Beredning av kitosan-baserat injicerbara Hydrogels och dess tillämpning i 3D cellodling
Summary
Här beskriver vi en lättköpt beredning av kitosan-baserat injicerbara hydrogels använder dynamisk Imin kemi. Metoder för att justera den hydrogel mekanisk styrka och dess tillämpning i 3D cellodling presenteras.
Abstract
Det presenteras en lättköpt, effektiv och mångsidig metod för att förbereda chitosan-baserade hydrogels använder dynamisk Imin kemi i protokollet. Hydrogel är beredd genom att blanda lösningar av glykol chitosan med en syntetiserade bensaldehyd avslutas polymer gelator och hydrogels erhålls effektivt i flera minuter vid rumstemperatur. Genom olika nyckeltal mellan glykol kitosan, polymeren gelator och vatteninnehåll erhålls mångsidig hydrogels med olika gelation gånger och stelhet. När skadade, kan hydrogel återställa sina framträdanden och modulus, på grund av reversibilitet av dynamiska Imin obligationer som crosslinkages. Denna själv healable egenskap kan hydrogel vara injicerbara eftersom det kan vara själv helade från pressade bitar till en integrerad bulk hydrogel efter injektionsprocessen. Hydrogel är också flera lyhörd för många bio-aktiva stimuli på grund av olika Jämviktstiden statusen för obligationerna som dynamiska Imin. Detta hydrogel bekräftades som bio-kompatibel, och L929 mus fibroblast celler var inbäddade följande standardförfaranden och cellproliferation bedömdes enkelt genom en 3D cell odling process. Hydrogel kan erbjuda en justerbar plattform för olika forskning där en fysiologisk härma en 3D miljö för celler är gagnade. Tillsammans med dess flera lyhörd, själv healable och injicerbara egenskaper, kan hydrogels potentiellt tillämpas som flera bärare för droger och celler i framtida bio-medicinska tillämpningar.
Introduction
Hydrogeler är tvärbundna polymermaterial med stora mängder vatten och mjuk mekaniska egenskaper, och de har använts i många bio-medicinska applikationer1,2. Hydrogels kan erbjuda en mjuk och fuktig miljö, som är mycket lik de fysiologiska omgivningarna för celler i vivo. Hydrogeler har därför blivit en av de mest populära ställningar för 3D cell kultur3,4. Jämfört med 2D petriskål cellkultur, har 3D cellkultur avancerade snabbt för att erbjuda en extracellulär matrix (ECM) härmade närmiljön för celler att kontakta och montera för proliferation och differentiering ändamål5. Hydrogeler innehållande naturliga polymerer kan dessutom erbjuda biokompatibla och främja miljöer för celler för att föröka sig och differentiera3. Hydrogeler härrör från syntetiska polymerer är att föredra för sin enkla och tydliga komponenter, som utesluter komplexa influenser som djur-ursprung proteiner eller virus. Bland alla hydrogel kandidater för 3D cellkultur föredras alltid hydrogels som tillagas enkelt och har en konsekvent egendom. Möjlighet att justera den hydrogel egenskaper för att passa olika forskningsbehov är viktigt som väl6.
Här presenterar vi en lättköpt beredning av en glykol chitosan-baserade hydrogel med hjälp av dynamiska Imin kemi, som blir en mångsidig hydrogel plattform för 3D cell kultur7. Den här metoden används välkända biokompatibla glykol chitosan att upprätta ramar av hydrogel’s nätverk. Dess amino grupper är reagerade med en bensaldehyd avslutas polyetylenglykol som den polymer gelator forma dynamiska Imin band som crosslinkages av hydrogels8. Dynamiska Imin obligationer kan bilda och förmultnar reversibelt och responsivt till omgivning, förse hydrogels med mekaniskt justerbar tvärbundna nätverk9,10,11. På grund av dess höga vatteninnehåll, biokompatibla material och justerbara mekaniska styrka används framgångsrikt av hydrogel som en byggnadsställning för L929 celler i 3D cell kultur12,13. Protokollet här specificerar de förfaranden, inklusive gelator polymersyntes, hydrogel förberedelse, cell inbäddning och 3D cell odling.
Hydrogel visar också flera andra funktioner på grund av dess dynamiska Imin crosslinkages, inklusive dess flera lyhörd för olika bio-stimuli (syra/pH, vitamin B6 härledda pyridoxal, protein papain, etc.), vilket indikerar att hydrogel inducerad sönderdelas under fysiologiska betingelser8. Hydrogel är också själv healable och injicerbara, vilket innebär hydrogel kan administreras via en minimal invasiv injektion metod och få en fördel i drog- och cell leveranser14,15. Genom att lägga till funktionella tillsatser eller specifika fördesignade polymer gelators, hydrogel är kompatibel att få specifika egenskaper som magnetiska, temperatur, pH lyhörd, etc.16,17, som kunde fullgöra en brett utbud av forskningsbehov. Dessa egenskaper avslöjar den hydrogel potentiella förmågan att vara ett injicerbart flera bärare för droger och celler i både in vitro och i vivo biomedicinsk forskning och tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den hydrogel som presenteras i detta protokoll (figur 1) har två huvudkomponenter: den naturliga polymeren glykol chitosan och en syntetisk bensaldehyd avslutas polymer gelator DF PEG, som är både biokompatibla material. Syntesen av DF PEG presenteras med hjälp av en one-step modifiering reaktion. PEG med molekylvikt 4,000 valdes detta protokoll i oro löslighet, modifiering effektivitet, samt hydrogel stelhet. En rad hydrogels med olika mekaniska styrkor var förberedda med olika fast i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av National Science Foundation av Kina (21474057 och 21604076).
Materials
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
