre ytterligere celle i vivo studier.
Når du bruker denne protokollen, er det flere viktige trinn å følge. Først under syntese av polymer gelator DF PEG er dehydration svært viktig. For det andre, når du utfører celle-relaterte prosedyrer, sterile operasjonen er kritiske. For det tredje bør flekker tiden være godt kontrollert i hydrogels å få fine AC confocal bilder.
Oppsummert introdusert protokollen en lettvinte forberedelse av chitosan-baserte injiserbare hydrogels, som brukes som en plattform for 3D cellekultur og kan tilby justerbar mekanisk signaler for ulike undersøkelser. Det er allerede brukt i områder om narkotika-leveranser, cellen terapi og kjemoterapi svulst, som ikke bare er et testament til ytelsen, men også øker sitt potensial for biomedisinsk applications.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation of China (21474057 og 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S.
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
